Mantar önleyici bir madde ve yaygın bir diyet katkı maddesi olan propiyonik asit (PPA), farelerde gastrointestinal disfonksiyonla birlikte anormal nörogelişime neden olduğu gösterilmiştir; bu durum bağırsak disbiyozundan kaynaklanabilir. Diyetle alınan PPA maruziyeti ile bağırsak mikrobiyotası disbiyozu arasında bir bağlantı olduğu öne sürülmüştür, ancak doğrudan araştırılmamıştır. Burada, disbiyoza yol açabilecek PPA ile ilişkili bağırsak mikrobiyotası bileşimindeki değişiklikleri araştırdık. Mikrobiyal bileşim ve bakteriyel metabolik yollardaki farklılıkları değerlendirmek için, tedavi edilmemiş bir diyetle (n=9) ve PPA ile zenginleştirilmiş bir diyetle (n=13) beslenen farelerin bağırsak mikrobiyomları uzun menzilli metagenomik sekanslama kullanılarak sekanslandı. Diyetle alınan PPA, daha önce PPA üretiminde rol oynadığı düşünülen çeşitli Bacteroides, Prevotella ve Ruminococcus türleri de dahil olmak üzere önemli taksonların bolluğunda bir artışla ilişkilendirildi. PPA'ya maruz kalan farelerin mikrobiyomlarında ayrıca lipid metabolizması ve steroid hormon biyosentezi ile ilgili daha fazla yol bulundu. Sonuçlarımız, PPA'nın bağırsak mikrobiyotasını ve ilişkili metabolik yolları değiştirebileceğini göstermektedir. Gözlemlenen bu değişiklikler, tüketim için güvenli olarak sınıflandırılan koruyucuların bağırsak mikrobiyotasının bileşimini ve dolayısıyla insan sağlığını etkileyebileceğini vurgulamaktadır. Bunlar arasından, analiz edilen sınıflandırma düzeyine bağlı olarak P, G veya S seçilir. Yanlış pozitif sınıflandırmaların etkisini en aza indirmek için, 1e-4 (1/10.000 okuma) minimum göreceli bolluk eşiği benimsenmiştir. İstatistiksel analizden önce, Bracken tarafından bildirilen göreceli bolluklar (fraction_total_reads), merkezlenmiş log-oran (CLR) dönüşümü (Aitchison, 1982) kullanılarak dönüştürülmüştür. CLR yöntemi, ölçekten bağımsız olması ve seyrek olmayan veri kümeleri için yeterli olması nedeniyle veri dönüşümü için seçilmiştir (Gloor vd., 2017). CLR dönüşümü doğal logaritmayı kullanır. Bracken tarafından bildirilen sayım verileri, göreceli log ifadesi (RLE) (Anders ve Huber, 2010) kullanılarak normalize edilmiştir. Şekiller, matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 ve ardışık logaritmaların bir kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuştur (Gloor vd., 2017). 0.12.2 ve stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier vd., 2022). Her örnek için Bacillus/Bacteroidetes oranı, normalize edilmiş bakteri sayımları kullanılarak hesaplandı. Tablolarda bildirilen değerler 4 ondalık basamağa yuvarlanmıştır. Simpson çeşitlilik indeksi, KrakenTools v. 1.2 paketinde (Lu vd., 2022) bulunan alpha_diversity.py komut dosyası kullanılarak hesaplandı. Komut dosyasında Bracken raporu ve -an parametresi için Simpson indeksi “Si” verilmiştir. Bolluktaki anlamlı farklılıklar, ortalama CLR farklarının ≥ 1 veya ≤ -1 olması olarak tanımlandı. ±1'lik bir ortalama CLR farkı, bir örnek tipinin bolluğunda 2,7 katlık bir artışı gösterir. İşaret (+/-), taksonun sırasıyla PPA örneğinde ve kontrol örneğinde daha bol olup olmadığını gösterir. İstatistiksel anlamlılık, Mann-Whitney U testi kullanılarak belirlendi (Virtanen vd., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini ve Hochberg, 1995; Seabold ve Perktold, 2010) kullanıldı ve çoklu test düzeltmesi için Benjamini-Hochberg prosedürü uygulandı. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için eşik değer olarak düzeltilmiş p değeri ≤ 0,05 kullanıldı.
