İmmünomodülatör metabolitler, tümör mikroortamının (TME) önemli bir özelliğidir, ancak birkaç istisna dışında, kimlikleri büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, bu farklı TME bölümlerinin metabolomunu ortaya çıkarmak için yüksek dereceli seröz karsinom (HGSC) hastalarının tümörlerinden ve asit sıvısından alınan tümörleri ve T hücrelerini analiz ettik. Asit sıvısı ve tümör hücreleri, kapsamlı metabolit farklılıklarına sahiptir. Asit sıvısıyla karşılaştırıldığında, tümöre sızan T hücreleri, 1-metilnikotinamid (MNA) açısından önemli ölçüde zenginleşmiştir. T hücrelerindeki MNA seviyesi yüksek olmasına rağmen, nikotinamid N-metiltransferaz (S-adenozilmetiyoninden nikotinamite metil gruplarının transferini katalize eden bir enzim) ifadesi fibroblastlar ve tümör hücreleriyle sınırlıdır. Fonksiyonel olarak, MNA, T hücrelerini tümör gelişimini destekleyen sitokin tümör nekroz faktörü alfa salgılamaya teşvik eder. Bu nedenle, TME kaynaklı MNA, T hücrelerinin immün regülasyonuna katkıda bulunur ve insan kanserinin tedavisi için potansiyel bir immünoterapi hedefi oluşturur.
Tümörden türetilen metabolitler, anti-tümör bağışıklığı üzerinde derin bir inhibitör etkiye sahip olabilir ve giderek artan kanıtlar, bunların hastalık ilerlemesi için de önemli bir itici güç olarak hizmet edebileceğini göstermektedir (1). Warburg etkisine ek olarak, son çalışmalar tümör hücrelerinin metabolik durumunu ve bunun tümör mikroortamının (TME) bağışıklık durumuyla ilişkisini karakterize etmeye başlamıştır. Fare modelleri ve insan T hücreleri üzerinde yapılan çalışmalar, glutamin metabolizmasının (2), oksidatif metabolizmanın (3) ve glikoz metabolizmasının (4) çeşitli bağışıklık hücresi alt grupları üzerinde bağımsız olarak etki edebileceğini göstermiştir. Bu yollardaki çeşitli metabolitler, T hücrelerinin anti-tümör fonksiyonunu inhibe eder. Koenzim tetrahidrobiopterinin (BH4) blokajının T hücrelerinin proliferasyonuna zarar verebileceği ve vücuttaki BH4 artışının CD4 ve CD8 aracılığıyla anti-tümör bağışıklık yanıtını artırabileceği kanıtlanmıştır. Ayrıca, kynureninin immünosupresif etkisi BH4 verilmesiyle kurtarılabilir (5). İzositrat dehidrogenaz (IDH) mutant glioblastomda, enantiometabolik (R)-2-hidroksiglutarat (R-2-HG) salgılanması T hücre aktivasyonunu, proliferasyonunu ve sitoliz aktivitesini inhibe eder (6). Son zamanlarda, glikolizin bir yan ürünü olan metilglioksalin miyeloid kökenli baskılayıcı hücreler tarafından üretildiği ve T hücrelerinin metilglioksal transferinin efektör T hücre fonksiyonunu inhibe edebileceği gösterilmiştir. Tedavide, metilglioksalin nötralizasyonu miyeloid kökenli baskılayıcı hücrelerin (MDSC) aktivitesinin üstesinden gelebilir ve fare modellerinde kontrol noktası blokaj tedavisini sinerjik olarak artırabilir (7). Bu çalışmalar topluca, TME kaynaklı metabolitlerin T hücre fonksiyonu ve aktivitesinin düzenlenmesindeki kilit rolünü vurgulamaktadır.
T hücre disfonksiyonunun yumurtalık kanserinde yaygın olarak rapor edildiği görülmüştür (8). Bu kısmen hipoksi ve anormal tümör vaskülatürünün doğasında bulunan metabolik özelliklerden kaynaklanmaktadır (9), bu da glikoz ve triptofanın laktik asit ve kynurenin gibi yan ürünlere dönüşmesine neden olur. Aşırı hücre dışı laktat, interferon-γ (IFN-γ) üretimini azaltır ve miyelosupresif alt grupların farklılaşmasını sağlar (10, 11). Triptofan tüketimi, T hücre proliferasyonunu doğrudan inhibe eder ve T hücre reseptör sinyalini engeller (12-14). Bu gözlemlere rağmen, immün metabolizma ile ilgili birçok çalışma, optimize edilmiş ortamlar kullanılarak in vitro T hücre kültüründe veya in vivo homolog fare modelleriyle sınırlı olarak gerçekleştirilmiştir; bunların hiçbiri insan kanserlerinin ve fizyolojik makro ve mikro ortamın heterojenliğini tam olarak yansıtmaz.
Yumurtalık kanserinin ortak bir özelliği periton yayılımı ve asit oluşumudur. Asitte hücre sıvısının birikmesi, ilerlemiş hastalık ve kötü prognozla ilişkilidir (15). Raporlara göre, bu eşsiz bölme hipoksiktir, yüksek düzeyde vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve indolamin 2,3-dioksigenaz (IDO) içerir ve T düzenleyici hücreler ve miyeloid inhibitör hücreler tarafından istila edilir (15-18). Asitin metabolik ortamı, tümörün kendisininkinden farklı olabilir, bu nedenle periton boşluğunda T hücrelerinin yeniden programlanması belirsizdir. Ek olarak, asit ve tümör ortamında bulunan metabolitler arasındaki temel farklılıklar ve heterojenlik, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu ve tümörler üzerindeki işlevlerini engelleyebilir ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Bu sorunları çözmek için, farklı hücre tiplerini (CD4+ ve CD8+ T hücreleri dahil) ve tümörler içindeki ve arasındaki metabolitleri incelemek üzere hassas bir hücre ayırma ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) yöntemi tasarladık. Bu yöntem, hastanın aynı asit sıvısı ve tümör ortamındaki hücreleri kapsar. Bu yöntemi, bu önemli popülasyonların metabolik durumunun yüksek çözünürlüklü bir portresini sağlamak için yüksek boyutlu akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizilemesi (scRNA-seq) ile birlikte kullanıyoruz. Bu yöntem, tümör T hücrelerinde 1-metilnikotinamid (MNA) seviyesinde önemli bir artış ortaya koydu ve in vitro deneyler, MNA'nın T hücresi fonksiyonu üzerindeki immünomodülatör etkisinin daha önce bilinmediğini gösterdi. Genel olarak, bu yöntem tümörler ve bağışıklık hücreleri arasındaki karşılıklı metabolik etkileşimleri ortaya çıkarır ve T hücre bazlı yumurtalık kanseri immünoterapisi tedavi fırsatları için yararlı olabilecek immün regülasyon metabolitlerine ilişkin benzersiz bilgiler sağlar.
Glukoz alımını [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoksiglukoz (2-NBDG)] ve mitokondriyal aktiviteyi [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) eş zamanlı olarak ölçmek için yüksek boyutlu akış sitometrisi kullandık; bunlar, bağışıklık hücreleri ve tümör hücresi popülasyonlarını ayırt eden tipik belirteçlerdir (Tablo S2 ve Şekil S1A). Bu analiz, T hücreleriyle karşılaştırıldığında, asit ve tümör hücrelerinin daha yüksek glukoz alım seviyelerine sahip olduğunu, ancak mitokondriyal aktivitede daha küçük farklılıklar gösterdiğini ortaya koymuştur. Tümör hücrelerinin [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ortalama glikoz alımı, T hücrelerinin ortalama glikoz alımının üç ila dört katıdır ve CD4+ T hücrelerinin ortalama glikoz alımı, CD8+ T hücrelerinin ortalama glikoz alımının 1,2 katıdır; bu da tümör içine sızan lenfositlerin (TIL) aynı TME'de bile farklı metabolik gereksinimlere sahip olduğunu göstermektedir (Şekil 1A). Buna karşılık, tümör hücrelerindeki mitokondriyal aktivite CD4+ T hücrelerine benzerdir ve her iki hücre tipinin mitokondriyal aktivitesi CD8+ T hücrelerinden daha yüksektir (Şekil 1B). Genel olarak, bu sonuçlar metabolik seviyeyi ortaya koymaktadır. Tümör hücrelerinin metabolik aktivitesi CD4+ T hücrelerinden daha yüksektir ve CD4+ T hücrelerinin metabolik aktivitesi de CD8+ T hücrelerinden daha yüksektir. Hücre tipleri arasında bu etkilere rağmen, asit sıvısındaki CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin metabolik durumunda veya nispi oranlarında tümörlerle karşılaştırıldığında tutarlı bir fark yoktur (Şekil 1C). Bunun aksine, CD45-hücre fraksiyonunda, tümördeki EpCAM+ hücrelerinin oranı asit sıvısına kıyasla artmıştır (Şekil 1D). Ayrıca EpCAM+ ve EpCAM- hücre bileşenleri arasında belirgin bir metabolik fark gözlemledik. EpCAM+ (tümör) hücreleri, EpCAM- hücrelerine göre daha yüksek glikoz alımına ve mitokondriyal aktiviteye sahiptir; bu da TME'deki tümör hücrelerindeki fibroblastların metabolik aktivitesinden çok daha yüksektir (Şekil 1, E ve F).