İnsan mikrobiyomu sıklıkla “vücudun son organı” olarak adlandırılır ve insan sağlığında hayati bir rol oynar (Baquero ve Nombela, 2012). Özellikle bağırsak mikrobiyomu, sistem genelindeki etkisi ve birçok temel fonksiyondaki rolüyle bilinir. Bağırsakta bol miktarda bulunan kommensal bakteriler, birden fazla ekolojik nişi işgal eder, besinleri kullanır ve potansiyel patojenlerle rekabet eder (Jandhyala vd., 2015). Bağırsak mikrobiyotasının çeşitli bakteri bileşenleri, vitaminler gibi temel besinleri üretebilir ve sindirimi destekleyebilir (Rowland vd., 2018). Bakteriyel metabolitlerin ayrıca doku gelişimini etkilediği ve metabolik ve bağışıklık yollarını güçlendirdiği gösterilmiştir (Heijtz vd., 2011; Yu vd., 2022). İnsan bağırsak mikrobiyomunun bileşimi son derece çeşitlidir ve diyet, cinsiyet, ilaçlar ve sağlık durumu gibi genetik ve çevresel faktörlere bağlıdır (Kumbhare vd., 2019).
Anne beslenmesi, fetüs ve yenidoğan gelişiminin kritik bir bileşenidir ve gelişimi etkileyebilecek bileşiklerin olası bir kaynağıdır (Bazer vd., 2004; Innis, 2014). Bu ilgi çekici bileşiklerden biri, bakteriyel fermantasyondan elde edilen kısa zincirli bir yağ asidi yan ürünü ve gıda katkı maddesi olan propiyonik asittir (PPA) (den Besten vd., 2013). PPA, antibakteriyel ve antifungal özelliklere sahiptir ve bu nedenle gıda koruyucu olarak ve endüstriyel uygulamalarda küf ve bakteri büyümesini engellemek için kullanılır (Wemmenhove vd., 2016). PPA'nın farklı dokularda farklı etkileri vardır. Karaciğerde, PPA, makrofajlardaki sitokin ekspresyonunu etkileyerek anti-enflamatuar etkilere sahiptir (Kawasoe vd., 2022). Bu düzenleyici etki, diğer bağışıklık hücrelerinde de gözlemlenmiş ve enflamasyonun azalmasına yol açmıştır (Haase vd., 2021). Bununla birlikte, beyinde bunun tersi bir etki gözlemlenmiştir. Önceki çalışmalar, PPA maruziyetinin farelerde otizm benzeri davranışlara neden olduğunu göstermiştir (El-Ansary vd., 2012). Diğer çalışmalar ise PPA'nın beyinde gliyozise neden olabileceğini ve pro-enflamatuar yolları aktive edebileceğini göstermiştir (Abdelli vd., 2019). PPA zayıf bir asit olduğu için bağırsak epitelinden kan dolaşımına geçebilir ve böylece kan-beyin bariyeri ve plasenta dahil olmak üzere kısıtlayıcı bariyerleri aşabilir (Stinson vd., 2019), bu da PPA'nın bakteriler tarafından üretilen düzenleyici bir metabolit olarak önemini vurgulamaktadır. PPA'nın otizm için bir risk faktörü olarak potansiyel rolü şu anda araştırılmakta olsa da, otizmli bireyler üzerindeki etkileri nöral farklılaşmayı tetiklemenin ötesine geçebilir.
İshal ve kabızlık gibi gastrointestinal semptomlar, nörogelişimsel bozuklukları olan hastalarda yaygındır (Cao vd., 2021). Önceki çalışmalar, otizm spektrum bozukluğu (ASD) olan hastaların mikrobiyomunun sağlıklı bireylerden farklı olduğunu ve bağırsak mikrobiyotası disbiyozunun varlığını gösterdiğini ortaya koymuştur (Finegold vd., 2010). Benzer şekilde, inflamatuar bağırsak hastalıkları, obezite, Alzheimer hastalığı vb. olan hastaların mikrobiyom özellikleri de sağlıklı bireylerden farklıdır (Turnbaugh vd., 2009; Vogt vd., 2017; Henke vd., 2019). Bununla birlikte, bugüne kadar bağırsak mikrobiyomu ile nörolojik hastalıklar veya semptomlar arasında nedensel bir ilişki kurulmamıştır (Yap vd., 2021), ancak bazı bakteri türlerinin bu hastalık durumlarının bazılarında rol oynadığı düşünülmektedir. Örneğin, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio ve diğer cinsler otizmli hastaların mikrobiyotasında daha bol miktarda bulunur (Tomova vd., 2015; Golubeva vd., 2017; Cristiano vd., 2018; Zurita vd., 2020). Özellikle, bu cinslerin bazı üye türlerinin PPA üretimiyle ilişkili genlere sahip olduğu bilinmektedir (Reichardt vd., 2014; Yun ve Lee, 2016; Zhang vd., 2019; Baur ve Dürre, 2023). PPA'nın antimikrobiyal özellikleri göz önüne alındığında, bolluğunun artması PPA üreten bakterilerin büyümesi için faydalı olabilir (Jacobson vd., 2018). Dolayısıyla, PFA açısından zengin bir ortam, gastrointestinal patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikrobiyotasında değişikliklere yol açabilir ve bu da gastrointestinal semptomlara yol açabilecek potansiyel faktörler olabilir.
Mikrobiyom araştırmalarında temel bir soru, mikrobiyal bileşimdeki farklılıkların altta yatan hastalıkların nedeni mi yoksa belirtisi mi olduğudur. Diyet, bağırsak mikrobiyomu ve nörolojik hastalıklar arasındaki karmaşık ilişkiyi aydınlatmanın ilk adımı, diyetin mikrobiyal bileşim üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu amaçla, PPA açısından zengin veya PPA açısından fakir bir diyetle beslenen farelerin yavrularının bağırsak mikrobiyomlarını karşılaştırmak için uzun okumalı metagenomik dizileme kullandık. Yavrular anneleriyle aynı diyetle beslendi. PPA açısından zengin bir diyetin, özellikle PPA metabolizması ve/veya PPA üretimiyle ilgili olanlar olmak üzere, bağırsak mikrobiyal bileşiminde ve mikrobiyal fonksiyonel yollarda değişikliklere yol açacağını varsaydık.
Bu çalışmada, Orta Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (UCF-IACUC) yönergelerine uygun olarak (Hayvan Kullanım İzin Numarası: PROTO202000002), glial hücrelere özgü GFAP promotörünün kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) aşırı ifade eden FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgenik fareler (Jackson Laboratories) kullanılmıştır. Fareler sütten kesildikten sonra, her kafeste her cinsiyetten 1-5 fare olacak şekilde ayrı ayrı kafeslere yerleştirilmiştir. Fareler, ya saflaştırılmış kontrol diyeti (modifiye açık etiketli standart diyet, %16 yağ) ya da sodyum propiyonat takviyeli diyet (modifiye açık etiketli standart diyet, %16 yağ, 5000 ppm sodyum propiyonat içeren) ile serbestçe beslenmiştir. Kullanılan sodyum propiyonat miktarı, toplam gıda ağırlığının kilogramı başına 5000 mg PFA'ya eşdeğerdi. Bu, gıda koruyucu olarak kullanımına onay verilen en yüksek PPA konsantrasyonudur. Bu çalışmaya hazırlık olarak, ebeveyn fareler çiftleşmeden 4 hafta önce her iki diyetle de beslendi ve anne farenin gebeliği boyunca bu beslenmeye devam edildi. Yavru fareler [22 fare, 9 kontrol (6 erkek, 3 dişi) ve 13 PPA (4 erkek, 9 dişi)] sütten kesildikten sonra 5 ay boyunca anne farelerle aynı diyetle beslenmeye devam edildi. Yavru fareler 5 aylıkken kurban edildi ve bağırsak dışkı içerikleri toplandı ve başlangıçta 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinde -20°C'de saklandı, daha sonra konak DNA'sı tükenene ve mikrobiyal nükleik asitler çıkarılana kadar -80°C'lik bir dondurucuya aktarıldı.