(A ve B) Glukoz alımının (2-NBDG) (A) ve CD4+ T hücrelerinin mitokondriyal aktivitesinin (MitoTracker koyu kırmızı) (B) medyan floresans yoğunluğu (MFI). Asit ve tümörden alınan CD8+ T hücreleri ve EpCAM+ CD45-tümör hücrelerinin temsili grafikleri (solda) ve tablo verileri (sağda). (C) Asit ve tümördeki CD4+ ve CD8+ hücrelerinin (CD3+ T hücrelerinin) oranı. (D) Asit ve tümördeki EpCAM+ tümör hücrelerinin oranı (CD45−). (E ve F) EpCAM+ CD45-tümör ve EpCAM-CD45-matriks glukoz alımı (2-NBDG) (E) ve mitokondriyal aktivite (MitoTracker koyu kırmızı) (F) temsili grafikleri (solda) ve tablo verileri (sağda). Asit ve tümör hücreleri. (G) Akış sitometrisi ile CD25, CD137 ve PD1 ekspresyonunun temsili grafikleri. (H ve I) CD4+ T hücrelerinde (H) ve CD8+ T hücrelerinde (I) CD25, CD137 ve PD1 ekspresyonu. (J ve K) CCR7 ve CD45RO ekspresyonuna dayalı naif, merkezi bellek (Tcm), efektör (Teff) ve efektör bellek (Tem) fenotipleri. Asit ve tümörlerdeki CD4+ T hücrelerinin (J) ve CD8+ T hücrelerinin (K) temsili görüntüleri (sol) ve tablo verileri (sağ). P değerleri eşleştirilmiş t-testi ile belirlenmiştir (*P<0,05, **P<0,01 ve ***P<0,001). Çizgi eşleştirilmiş hastaları temsil eder (n = 6). FMO, floresans eksi bir; MFI, medyan floresans yoğunluğu.
Daha ileri analizler, yüksek çözünürlüklü T hücresi fenotipik durumu arasında diğer önemli farklılıkları ortaya çıkardı. Tümörlerdeki aktive olmuş (Şekil 1, G ila I) ve efektör bellek (Şekil 1, J ve K) hücreleri, asit sıvısındaki hücrelere göre çok daha sık görülmektedir (CD3+ T hücrelerinin oranı). Benzer şekilde, aktivasyon belirteçlerinin (CD25 ve CD137) ve tükenme belirteçlerinin [programlanmış hücre ölümü proteini 1 (PD1)] ekspresyonu ile fenotipin analiz edilmesi, bu popülasyonların metabolik özelliklerinin farklı olmasına rağmen (Şekil S1, B ila E), naif, efektör veya bellek alt kümeleri arasında tutarlı bir şekilde anlamlı metabolik farklılıklar gözlenmediğini gösterdi (Şekil S1, F ila I). ​​Bu sonuçlar, hücre fenotiplerini otomatik olarak atamak için makine öğrenme yöntemleri kullanılarak doğrulandı (21), bu da hastanın asit sıvısında çok sayıda kemik iliği hücresinin (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) varlığını ortaya çıkardı (Şekil S2A). Tanımlanan tüm hücre tipleri arasında, bu miyeloid hücre popülasyonu en yüksek glikoz alımını ve mitokondriyal aktiviteyi gösterdi (Şekil S2, B ila G). Bu sonuçlar, HGSC hastalarında asit ve tümörlerde bulunan çok sayıda hücre tipi arasındaki güçlü metabolik farklılıkları vurgulamaktadır.
TIL'lerin metabolomik özelliklerini anlamadaki en büyük zorluk, tümörlerden yeterli saflıkta, kalitede ve miktarda T hücresi örneği izole etme ihtiyacıdır. Son çalışmalar, akış sitometrisine dayalı ayırma ve boncuk zenginleştirme yöntemlerinin hücresel metabolit profillerinde değişikliklere yol açabileceğini göstermiştir (22-24). Bu sorunun üstesinden gelmek için, LC-MS/MS ile analizden önce cerrahi olarak çıkarılan insan yumurtalık kanserinden TIL'leri izole etmek ve ayırmak için boncuk zenginleştirme yöntemini optimize ettik (bkz. Malzeme ve Yöntemler; Şekil 2A). Bu protokolün metabolit değişiklikleri üzerindeki genel etkisini değerlendirmek için, yukarıdaki boncuk ayırma adımından sonra sağlıklı donörler tarafından aktive edilen T hücrelerinin metabolit profillerini, boncukla ayrılmamış ancak buzda bekletilmiş hücrelerle karşılaştırdık. Bu kalite kontrol analizi, bu iki koşul arasında yüksek bir korelasyon (r = 0,77) olduğunu ve 86 metabolit grubunun teknik tekrarlanabilirliğinin yüksek olduğunu bulmuştur (Şekil 2B). Bu nedenle, bu yöntemler hücre tipi zenginleştirme sürecinden geçen hücrelerde doğru metabolit analizi gerçekleştirebilir ve böylece HGSC'de spesifik metabolitleri tanımlamak için ilk yüksek çözünürlüklü platformu sağlayarak, insanların hücre özgüllüğüne sahip cinsel metabolizma programı hakkında daha derin bir anlayış kazanmalarını mümkün kılar.
(A) Manyetik boncuk zenginleştirme şematik diyagramı. LC-MS/MS ile analizden önce, hücreler üç ardışık manyetik boncuk zenginleştirme turuna tabi tutulacak veya buz üzerinde bekletilecektir. (B) Zenginleştirme türünün metabolit bolluğu üzerindeki etkisi. Her zenginleştirme türü için üç ölçümün ortalaması ± SE. Gri çizgi 1:1 ilişkiyi temsil eder. Eksen etiketinde tekrarlanan ölçümlerin sınıf içi korelasyonu (ICC) gösterilmiştir. NAD, nikotinamid adenin dinükleotid. (C) Hasta metabolit analizinin iş akışının şematik diyagramı. Hastalardan asit sıvısı veya tümörler toplanır ve dondurularak saklanır. Her örneğin küçük bir kısmı akış sitometrisi ile analiz edilirken, geri kalan örnekler CD4+, CD8+ ve CD45- hücreleri için üç tur zenginleştirmeye tabi tutuldu. Bu hücre fraksiyonları LC-MS/MS kullanılarak analiz edildi. (D) Standartlaştırılmış metabolit bolluğunun ısı haritası. Dendrogram, örnekler arasındaki Öklid mesafelerinin Ward kümelemesini temsil eder. (E) Örnek metabolit haritasının temel bileşen analizi (PCA), her örneğin üç tekrarını gösterir; aynı hastadan alınan örnekler bir çizgiyle bağlanmıştır. (F) Hastaya bağlı olarak örneğin metabolit profilinin PCA'sı (yani kısmi yedeklilik kullanılarak); örnek türü dışbükey zarf ile sınırlandırılmıştır. PC1, ana bileşen 1; PC2, ana bileşen 2.
Daha sonra, bu zenginleştirme yöntemini altı HGSC hastasının primer asit sıvısı ve tümörlerindeki CD4+, CD8+ ve CD45- hücre fraksiyonlarında 99 metaboliti analiz etmek için uyguladık (Şekil 2C, Şekil S3A ve Tablo S3 ve S4). İlgilenilen popülasyon, orijinal büyük canlı hücre örneğinin %2 ila %70'ini oluşturmaktadır ve hücre oranı hastalar arasında büyük ölçüde değişmektedir. Boncukları ayırdıktan sonra, zenginleştirilmiş ilgi fraksiyonu (CD4+, CD8+ veya CD45-), örnekteki tüm canlı hücrelerin ortalama %85'inden fazlasını oluşturmaktadır. Bu zenginleştirme yöntemi, büyük örneklerden yapılması imkansız olan insan tümör dokusu metabolizmasından hücre popülasyonlarını analiz etmemizi sağlar. Bu protokolü kullanarak, iyi karakterize edilmiş iki immünosupresif metabolit olan l-kynurenin ve adenozinin tümör T hücrelerinde veya tümör hücrelerinde yükseldiğini belirledik (Şekil S3, B ve C). Dolayısıyla, bu sonuçlar, hücre ayırma ve kütle spektrometrisi teknolojimizin hasta dokularında biyolojik olarak önemli metabolitleri bulma konusundaki doğruluğunu ve yeteneğini göstermektedir.