Konakçı DNA'sı, değiştirilmiş bir protokole göre uzaklaştırıldı (Charalampous vd., 2019). Kısaca, dışkı içeriği 500 µl InhibitEX'e (Qiagen, Kat#/ID: 19593) aktarıldı ve dondurularak saklandı. Her ekstraksiyon için en fazla 1-2 dışkı peleti işlendi. Daha sonra dışkı içeriği, bir bulamaç oluşturmak için tüpün içinde plastik bir havan kullanılarak mekanik olarak homojenize edildi. Numuneler 10.000 RCF'de 5 dakika veya numuneler çökelene kadar santrifüjlendi, ardından süpernatant aspire edildi ve pelet 250 µl 1× PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Ökaryotik hücre zarlarını gevşetmek için numuneye deterjan olarak 250 µl %4,4 saponin çözeltisi (TCI, ürün numarası S0019) eklendi. Numuneler pürüzsüz olana kadar yavaşça karıştırıldı ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Daha sonra, ökaryotik hücreleri parçalamak için örneğe 350 μl nükleaz içermeyen su eklendi, 30 saniye inkübe edildi ve ardından 12 μl 5 M NaCl eklendi. Örnekler daha sonra 5 dakika boyunca 6000 RCF'de santrifüjlendi. Süpernatant aspire edildi ve pelet 100 μl 1X PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Konak DNA'sını uzaklaştırmak için 100 μl HL-SAN tamponu (12.8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nükleaz içermeyen su) ve 10 μl HL-SAN enzimi (ArticZymes P/N 70910-202) eklendi. Numuneler pipetleme yoluyla iyice karıştırıldı ve Eppendorf™ ThermoMixer C cihazında 37 °C'de 30 dakika boyunca 800 rpm hızda inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, 3 dakika boyunca 6000 RCF'de santrifüjlendi ve 800 µl ve 1000 µl 1X PBS ile iki kez yıkandı. Son olarak, çökelti 100 µl 1X PBS içinde tekrar süspansiyon haline getirildi.
Toplam bakteri DNA'sı, New England Biolabs Monarch Genomik DNA Saflaştırma Kiti (New England Biolabs, Ipswich, MA, Kat# T3010L) kullanılarak izole edildi. Kit ile birlikte verilen standart işletim prosedürü biraz değiştirildi. Son elüsyon için işlemden önce nükleaz içermeyen suyu 60°C'de inkübe edin ve muhafaza edin. Her örneğe 10 µl Proteinaz K ve 3 µl RNaz A ekleyin. Ardından 100 µl Hücre Lizis Tamponu ekleyin ve nazikçe karıştırın. Örnekler daha sonra Eppendorf™ ThermoMixer C'de 56°C'de ve 1400 rpm'de en az 1 saat ve en fazla 3 saat inkübe edildi. İnkübe edilmiş örnekler 12.000 RCF'de 3 dakika santrifüjlendi ve her örnekten elde edilen süpernatant, 400 µL bağlama çözeltisi içeren ayrı bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarıldı. Tüpler daha sonra 1 saniyelik aralıklarla 5-10 saniye boyunca darbeli vorteksleme işlemine tabi tutuldu. Her numunenin tüm sıvı içeriği (yaklaşık 600-700 µL), akışlı bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir filtre kartuşuna aktarıldı. Tüpler, ilk DNA bağlanmasına izin vermek için 3 dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjlendi ve ardından kalan sıvıyı uzaklaştırmak için 1 dakika boyunca 12000 RCF'de santrifüjlendi. Numune kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarıldı ve ardından iki kez yıkandı. İlk yıkama için, her tüpe 500 µL yıkama tamponu eklendi. Tüp 3-5 kez ters çevrildi ve ardından 1 dakika boyunca 12000 RCF'de santrifüjlendi. Toplama tüpündeki sıvı atıldı ve filtre kartuşu aynı toplama tüpüne geri yerleştirildi. İkinci yıkama için, ters çevirmeden filtreye 500 µL yıkama tamponu eklendi. Numuneler 1 dakika boyunca 12000 RCF'de santrifüjlendi. Filtreyi 1,5 mL'lik bir LoBind® tüpüne aktarın ve 100 µL önceden ısıtılmış nükleaz içermeyen su ekleyin. Filtreler oda sıcaklığında 1 dakika bekletildikten sonra 12.000 RCF'de 1 dakika santrifüj edildi. Elde edilen DNA -80°C'de saklandı.
DNA konsantrasyonu, Qubit™ 4.0 Fluorometre kullanılarak ölçüldü. DNA, üreticinin talimatlarına göre Qubit™ 1X dsDNA Yüksek Hassasiyet Kiti (Kat. No. Q33231) kullanılarak hazırlandı. DNA fragman uzunluğu dağılımı, Agilent™ 4150 veya 4200 TapeStation kullanılarak ölçüldü. DNA, Agilent™ Genomik DNA Reaktifleri (Kat. No. 5067-5366) ve Genomik DNA ScreenTape (Kat. No. 5067-5365) kullanılarak hazırlandı. Kütüphane hazırlığı, üreticinin talimatlarına göre Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Hızlı PCR Barkodlama Kiti (SQK-RPB004) kullanılarak gerçekleştirildi. DNA, Min106D akış hücresi (R 9.4.1) ile bir ONT GridION™ Mk1 sekanslayıcı kullanılarak dizilendi. Dizileme ayarları şu şekildeydi: yüksek doğrulukta baz çağrısı, minimum q değeri 9, barkod kurulumu ve barkod kırpma. Numuneler 72 saat boyunca dizilendi, ardından baz çağrısı verileri daha fazla işleme ve analiz için gönderildi.
Biyoinformatik işleme, daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak gerçekleştirildi (Greenman vd., 2024). Dizilemeden elde edilen FASTQ dosyaları, her örnek için ayrı dizinlere ayrıldı. Biyoinformatik analizinden önce, veriler aşağıdaki işlem hattı kullanılarak işlendi: Öncelikle, örneklerin FASTQ dosyaları tek bir FASTQ dosyasına birleştirildi. Daha sonra, 1000 bp'den kısa okumalar, yalnızca –min_length 1000 parametresi değiştirilerek Filtlong v. 0.2.1 kullanılarak filtrelendi (Wick, 2024). Daha fazla filtrelemeden önce, okuma kalitesi NanoPlot v. 1.41.3 kullanılarak aşağıdaki parametrelerle kontrol edildi: –fastq –plots dot –N50 -o
Taksonomik sınıflandırma için, okumalar ve birleştirilmiş kontigler Kraken2 v. 2.1.2 (Wood vd., 2019) kullanılarak sınıflandırıldı. Okumalar ve birleştirmeler için sırasıyla raporlar ve çıktı dosyaları oluşturun. Okumaları ve birleştirmeleri analiz etmek için –use-names seçeneğini kullanın. Okuma segmentleri için –gzip-compressed ve –paired seçenekleri belirtilmiştir. Metagenomlardaki taksonların göreceli bolluğu Bracken v. 2.8 (Lu vd., 2017) kullanılarak tahmin edildi. İlk olarak, aşağıdaki parametrelerle bracken-build kullanarak 1000 baz içeren bir kmer veritabanı oluşturduk: -d
Gen açıklaması ve göreceli bolluk tahmini, Maranga ve ark. tarafından tanımlanan protokolün değiştirilmiş bir versiyonu kullanılarak gerçekleştirildi (Maranga ve ark., 2023). İlk olarak, SeqKit v. 2.5.1 (Shen ve ark., 2016) kullanılarak tüm derlemelerden 500 bp'den kısa kontigler çıkarıldı. Seçilen derlemeler daha sonra bir pan-metagenom halinde birleştirildi. Açık okuma çerçeveleri (ORF'ler), aşağıdaki parametrelerle Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3'ün paralel bir versiyonu) kullanılarak tanımlandı: -d
Genler, gen yolak bolluklarını karşılaştırmak için ilk olarak eggNOG tarafından atanan Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) ortolog (KO) tanımlayıcılarına göre gruplandırıldı. Analizden önce, gen susturması olmayan veya birden fazla gen susturması olan genler çıkarıldı. Daha sonra, her örnek için her bir KO'nun ortalama bolluğu hesaplandı ve istatistiksel analiz yapıldı. PPA metabolizması genleri, KEGG'e göre propiyonat metabolizmasında rol oynadığını gösteren KEGG_Pathway sütununda ko00640 satırına sahip herhangi bir gen olarak tanımlandı. PPA üretimiyle ilişkili olarak tanımlanan genler Ek Tablo 1'de listelenmiştir (Reichardt vd., 2014; Yang vd., 2017). Her örnek tipinde anlamlı derecede daha bol bulunan PPA metabolizması ve üretim genlerini belirlemek için permütasyon testleri yapıldı. Analiz edilen her gen için bin permütasyon gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için kesme noktası olarak 0,05'lik bir p değeri kullanıldı. Küme içindeki temsilci genlerin açıklamalarına dayanarak, küme içindeki bireysel genlere fonksiyonel açıklamalar atandı. PPA metabolizması ve/veya PPA üretimi ile ilişkili taksonlar, Kraken2 çıktı dosyalarındaki kontig kimliklerinin, eggNOG kullanılarak yapılan fonksiyonel açıklama sırasında korunan aynı kontig kimlikleriyle eşleştirilmesiyle belirlenebilir. Anlamlılık testi, daha önce açıklanan Mann-Whitney U testi kullanılarak gerçekleştirildi. Çoklu test düzeltmesi, Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak yapıldı. İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için kesme noktası olarak ≤ 0,05'lik bir p değeri kullanıldı.