Analizimiz ayrıca, hastalar içinde ve arasında hücre tiplerinin güçlü bir metabolik ayrım gösterdiğini ortaya koydu (Şekil 2D ve Şekil S4A). Özellikle, diğer hastalarla karşılaştırıldığında, hasta 70 farklı metabolik özellikler gösterdi (Şekil 2E ve Şekil S4B), bu da hastalar arasında önemli bir metabolik heterojenite olabileceğini gösteriyor. Diğer hastalarla (1,2 ila 2 litre; Tablo S1) karşılaştırıldığında, hasta 70'te toplanan toplam asit sıvısı miktarının (80 ml) daha az olduğunu belirtmekte fayda var. Ana bileşen analizi sırasında hastalar arası heterojenitenin kontrolü (örneğin, kısmi yedeklilik analizi kullanılarak), hücre tipleri arasında tutarlı değişiklikler göstermekte ve hücre tipleri ve/veya mikroçevre, metabolit profiline göre açıkça kümelenmektedir (Şekil 2F). Tek metabolitlerin analizi bu etkileri vurguladı ve hücre tipleri ve mikroçevre arasında önemli farklılıklar ortaya koydu. En belirgin farkın, genellikle CD45- hücrelerinde ve tümöre sızan CD4+ ve CD8+ hücrelerinde zenginleşen MNA olduğu dikkate değerdir (Şekil 3A). CD4+ hücrelerinde bu etki en belirgindir ve CD8+ hücrelerindeki MNA'nın da çevreden güçlü bir şekilde etkilendiği görülmektedir. Bununla birlikte, bu önemli değildir, çünkü altı hastadan sadece üçünün tümör CD8+ skorları değerlendirilebilmiştir. MNA'ya ek olarak, asit ve tümörlerdeki farklı hücre tiplerinde, TIL'de yetersiz karakterize edilmiş diğer metabolitler de farklı oranlarda zengindir (Şekil S3 ve S4). Bu nedenle, bu veriler, daha fazla araştırma için umut vadeden bir immünomodülatör metabolit seti ortaya koymaktadır.
(A) Asit ve tümörden alınan CD4+, CD8+ ve CD45- hücrelerindeki MNA'nın normalize edilmiş içeriği. Kutu grafiği, medyanı (çizgi), çeyrekler arası aralığı (çerçeve menteşesi) ve çeyrekler arası aralığın 1,5 katına kadar olan veri aralığını (çerçeve bıyığı) göstermektedir. Hasta Materyalleri ve Yöntemleri bölümünde açıklandığı gibi, P değerini belirlemek için hastanın limma değerini kullanın (*P<0,05 ve **P<0,01). (B) MNA metabolizmasının şematik diyagramı (60). Metabolitler: S-adenozil-1-metiyonin; SAH, S-adenozin-1-homosistein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metilnikotinamid; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid riboz; NMN, nikotinamid mononükleotid. Enzimler (yeşil): NNMT, nikotinamid N-metiltransferaz; SIRT, sirtuinler; NAMPT, nikotinamid fosforibozil transferaz; AOX1, aldehit oksidaz 1; NRK, nikotinamid ribozid kinaz; NMNAT, nikotinamid mononükleotid adenilat transferaz; Pnp1, purin nükleozid fosforilaz. (C) Asit (gri) ve tümörün (kırmızı; n = 3 hasta) scRNA-seq'inin t-SNE'si. (D) scRNA-seq kullanılarak tanımlanan farklı hücre popülasyonlarında NNMT ekspresyonu. (E) SK-OV-3, insan embriyonik böbrek (HEK) 293T, T hücreleri ve MNA ile tedavi edilen T hücrelerinde NNMT ve AOX1 ekspresyonu. Katlanmış ekspresyon, SK-OV-3'e göre gösterilmiştir. SEM ile ifade paterni gösterilmiştir (n = 6 sağlıklı donör). 35'ten büyük Ct değerleri saptanamaz (UD) olarak kabul edilir. (F) SK-OV-3, HEK293T, T hücreleri ve 8 mM MNA ile muamele edilmiş T hücrelerinde SLC22A1 ve SLC22A2 ekspresyonu. Katlanmış ekspresyon, SK-OV-3'e göre gösterilmiştir. SEM ile ifade paterni gösterilmiştir (n = 6 sağlıklı donör). 35'ten büyük Ct değerleri saptanamaz (UD) olarak kabul edilir. (G) MNA ile 72 saatlik inkübasyondan sonra aktive edilmiş sağlıklı donör T hücrelerindeki hücre MNA içeriği. SEM ile ifade paterni gösterilmiştir (n = 4 sağlıklı donör).
MNA, metil grubunun S-adenozil-1-metioninden (SAM) nikotinamid N-metiltransferaz (NNMT; Şekil 3B) tarafından nikotinamide (NA) aktarılmasıyla üretilir. NNMT, çeşitli insan kanserlerinde aşırı ifade edilir ve proliferasyon, invazyon ve metastaz ile ilişkilidir (25-27). TME'deki T hücrelerinde MNA'nın kaynağını daha iyi anlamak için, üç HGSC hastasının asit ve tümörlerindeki hücre tiplerinde NNMT ekspresyonunu karakterize etmek için scRNA-seq kullandık (Tablo S5). Yaklaşık 6.500 hücrenin analizi, asit ve tümör ortamlarında NNMT ekspresyonunun varsayılan fibroblast ve tümör hücresi popülasyonlarıyla sınırlı olduğunu gösterdi (Şekil 3, C ve D). PTPRC (CD45 +) ifade eden herhangi bir popülasyonda belirgin bir NNMT ifadesinin bulunmadığını belirtmekte fayda var (Şekil 3D ve Şekil S5A), bu da metabolit spektrumunda tespit edilen MNA'nın T hücrelerine girdiğini göstermektedir. Aldehit oksidaz 1 (AOX1) ifadesi, MNA'yı 1-metil-2-piridon-5-karboksamid (2-PYR) veya 1-metil-4-piridon-5-karboksamid (4-PYR)'ye dönüştürür; Şekil 3B) ayrıca COL1A1 ifade eden fibroblast popülasyonuyla sınırlıdır (Şekil S5A), bu da T hücrelerinin geleneksel MNA metabolizması yeteneğinden yoksun olduğunu göstermektedir. Bu MNA ile ilgili genlerin ifade paterni, HGSC hastalarından alınan asit sıvısından elde edilen ikinci bir bağımsız hücre veri seti kullanılarak doğrulandı (Şekil S5B; n = 6) (16). Ek olarak, MNA ile muamele edilmiş sağlıklı donör T hücrelerinin kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi, kontrol SK-OV-3 yumurtalık tümör hücreleriyle karşılaştırıldığında, NNMT veya AOX1'in neredeyse hiç ifade edilmediğini göstermiştir (Şekil 3E). Bu beklenmedik sonuçlar, MNA'nın TME'deki bitişik T hücrelerine fibroblastlardan veya tümörlerden salgılanabileceğini göstermektedir.
Adaylar arasında çözünür taşıyıcı 22 (SLC22) ailesi (SLC22A1, SLC22A2 ve SLC22A3) tarafından kodlanan organik katyon taşıyıcıları 1 ila 3 (OCT1, OCT2 ve OCT3) ailesi bulunmasına rağmen, MNA'nın potansiyel taşıyıcıları hala tanımlanmamıştır (28). Sağlıklı donör T hücrelerinden elde edilen mRNA'nın QPCR'ı, SLC22A1'in düşük ekspresyon seviyelerini ancak SLC22A2'nin saptanamayan seviyelerini gösterdi; bu da daha önce literatürde bildirildiğini doğruladı (Şekil 3F) (29). Buna karşılık, SK-OV-3 yumurtalık tümör hücresi hattı her iki taşıyıcının da yüksek seviyelerini ifade etti (Şekil 3F).
T hücrelerinin yabancı MNA'yı absorbe etme yeteneğine sahip olup olmadığını test etmek amacıyla, sağlıklı donör T hücreleri 72 saat boyunca farklı MNA konsantrasyonlarında kültüre edildi. Eksojen MNA yokluğunda, hücredeki MNA içeriği tespit edilemedi (Şekil 3G). Bununla birlikte, eksojen MNA ile muamele edilen aktive edilmiş T hücreleri, 6 mM MNA'ya kadar hücrelerdeki MNA içeriğinde doza bağlı bir artış gösterdi (Şekil 3G). Bu sonuç, taşıyıcı ekspresyonunun düşük seviyesine ve hücre içi MNA metabolizmasından sorumlu ana enzimin yokluğuna rağmen, TIL'lerin yine de MNA'yı alabileceğini göstermektedir.
Hastaların T hücrelerindeki metabolit spektrumu ve in vitro MNA absorbsiyon deneyleri, kanserle ilişkili fibroblastların (CAF) MNA salgıladığı ve tümör hücrelerinin TIL'lerin fenotipini ve fonksiyonunu düzenleyebileceği olasılığını artırmaktadır. MNA'nın T hücreleri üzerindeki etkisini belirlemek için, sağlıklı donör T hücreleri in vitro olarak MNA varlığında veya yokluğunda aktive edildi ve proliferasyonları ve sitokin üretimleri değerlendirildi. En yüksek dozda MNA eklenmesinden 7 gün sonra, popülasyon ikiye katlanma sayısı orta derecede azaldı, ancak canlılık tüm dozlarda korundu (Şekil 4A). Ek olarak, ekzojen MNA tedavisi, tümör nekroz faktörü-α (TNFα) eksprese eden CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin oranında bir artışa neden oldu (Şekil 4B). Buna karşılık, CD4+ T hücrelerinde IFN-γ'nin hücre içi üretimi önemli ölçüde azaldı, ancak CD8+ T hücrelerinde azalmadı ve interlökin 2'de (IL-2) önemli bir değişiklik olmadı (Şekil 4, C ve D). Bu nedenle, MNA ile tedavi edilen bu T hücre kültürlerinden elde edilen süpernatantların enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA), TNFα'da önemli bir artış, IFN-γ'da bir azalma ve IL-2'de herhangi bir değişiklik olmadığını göstermiştir (Şekil 4, E ila G). IFN-γ'daki azalma, MNA'nın T hücrelerinin antitümör aktivitesini inhibe etmede rol oynayabileceğini göstermektedir. MNA'nın T hücre aracılı sitotoksisite üzerindeki etkisini simüle etmek için, folat reseptörü α'yı hedefleyen kimerik antijen reseptörlü T (FRα-CAR-T) hücreleri ve yeşil floresan protein (GFP) ile düzenlenen CAR-T (GFP-CAR-T) hücreleri, sağlıklı donör periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) üretilmiştir. CAR-T hücreleri, MNA varlığında 24 saat kültüre edilmiş ve daha sonra 10:1 oranında efektör/hedef oranında folat reseptörü α eksprese eden insan SK-OV-3 yumurtalık tümör hücreleri ile birlikte kültüre edilmiştir. MNA tedavisi, adenozin ile tedavi edilen FRα-CAR-T hücrelerine benzer şekilde, FRα-CAR-T hücrelerinin öldürme aktivitesinde önemli bir azalmaya neden oldu (Şekil 4H).
(A) 7. günde kültürden doğrudan alınan toplam canlı hücre sayısı ve popülasyon ikiye katlanma (PD). Çubuk grafik, altı sağlıklı donörün ortalama + SEM değerini temsil eder. En az n = 3 bağımsız deneyden elde edilen verileri temsil eder. (B - D) CD3/CD28 ve IL-2, T hücrelerini 7 gün boyunca ilgili MNA konsantrasyonlarında aktive etmek için kullanıldı. Analizden önce hücreler, GolgiStop ile birlikte PMA/iyonomsin ile 4 saat süreyle uyarıldı. T hücrelerinde TNFα (B) ekspresyonu. Canlı hücrelerde TNFα ekspresyonunun örnek görüntüsü (sol) ve tablo verileri (sağ). T hücrelerinde IFN-γ (C) ve IL-2 (D) ekspresyonu. Sitokinlerin ekspresyonu akış sitometrisi ile ölçüldü. Çubuk grafik, ortalama (n = 6 sağlıklı donör) + SEM değerini temsil eder. P değerini belirlemek için tek yönlü varyans analizi ve tekrarlanan ölçümler (*P<0,05 ve **P<0,01) kullanın. En az n = 3 bağımsız deneyden elde edilen verileri temsil eder. (E ila G) CD3/CD28 ve IL-2, T hücrelerini 7 gün boyunca ilgili MNA konsantrasyonlarında aktive etmek için kullanıldı. Ortam, PMA/iyonomsin uyarımından 4 saat önce ve sonra toplandı. TNFα (E), IFN-γ (F) ve IL-2 (G) konsantrasyonları ELISA ile ölçüldü. Çubuk grafik, ortalama (n = 5 sağlıklı donör) + SEM'i temsil eder. P değeri, tek yönlü varyans analizi ve tekrarlanan ölçümler kullanılarak belirlendi (*P<0,05). Noktalı çizgi, tespit limitini gösterir. (H) Hücre lizis deneyi. FRα-CAR-T veya GFP-CAR-T hücreleri, 24 saat boyunca adenozin (250 μM) veya MNA (10 mM) ile ayarlandı veya işlem görmeden bırakıldı (Kontrol). SK-OV-3 hücrelerinin öldürülme yüzdesi ölçüldü. Welch t testi ile belirlenen P değeri (*P<0,5 ve **P<0,01).
MNA'ya bağlı TNFα ekspresyon düzenlemesinin mekanistik bir anlayışını elde etmek için, MNA ile tedavi edilen T hücrelerinin TNFα mRNA'sındaki değişiklikler değerlendirildi (Şekil 5A). MNA ile tedavi edilen sağlıklı donör T hücreleri, TNFα transkripsiyon seviyelerinde iki kat artış gösterdi; bu da MNA'nın TNFα transkripsiyonel düzenlemesine bağlı olduğunu gösteriyor. Bu olası düzenleyici mekanizmayı araştırmak için, TNFα'yı düzenleyen bilinen iki transkripsiyon faktörü, yani aktive edilmiş T hücresi nükleer faktörü (NFAT) ve spesifik protein 1 (Sp1), MNA'nın proksimal TNFα promotörüne bağlanmasına yanıt olarak değerlendirildi (30). TNFα promotörü, 6 tanımlanmış NFAT bağlanma bölgesi ve 2 Sp1 bağlanma bölgesi içerir ve bir bölgede örtüşür [-55 baz çifti (bp) 5' ucundan] (30). Kromatin immünopresipitasyonu (ChIP), MNA ile tedavi edildiğinde Sp1'in TNFα promotörüne bağlanmasının üç kat arttığını gösterdi. NFAT'ın dahil edilmesi de arttı ve önem kazandı (Şekil 5B). Bu veriler, MNA'nın Sp1 transkripsiyonu yoluyla TNFα ekspresyonunu ve daha az ölçüde NFAT ekspresyonunu düzenlediğini göstermektedir.
(A) MNA olmadan kültürlenen T hücreleriyle karşılaştırıldığında, MNA ile muamele edilen T hücrelerinde TNFα ekspresyonundaki katlanma değişimi. SEM ile ekspresyon paterni gösterilmiştir (n = 5 sağlıklı donör). En az n = 3 bağımsız deneyden elde edilen verileri temsil eder. (B) NFAT ve Sp1'in (Kontrol) ve PMA/iyonomsin ile 4 saat süreyle uyarılmasından sonra 8 mM MNA ile veya MNA olmadan muamele edilen T hücrelerinin TNFα promotörü. İmmünoglobulin G (IgG) ve H3, sırasıyla immünopresipitasyon için negatif ve pozitif kontroller olarak kullanılmıştır. ChIP'in kantifikasyonu, MNA ile muamele edilen hücrelerde Sp1 ve NFAT'ın TNFα promotörüne bağlanmasının kontrole kıyasla birkaç kat arttığını göstermiştir. En az n = 3 bağımsız deneyden elde edilen verileri temsil eder. P değeri çoklu t-testleri ile belirlenmiştir (*** P <0,01). (C) HGSC'nin asit sıvısıyla karşılaştırıldığında, T hücreleri (sitotoksik olmayan) tümörde TNF ekspresyonunda artış gösterdi. Renkler farklı hastaları temsil etmektedir. Görüntülenen hücreler rastgele 300'e kadar örneklenmiş ve aşırı çizimi sınırlamak için titreştirilmiştir (** Padj = 0,0076). (D) Yumurtalık kanseri için önerilen MNA modeli. MNA, tümör hücrelerinde ve TME'deki fibroblastlarda üretilir ve T hücreleri tarafından alınır. MNA, Sp1'in TNFα promotörüne bağlanmasını artırarak TNFα transkripsiyonunu ve TNFα sitokin üretimini artırır. MNA ayrıca IFN-γ'de azalmaya neden olur. T hücresi fonksiyonunun inhibisyonu, öldürme yeteneğinin azalmasına ve tümör büyümesinin hızlanmasına yol açar.
Raporlara göre, TNFα'nın ön ve arka bağımlı anti-tümör ve anti-tümör etkileri vardır, ancak yumurtalık kanserinin büyümesini ve metastazını teşvik etmede bilinen bir rolü vardır (31-33). Raporlara göre, yumurtalık kanseri olan hastalarda asit ve tümör dokularındaki TNFα konsantrasyonu, benign dokulardakinden daha yüksektir (34-36). Mekanizma açısından, TNFα beyaz kan hücrelerinin aktivasyonunu, fonksiyonunu ve proliferasyonunu düzenleyebilir ve kanser hücrelerinin fenotipini değiştirebilir (37, 38). Bu bulgularla tutarlı olarak, diferansiyel gen ekspresyon analizi, TNF'nin tümör dokularındaki T hücrelerinde asitlere kıyasla önemli ölçüde yukarı düzenlendiğini göstermiştir (Şekil 5C). TNF ekspresyonundaki artış, yalnızca sitotoksik olmayan fenotipe sahip T hücre popülasyonlarında belirgindi (Şekil S5A). Özetle, bu veriler, MNA'nın HGSC'de hem immünosupresif hem de tümör teşvik edici ikili etkilere sahip olduğu görüşünü desteklemektedir.
Akış sitometrisine dayalı floresan etiketleme, TIL metabolizmasını incelemek için ana yöntem haline gelmiştir. Bu çalışmalar, periferik kan lenfositleri veya ikincil lenfoid organlardan elde edilen T hücreleriyle karşılaştırıldığında, fare ve insan TIL'lerinin glikoz alımına daha yüksek bir eğilim gösterdiğini (4, 39) ve mitokondriyal fonksiyonun kademeli olarak kaybolduğunu (19, 40) göstermiştir. Bu çalışmada benzer sonuçlar gözlemlemiş olsak da, kilit gelişme, aynı rezeke edilmiş tümör dokusundan elde edilen tümör hücreleri ve TIL'lerin metabolizmasını karşılaştırmaktır. Bu önceki raporların bazılarıyla tutarlı olarak, asit ve tümörlerden elde edilen tümör (CD45-EpCAM +) hücreleri, CD8 + ve CD4 + T hücrelerinden daha yüksek glikoz alımına sahiptir ve bu da tümör hücrelerinin yüksek glikoz alımının T hücreleriyle karşılaştırılabilir olduğunu desteklemektedir. T hücresi rekabeti kavramı. TME. Bununla birlikte, tümör hücrelerinin mitokondriyal aktivitesi CD8 + T hücrelerinden daha yüksektir, ancak mitokondriyal aktivite CD4 + T hücrelerinin mitokondriyal aktivitesine benzerdir. Bu sonuçlar, oksidatif metabolizmanın tümör hücreleri için önemli olduğu yönündeki yeni ortaya çıkan temayı güçlendirmektedir (41, 42). Ayrıca, CD8+ T hücrelerinin CD4+ T hücrelerinden daha fazla oksidatif disfonksiyona yatkın olabileceğini veya CD4+ T hücrelerinin mitokondriyal aktiviteyi sürdürmek için glikoz dışında karbon kaynakları kullanabileceğini öne sürmektedir (43, 44). Asit sıvısında CD4+ T efektörleri, T efektör bellek ve T merkezi bellek hücreleri arasında glikoz alımı veya mitokondriyal aktivitede bir fark gözlemlemediğimizi belirtmek gerekir. Benzer şekilde, tümörlerdeki CD8+ T hücrelerinin farklılaşma durumu, glikoz alımındaki değişikliklerle hiçbir ilgisi yoktur ve bu da in vitro kültürlenen T hücreleri ile in vivo insan TIL'leri arasındaki önemli farkı vurgulamaktadır (22). Bu gözlemler, tarafsız otomatik hücre popülasyonu tahsisi kullanılarak da doğrulanmıştır; bu da, tümör hücrelerinden daha yüksek glikoz alımı ve mitokondriyal aktiviteye sahip CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ hücrelerinin yaygın olduğunu ancak metabolik olarak aktif bir hücre popülasyonuna sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu popülasyon, scRNA-seq analizinde tanımlanan miyeloid baskılayıcı hücrelerin veya plazmasitoid dendritik hücrelerin varsayımsal alt popülasyonunu temsil edebilir. Her ikisi de insan yumurtalık tümörlerinde rapor edilmiş olsa da [45], bu miyeloid alt popülasyonu tanımlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Akış sitometrisi tabanlı yöntemler, hücre tipleri arasındaki glikoz ve oksidatif metabolizmadaki genel farklılıkları açıklığa kavuşturabilse de, TME'deki mitokondriyal metabolizma için glikoz veya diğer karbon kaynakları tarafından üretilen kesin metabolitler henüz belirlenmemiştir. Belirli bir TIL alt kümesine metabolitlerin varlığını veya yokluğunu atamak, çıkarılan dokudan hücre popülasyonunun saflaştırılmasını gerektirir. Bu nedenle, kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş hücre zenginleştirme yöntemimiz, eşleşen hasta örneklerinde T hücrelerinde ve tümör hücresi popülasyonlarında farklı şekilde zenginleştirilmiş metabolitler hakkında bilgi sağlayabilir. Bu yöntemin floresan aktivasyonlu hücre sıralamasına göre avantajları olsa da, bazı metabolit kütüphaneleri, doğal kararlılık ve/veya hızlı dönüşüm oranı nedeniyle etkilenebilir (22). Bununla birlikte, yöntemimiz, örnek tipleri arasında büyük ölçüde değiştiği için, bilinen iki immünosupresif metabolit olan adenozin ve kynurenini tanımlayabilmiştir.
Tümörler ve TIL alt tiplerinin metabolomik analizimiz, yumurtalık TME'sindeki metabolitlerin rolüne dair daha fazla bilgi sağlamaktadır. İlk olarak, akış sitometrisi kullanarak, tümörler ve CD4+ T hücreleri arasında mitokondriyal aktivitede bir fark olmadığını belirledik. Bununla birlikte, LC-MS/MS analizi, bu popülasyonlar arasında metabolit bolluğunda önemli değişiklikler ortaya koydu; bu da TIL metabolizması ve genel metabolik aktivitesi hakkındaki sonuçların dikkatli bir şekilde yorumlanmasını gerektirdiğini göstermektedir. İkinci olarak, MNA, tümörlerde değil, asit sıvısındaki CD45- hücreleri ve T hücreleri arasında en büyük farka sahip metabolittir. Bu nedenle, bölümlendirme ve tümör lokasyonu, TIL metabolizması üzerinde farklı etkilere sahip olabilir; bu da belirli bir mikroortamda olası heterojenliği vurgulamaktadır. Üçüncü olarak, MNA üreten enzim NNMT'nin ekspresyonu esas olarak CAF'lerle sınırlıdır; bu da daha az oranda tümör hücreleridir, ancak tümörden türetilen T hücrelerinde saptanabilir MNA seviyeleri gözlemlenmektedir. Yumurtalık CAF'larında NNMT'nin aşırı ekspresyonunun, kısmen CAF metabolizmasının, tümör invazyonunun ve metastazın teşvik edilmesi nedeniyle bilinen bir kanser teşvik edici etkisi vardır (27). Genel TIL seviyesi orta düzeyde olmasına rağmen, CAF'lardaki NNMT ekspresyonu, kötü prognozla ilişkili olan Kanser Genom Atlası (TCGA) mezenkimal alt tipiyle yakından ilişkilidir (27, 46, 47). Son olarak, MNA bozunmasından sorumlu enzim AOX1'in ekspresyonu da CAF popülasyonuyla sınırlıdır, bu da T hücrelerinin MNA'yı metabolize etme yeteneğinden yoksun olduğunu gösterir. Bu sonuçlar, bu bulguyu doğrulamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmasına rağmen, T hücrelerindeki yüksek MNA seviyelerinin, immünosupresif bir CAF mikroortamının varlığını gösterebileceği fikrini desteklemektedir.
MNA taşıyıcılarının düşük ekspresyon seviyesi ve MNA metabolizmasında yer alan temel proteinlerin saptanamayan seviyeleri göz önüne alındığında, T hücrelerinde MNA'nın varlığı beklenmediktir. İki bağımsız kohortun scRNA-seq analizi ve hedefli qPCR'ı ile ne NNMT ne de AOX1 saptanamadı. Bu sonuçlar, MNA'nın T hücreleri tarafından sentezlenmediğini, ancak çevredeki TME'den emildiğini göstermektedir. İn vitro deneyler, T hücrelerinin eksojen MNA'yı biriktirme eğiliminde olduğunu göstermektedir.
İn vitro çalışmalarımız, ekzojen MNA'nın T hücrelerinde TNFα ekspresyonunu indüklediğini ve Sp1'in TNFα promotörüne bağlanmasını artırdığını göstermiştir. TNFα'nın hem anti-tümör hem de anti-tümör fonksiyonları olmasına rağmen, yumurtalık kanserinde TNFα, yumurtalık kanserinin büyümesini teşvik edebilir (31-33). Yumurtalık tümör hücresi kültüründe TNFα'nın nötralizasyonu veya fare modellerinde TNFα sinyalinin ortadan kaldırılması, TNFα aracılı inflamatuar sitokin üretimini iyileştirebilir ve tümör büyümesini engelleyebilir (32, 35). Bu nedenle, bu durumda, TME kaynaklı MNA, otokrin döngü yoluyla TNFα'ya bağımlı bir mekanizma aracılığıyla pro-inflamatuar bir metabolit olarak hareket edebilir ve böylece yumurtalık kanserinin oluşumunu ve yayılmasını teşvik edebilir (31). Bu olasılığa dayanarak, TNFα blokajı, yumurtalık kanseri için potansiyel bir terapötik ajan olarak incelenmektedir (37, 48, 49). Ek olarak, MNA, CAR-T hücrelerinin yumurtalık tümör hücrelerine karşı sitotoksisitesini bozarak MNA aracılı bağışıklık baskılanmasına dair daha fazla kanıt sunmaktadır. Toplu olarak, bu sonuçlar, tümörlerin ve CAF hücrelerinin MNA'yı hücre dışı TME'ye salgıladığı bir modeli önermektedir. (i) TNF kaynaklı yumurtalık kanseri büyümesinin uyarılması ve (ii) MNA kaynaklı T hücresi sitotoksik aktivitesinin inhibisyonu yoluyla, bu durum çift yönlü bir tümör etkisine sahip olabilir (Şekil 5D).
Sonuç olarak, hızlı hücre zenginleştirme, tek hücre dizileme ve metabolik profilleme kombinasyonunu uygulayarak, bu çalışma HGSC hastalarında tümör ve asit hücreleri arasında büyük immünometabolomik farklılıklar ortaya koymuştur. Bu kapsamlı analiz, T hücreleri arasında glikoz alımı ve mitokondriyal aktivitede farklılıklar olduğunu göstermiş ve MNA'yı hücre dışı bir immün düzenleyici metabolit olarak tanımlamıştır. Bu veriler, TME'nin insan kanserlerinde T hücresi metabolizmasını nasıl etkilediği konusunda önemli bir etkiye sahiptir. T hücreleri ve kanser hücreleri arasında besinler için doğrudan rekabet bildirilmiş olsa da, metabolitler tümör ilerlemesini teşvik etmek ve muhtemelen endojen immün yanıtları baskılamak için dolaylı düzenleyiciler olarak da işlev görebilir. Bu düzenleyici metabolitlerin fonksiyonel rolünün daha ayrıntılı tanımlanması, anti-tümör immün yanıtı artırmak için alternatif stratejiler ortaya çıkarabilir.
Hasta örnekleri ve klinik veriler, Kanada Doku Deposu Ağı tarafından onaylanmış BC kanser tümör dokusu deposundan elde edilmiştir. BC Kanser Araştırma Etik Kurulu ve British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanan protokole (H07-00463) göre, tüm hastaların örnekleri ve klinik verileri için bilgilendirilmiş yazılı onam alınmış veya onamlarından resmi olarak feragat edilmiştir. Örnekler, onaylı Biyobankada (BRC-00290) saklanmaktadır. Ayrıntılı hasta özellikleri Tablo S1 ve S5'te gösterilmiştir. Kriyoprezervasyon için, hastanın tümör örneği mekanik olarak parçalanmak üzere bir neşter kullanılarak alınmış ve daha sonra tek hücre süspansiyonu elde etmek için 100 mikronluk bir filtreden geçirilmiştir. Hastanın asiti, hücreleri çöktürmek ve süpernatantı uzaklaştırmak için 4°C'de 10 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj edilmiştir. Tümör ve asit sıvısından elde edilen hücreler, %50 ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu (Sigma-Aldrich), %40 RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ve %10 dimetil sülfoksit içinde dondurularak saklandı. Bu korunmuş tek hücre süspansiyonları çözüldü ve aşağıda açıklanan metabolomik ve metabolit belirleme işlemleri için kullanıldı.
Tam besiyeri, 0,22 μm filtrelenmiş 50:50 oranında takviye edilmiş RPMI 1640: AimV'den oluşmaktadır. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), %10 ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penisilin Streptomisin (PenStrep) çözeltisi (Thermo Fisher Scientific) ve 50 μMB merkaptanol ile takviye edilmiştir. AimV (Invitrogen), 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ve 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) ile takviye edilmiştir. Akış sitometresi boyama tamponu, %3 oranında ısı ile inaktive edilmiş AB insan serumu (Sigma) ile desteklenmiş 0,22 μm filtrelenmiş fosfat tamponlu salin (PBS; Invitrogen) içeriyordu. Hücre zenginleştirme tamponu ise %0,5 oranında ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu (Sigma-Aldrich) ile desteklenmiş 0,22 μm filtrelenmiş PBS'den oluşuyordu.
37°C'de tam besiyerinde hücreler 30 dakika boyunca 10 nM MT DR ve 100 μM 2-NBDG ile boyandı. Ardından hücreler 4°C'de 15 dakika boyunca eF506 canlılık boyası ile boyandı. Hücreler FC Blok (eBioscience) ve Brilliant Boyama Tamponu (BD Biosciences) içinde süspansiyon haline getirildi, akış sitometresi boyama tamponunda (üreticinin talimatlarına göre) seyreltildi ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Hücreler, akış sitometrisi boyama tamponunda 4°C'de 20 dakika boyunca bir dizi antikor (Tablo S2) ile boyandı. Analizden önce hücreler akış sitometrisi boyama tamponunda (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigürasyonu) süspansiyon haline getirildi. Hücre sayım verilerini analiz etmek için SpectroFlo ve FlowJo V10, verileri oluşturmak için ise GraphPad Prism 8 kullanıldı. 2-NBDG ve MT DR'nin medyan floresans yoğunluğu (MFI) logaritmik olarak normalleştirildi ve ardından eşleştirilmiş hastaları hesaba katmak için istatistiksel analizde eşleştirilmiş t testi kullanıldı. Analizden 40'tan az olaya sahip tüm popülasyonlar çıkarıldı; istatistiksel analiz ve veri görselleştirmesi yapılmadan önce negatif değerler için MFI değeri 1 olarak girildi.
Yukarıdaki işlem panelinin manuel kapılama stratejisini tamamlamak için, FlowJo'da ölü hücreleri ortadan kaldırdıktan sonra hücreleri popülasyona otomatik olarak atamak üzere şekil kısıtlama ağacı (FAUST) (21) tarafından yapılan tam açıklamayı kullandık. Yanlış tahsis edilmiş gibi görünen popülasyonları (PD1+ ile PD1- tümör hücrelerini birleştirme) ve tutulan popülasyonları birleştirmek için çıktıyı manuel olarak yönetiyoruz. Her örnek ortalama %2'den fazla hücre içerir ve toplamda 11 popülasyon elde edilir.
PBMC'leri lökosit ayırma ürünlerinden ayırmak için Ficoll gradyan yoğunluk santrifüjü kullanıldı (STEMCELL Technologies). CD8+ T hücreleri, CD8 MikroBoncukları (Miltenyi) kullanılarak PBMC'lerden izole edildi ve üreticinin talimatlarına göre 2 hafta boyunca TransAct (Miltenyi) kullanılarak tam besiyerinde çoğaltıldı. Hücrelerin IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) içeren tam besiyerinde 5 gün bekletilmesine izin verildi ve ardından TransAct ile yeniden uyarıldı. 7. günde, üreticinin talimatlarına göre, hücreleri üç ardışık turda zenginleştirmek için insan CD45 MikroBoncukları (Miltenyi) kullanıldı. Hücreler akış sitometrisi analizi için (yukarıda açıklandığı gibi) bölümlere ayrıldı ve bir milyon hücre LC-MS/MS analizi için üç kez bölümlere ayrıldı. Numuneler aşağıda açıklandığı gibi LC-MS/MS ile işlendi. Eksik metabolit değerini 1.000 iyon sayısı ile tahmin ettik. Her örnek, toplam iyon sayısı (TIC) ile normalize edilir, logaritmik olarak dönüştürülür ve analizden önce MetaboAnalystR'da otomatik olarak normalize edilir.
Her hastanın tek hücre süspansiyonu çözülerek 40 μm'lik bir filtreden geçirilerek tam besiyerine (yukarıda açıklandığı gibi) aktarıldı. Üreticinin protokolüne göre, CD8+, CD4+ ve CD45- hücreleri için örnekleri zenginleştirmek amacıyla MicroBeads (Miltenyi) kullanılarak manyetik boncuk ayırma yöntemiyle üç ardışık pozitif seçim turu uygulandı (buz üzerinde). Kısaca, hücreler hücre zenginleştirme tamponunda (yukarıda açıklandığı gibi) yeniden süspansiyon haline getirildi ve sayıldı. Hücreler, 4°C'de 15 dakika boyunca insan CD8 boncukları, insan CD4 boncukları veya insan CD45 boncukları (Miltenyi) ile inkübe edildi ve ardından hücre zenginleştirme tamponu ile yıkandı. Örnek, LS kolonundan (Miltenyi) geçirildi ve pozitif ve negatif fraksiyonlar toplandı. Süreyi kısaltmak ve hücre geri kazanım adımını en üst düzeye çıkarmak için, CD8 fraksiyonu daha sonra ikinci tur CD4+ zenginleştirme için, CD4 fraksiyonu ise sonraki CD45 zenginleştirme için kullanıldı. Ayırma işlemi boyunca çözeltiyi buz üzerinde tutun.
Metabolit analizi için numuneleri hazırlamak amacıyla, hücreler bir kez buz gibi soğuk tuz çözeltisiyle yıkandı ve her numuneye 1 ml %80 metanol eklendi, ardından vortekslenerek sıvı azot içinde hızla donduruldu. Numuneler üç dondurma-çözme döngüsüne tabi tutuldu ve 4°C'de 15 dakika boyunca 14.000 rpm'de santrifüjlendi. Metabolitleri içeren süpernatant kuruyana kadar buharlaştırıldı. Metabolitler 50 μl %0,03 formik asit içinde yeniden çözüldü, karıştırmak için vortekslendi ve ardından kalıntıları gidermek için santrifüjlendi.
Metabolitleri yukarıda açıklandığı gibi çıkarın. Süpernatantı metabolomik araştırma için yüksek performanslı sıvı kromatografi şişesine aktarın. Parti etkilerini önlemek için her numuneyi benzer sayıda hücreyle işlemek üzere rastgele bir tedavi protokolü kullanın. Daha önce AB SCIEX QTRAP 5500 Üçlü Dörtlü Kütle Spektrometresi (50) üzerinde yayınlanan global metabolitlerin kalitatif bir değerlendirmesini gerçekleştirdik. Kromatografik analiz ve tepe alanı entegrasyonu MultiQuant sürüm 2.1 yazılımı (Applied Biosystems SCIEX) kullanılarak gerçekleştirildi.
Eksik metabolit değerini tahmin etmek için 1000 iyon sayımı kullanıldı ve her bir numunenin TIC'si, numune işleme sırasında enstrümantal analizden kaynaklanan değişiklikleri düzeltmek için tespit edilen her bir metabolitin normalize edilmiş tepe alanını hesaplamak için kullanıldı. TIC normalize edildikten sonra, logaritmik dönüşüm ve otomatik norm çizgisi ölçeklendirmesi için MetaboAnalystR(51) (varsayılan parametre) kullanıldı. Numune tipleri arasındaki metabolom farklılıklarının keşifsel analizini gerçekleştirmek için vegan R paketi ile PCA kullandık ve hastaları analiz etmek için kısmi yedeklilik analizi kullandık. Numuneler arasındaki Öklid mesafesini kümelemek için bir ısı haritası dendrogramı oluşturmak için Ward yöntemini kullandık. Tüm hücre tipi ve mikroortam boyunca farklı bollukta olan metabolitleri belirlemek için standartlaştırılmış metabolit bolluğu üzerinde limma (52) kullandık. Açıklamayı basitleştirmek için, modeli belirtmek üzere grup ortalama parametresini kullandık ve mikroortamdaki hücre tiplerini her bir grup olarak ele aldık (n = 6 grup); Anlamlılık testi için, her bir metabolit için üç tekrarlı ölçüm gerçekleştirdik. Yanlış tekrarlamayı önlemek için, hasta limma tasarımına bir engel olarak dahil edildi. Farklı hastalar arasındaki metabolit farklılıklarını kontrol etmek için, hastaları sabit bir şekilde dahil ederek limma modelini ayarladık. Hücre tipi ve mikroçevre arasındaki önceden belirlenmiş kontrastın anlamlılığını Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg düzeltmesi) olarak rapor ediyoruz.
Miltenyi Ölü Hücre Giderme Kiti kullanılarak canlılık zenginleştirmesinden sonra (>%80 canlılık), toplam canlı dondurulmuş asit ve tümör örneklerinde 10x 5'gen ekspresyon protokolü kullanılarak tek hücreli transkriptom dizilemesi gerçekleştirildi. Eşleşen tümör ve asit örneklerine sahip beş vaka analiz edildi, ancak bir tümör örneğinin düşük canlılığı dahil edilmesini engelledi. Hastaların birden fazla seçimini sağlamak için, her hastanın örneklerini 10x krom kontrol cihazının şeritlerinde birleştirdik ve asit ve tümör bölgelerini ayrı ayrı analiz ettik. Dizilemeden sonra [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp çift uçlu (PE), Quebec genomu; Tümör ve asit için sırasıyla hücre başına ortalama 73.488 ve 41.378 okuma elde ettik. CellSNP ve Vireo'yu (53) kullandık (GRCh38 tarafından sağlanan ortak insan SNP'si (VCF) bir donör kimliğine atanır. Atanmamış hücreleri ve çift olarak tanımlanan hücreleri hariç tutarak ve asit ve tümör örnekleri arasında donörleri eşleştirerek hastanın genotip durumunun (IBS) en yakın kimliğini (IBS) çıkarmak için SNPRelate'i kullandık (54). Bu göreve dayanarak, sonraki analizler için tümör ve asitte bol miktarda hücre temsili olan üç vakayı tuttuk. Scater (55) ve scran (56) BioConductor paketlemesinde bir kütle filtreleme adımı gerçekleştirdikten sonra, analiz için 6975 hücre (sırasıyla tümör ve asitten 2792 ve 4183 hücre) elde ettik. igraph'ın (57) paylaşılan en yakın komşu ağının (SNN) Louvain kümelemesini kullandık. Jaccard mesafesine göre, ifadeye göre hücreleri kümelemek esas alınmıştır. Kümeler, işaretleyici gen ifadesine dayalı olarak varsayımsal hücre tiplerine manuel olarak etiketlenmiş ve t-SNE ile görselleştirilmiştir. Sitotoksik T hücreleri, düşük ribozomal protein ifadesine sahip alt kümeler hariç tutularak, CD8A ve GZMA ifadesi ile tanımlanmıştır. Izar ve ark. (16) tarafından yayınlanan verilere, t-SNE yerleştirmeleri de dahil olmak üzere, eriştik; bu sayede bağışıklık hücresi işaretleyicileri ve NNMT ifadesi arasındaki ifade örtüşmesi kontrol edilebilir.
PBMC'ler, Ficoll gradyan yoğunluk santrifüjü ile lökosit ayırma ürünlerinden (STEMCELL Technologies) ayrıldı. CD3+ hücreleri, CD3 boncukları (Miltenyi) kullanılarak PBMC'lerden izole edildi. MNA varlığında veya yokluğunda, CD3+ hücreleri plakaya bağlı CD3 (5 μg/ml), çözünür CD28 (3 μg/ml) ve IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ile aktive edildi. Genişletmenin son gününde, canlılık (Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor450, eBioscience) ve proliferasyon (123 sayım eBoncukları, Thermo Fisher Scientific) akış sitometrisi ile değerlendirildi. Hücreleri GolgiStop ile 4 saat boyunca PMA (20 ng/ml) ve iyonomisin (1 μg/ml) ile uyararak efektör fonksiyonunu değerlendirin ve CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) ve TNFα-fluorescein izotiyosiyanat (FITC) (MAb11, BD) izleyin. qPCR ve ChIP hücrelerini 4 saat boyunca PMA (20 ng/ml) ve iyonomisin (1 μg/ml) ile uyarın. ELISA süpernatantı, 4 saatlik PMA (20 ng/ml) ve iyonomisin (1 μg/ml) uyarımından önce ve sonra toplandı.
Üreticinin protokolünü izleyerek RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) kullanarak RNA'yı izole edin. Numuneyi homojenleştirmek için QIAshredder (QIAGEN) kullanın. Tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezlemek için yüksek kapasiteli RNA'dan cDNA'ya kiti (Thermo Fisher Scientific) kullanın. Gen ekspresyonunu (üreticinin protokolüne göre) aşağıdaki problarla ölçmek için TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) kullanın: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliseroldehit-3-fosfat kapalı hidrojen (GAPDH)] ve Hs01010726_m1 (SLC22A2). Örnekler, MicroAmp optik film ile birlikte MicroAmp hızlı optik 96 kuyucuklu reaksiyon plakasında (Applied Biosystems) StepOnePlus gerçek zamanlı PCR sistemi (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) üzerinde çalıştırıldı. 35'i aşan herhangi bir Ct değeri, tespit eşiğinin üzerinde kabul edilir ve tespit edilemez olarak işaretlenir.
Daha önce açıklandığı gibi ChIP'i gerçekleştirin (58). Kısaca, hücreler formaldehit (nihai konsantrasyon %1,42) ile muamele edildi ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Buz üzerinde 10 dakika boyunca takviyeli şişme tamponu (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl ve %0,1 NP-40) kullanın, ardından açıklandığı gibi immünopresipitasyon tamponunda yeniden süspansiyon haline getirin (58). Numune daha sonra aşağıdaki döngülerle sonikasyona tabi tutuldu: 10 döngü (20 adet 1 saniyelik darbe) ve 40 saniyelik statik süre. ChIP sınıfı immünoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) ve SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antikorlarını numune ile 4°C'de çalkalayarak gece boyunca inkübe edin. Protein A boncuklarını (Thermo Fisher Scientific) örnekle birlikte 4°C'de hafifçe çalkalayarak 1 saat inkübe edin, ardından DNA'yı zenginleştirmek için Chelex boncuklarını (Bio-Rad) kullanın ve protein sindirimi için proteinaz K'yı (Thermo Fisher) kullanın. TNFα promotörü PCR ile tespit edildi: ileri, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ters, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp ürün). Görüntüler Image Lab (Bio-Rad) ile üretildi ve ImageJ yazılımı kullanılarak nicelendirildi.
Hücre kültürü süpernatantı yukarıda açıklandığı gibi toplandı. Belirleme, insan TNFα ELISA kiti (Invitrogen), insan IL-2 ELISA kiti (Invitrogen) ve insan IFN-γ ELISA kiti (Abcam) üreticilerinin prosedürlerine göre gerçekleştirildi. Üretici protokolüne göre, süpernatant TNFα ve IL-2'yi tespit etmek için 1:100, IFN-γ'yi tespit etmek için ise 1:3 oranında seyreltildi. Absorbans ölçümü için EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) kullanıldı (450 nm).
PBMC'ler, Ficoll gradyan yoğunluk santrifüjü ile lökosit ayırma ürünlerinden (STEMCELL Technologies) ayrıldı. CD3+ hücreleri, CD3 boncukları (Miltenyi) kullanılarak PBMC'lerden izole edildi. MNA varlığında veya yokluğunda, CD3+ hücreleri, plakaya bağlı CD3 (5 μg/ml), çözünür CD28 (3 μg/ml) ve IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ile 3 gün boyunca aktive edildi. 3 gün sonra hücreler toplandı ve %0,9'luk salin ile yıkandı ve pelet hızla donduruldu. Hücre sayımı, 123 sayım eBeads kullanılarak akış sitometrisi (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigürasyonu) ile gerçekleştirildi.
Yukarıda açıklandığı gibi metabolitleri ekstrakte edin. Kurutulmuş ekstrakt, 4000 hücre eşdeğeri/μl konsantrasyonunda yeniden çözündürüldü. Numuneyi ters fazlı kromatografi (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ve CORTECS T3 kolonu (2,1×150 mm, partikül boyutu 1,6 μm, gözenek boyutu 120 Å; #186008500, Waters) ile analiz edin. Elektrospray iyonizasyonunun pozitif modda çalıştığı polar kütle spektrometresi (6470, Agilent) kullanıldı. Mobil faz A, %0,1 formik asit (H2O içinde), mobil faz B ise %90 asetonitril, %0,1 formik asittir. LC gradyanı %100 A için 0 ila 2 dakika, %99 B için 2 ila 7,1 dakika ve %99 B için 7,1 ila 8 dakikadır. Daha sonra kolon, 0,6 ml/dakika akış hızında 3 dakika boyunca mobil faz A ile yeniden dengelenir. Akış hızı 0,4 ml/dakikadır ve kolon haznesi 50°C'ye ısıtılır. Tutunma süresini (RT) ve dönüşümü (RT = 0,882 dakika, dönüşüm 1 = 137→94,1, dönüşüm 2 = 137→92, dönüşüm 3 = 137→78) belirlemek için MNA'nın saf kimyasal standardı (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) kullanılır. Üç geçişin de doğru tutunma süresinde gerçekleşmesi durumunda, özgüllüğü sağlamak için kantifikasyon için geçiş 1 kullanılır. MNA'nın (Toronto Research Chemical Company) standart eğrisi, stok çözeltinin (1 mg/ml) altı seri seyreltmesiyle 0,1, 1,0, 10 ve 100 ng/ml ve sırasıyla 1,0 ve 10 μg/ml sıvı standartları elde edilerek oluşturulmuştur. Tespit limiti 1 ng/ml olup, doğrusal yanıt 10 ng/ml ile 10 μg/ml arasındadır. LC/MS analizi için her bir enjeksiyonda iki mikrolitre numune ve standart kullanılır ve analiz platformunun stabilitesini sağlamak için her sekiz enjeksiyonda bir karışık kalite kontrol numunesi çalıştırılır. Tüm MNA ile işlem görmüş hücre numunelerinin MNA yanıtları, testin doğrusal aralığı içindeydi. Veri analizi, MassHunter kantitatif analiz yazılımı (v9.0, Agilent) kullanılarak yapılmıştır.
İkinci nesil αFR-CAR yapısı Song ve ark. (59)'dan alınmıştır. Kısaca, yapı şu içerikleri içermektedir: CD8a lider dizisi, insan αFR'ye özgü tek zincirli değişken fragman, CD8a menteşe ve transmembran bölgesi, CD27 hücre içi alanı ve CD3z hücre içi alanı. Tam CAR dizisi GenScript tarafından sentezlendi ve daha sonra transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için kullanılan GFP ekspresyon kasetinin yukarısına ikinci nesil lentiviral ekspresyon vektörüne klonlandı.
Lentivirüs, HEK293T hücrelerinin (American Type Culture Collection (ATCC)) transfeksiyonuyla üretilir; %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 PenStrep içeren Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında yetiştirilir ve CAR-GFP vektörü ve paketleme plazmidleri (psPAX2 ve pMD2.G, Addgene) lipofeksiyon amini (Sigma-Aldrich) kullanılarak üretilir. Virüs içeren süpernatant, transfeksiyondan 48 ve 72 saat sonra toplanır, filtrelenir ve ultra santrifüjleme ile konsantre edilir. Konsantre viral süpernatant, transdüksiyona kadar -80°C'de saklanır.
PBMC'ler, Ficoll gradyan yoğunluk santrifüjü ile sağlıklı donör lökosit ayırma ürünlerinden (STEMCELL Technologies) ayrılır. PBMC'lerden CD8+ hücrelerini izole etmek için pozitif seçim CD8 mikro boncukları (Miltenyi) kullanılır. T hücreleri TransAct (Miltenyi) ve TexMACS ortamında [Miltenyi; %3 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu, %1 PenStrep ve IL-2 (300 U/ml) ile desteklenmiş] uyarılır. Uyarımdan 24 saat sonra, T hücreleri lentivirüs ile transdüksiyona tabi tutulur (10⁶ hücre başına 10 μl konsantre virüs süpernatantı). Transdüksiyondan 1 ila 3 gün sonra Cytek Aurora'da (FSC (İleri Saçılım)/SSC (Yan Saçılım), Singlet, GFP+) hücrelerin GFP ekspresyonu değerlendirilerek en az %30'luk bir transdüksiyon verimliliği gösterilir.
CAR-T hücreleri, aşağıdaki koşullar altında 24 saat boyunca Immunocult'ta (STEMCELL Technologies; %1 PenStrep ile desteklenmiş) kültüre edildi: işlenmemiş, 250 μM adenozin veya 10 mM MNA ile işlenmiş. Ön işlemden sonra, CAR-T hücreleri PBS ile yıkandı ve 20.000 SK-OV-3 hücresi [ATCC; %10 FBS ve %1 PenStrep ile desteklenmiş McCoy 5A ortamında (Sigma-Aldrich) 10:1 oranında] ile birleştirildi. 1'lik efektör/hedef oranı, desteklenmiş Immunocult ortamında üçlü olarak çoğaltıldı. SK-OV-3 hücreleri ve digitalis saponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) ile lizize edilmiş SK-OV-3 hücreleri sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak kullanıldı. 24 saatlik ortak kültürleme sonrasında süpernatant toplandı ve laktat dehidrogenaz (LDH) üretici talimatlarına göre ölçüldü (LDH Glo Sitotoksisite Test Kiti, Promega). LDH süpernatantı, LDH tamponunda 1:50 oranında seyreltildi. Öldürme yüzdesi aşağıdaki formül kullanılarak ölçüldü: öldürme yüzdesi = düzeltme yüzdesi / maksimum öldürme oranı x 100%, burada düzeltme yüzdesi = sadece ortak kültür T hücreleri ve maksimum öldürme oranı = pozitif kontrol - negatif kontrol.
Metinde veya materyaller ve yöntemler bölümünde açıklandığı gibi, istatistiksel analiz için GraphPad Prism 8, Microsoft Excel veya R v3.6.0 kullanın. Aynı hastadan birden fazla örnek alındığında (örneğin asit ve tümör), uygun şekilde eşleştirilmiş t testi kullanın veya hastayı doğrusal veya genelleştirilmiş bir modelde rastgele bir etki olarak dahil edin. Metabolomik analiz için önem testi üçlü olarak gerçekleştirilir.
Bu makaleye ait ek materyaller için lütfen şu adresi ziyaret edin: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Bu, Creative Commons Atıf-Ticari Olmayan Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir; bu lisans, son kullanımın ticari kazanç amacı taşımaması ve orijinal çalışmanın doğru olması şartıyla, herhangi bir ortamda kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin verir. Referans.
Not: Sizden yalnızca e-posta adresinizi istiyoruz, böylece sayfaya tavsiye ettiğiniz kişi e-postayı görmek istediğini ve bunun spam olmadığını anlasın. E-posta adreslerinizi hiçbir şekilde kaydetmeyeceğiz.
Bu soru, ziyaretçi olup olmadığınızı test etmek ve otomatik spam gönderimini önlemek için kullanılır.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA, T hücrelerinin bağışıklık sisteminin baskılanmasına katkıda bulunur ve insan kanserinin tedavisinde potansiyel bir immünoterapi hedefi olarak öne çıkar.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA, T hücrelerinin bağışıklık sisteminin baskılanmasına katkıda bulunur ve insan kanserinin tedavisinde potansiyel bir immünoterapi hedefi olarak öne çıkar.
©2021 Amerikan Bilimi İlerletme Derneği. her hakkı saklıdır. AAAS, HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ve COUNTER'ın ortağıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.