Farelerin bağırsak mikrobiyomunun çeşitliliği Simpson çeşitlilik indeksi kullanılarak değerlendirildi. Cins ve tür çeşitliliği açısından kontrol ve PPA örnekleri arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (cins için p değeri: 0,18, tür için p değeri: 0,16) (Şekil 1). Daha sonra mikrobiyal bileşim, temel bileşen analizi (PCA) kullanılarak karşılaştırıldı. Şekil 2, örneklerin filumlarına göre kümelenmesini göstermekte olup, PPA ve kontrol örnekleri arasında mikrobiyomların tür bileşiminde farklılıklar olduğunu göstermektedir. Bu kümelenme cins düzeyinde daha az belirgindi ve bu da PPA'nın belirli bakterileri etkilediğini düşündürmektedir (Ek Şekil 1).
Şekil 1. Fare bağırsak mikrobiyomunun cins ve tür bileşiminin alfa çeşitliliği. PPA ve kontrol örneklerinde cinslerin (A) ve türlerin (B) Simpson çeşitlilik indekslerini gösteren kutu grafikleri. Anlamlılık, Mann-Whitney U testi kullanılarak belirlendi ve çoklu düzeltme Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak yapıldı. ns, p değeri anlamlı değil (p>0,05).
Şekil 2. Tür düzeyinde fare bağırsak mikrobiyom bileşiminin temel bileşen analizinin sonuçları. Temel bileşen analizi grafiği, örneklerin ilk iki temel bileşen üzerindeki dağılımını göstermektedir. Renkler örnek tipini belirtir: PPA'ya maruz kalan fareler mor, kontrol fareleri ise sarıdır. Birinci ve ikinci temel bileşenler sırasıyla x eksenine ve y eksenine çizilmiştir ve açıklanan varyans oranları olarak ifade edilmiştir.
RLE dönüştürülmüş sayım verileri kullanılarak, kontrol ve PPA farelerinde ortanca Bacteroidetes/Bacilli oranında anlamlı bir azalma gözlemlendi (kontrol: 9,66, PPA: 3,02; p-değeri = 0,0011). Bu fark, PPA farelerinde kontrollere kıyasla Bacteroidetes'in daha fazla bulunmasından kaynaklanıyordu, ancak fark anlamlı değildi (kontrol ortalama CLR: 5,51, PPA ortalama CLR: 6,62; p-değeri = 0,054), Bacteroidetes bolluğu ise benzerdi (kontrol ortalama CLR: 7,76, PPA ortalama CLR: 7,60; p-değeri = 0,18).
Bağırsak mikrobiyomunun taksonomik üyelerinin bolluğunun analizi, PPA ve kontrol örnekleri arasında 1 filum ve 77 türün önemli ölçüde farklılık gösterdiğini ortaya koymuştur (Ek Tablo 2). PPA örneklerindeki 59 türün bolluğu kontrol örneklerindekinden önemli ölçüde daha yüksekken, kontrol örneklerindeki sadece 16 türün bolluğu PPA örneklerindekinden daha yüksekti (Şekil 3).
Şekil 3. PPA ve kontrol farelerinin bağırsak mikrobiyomundaki taksonların farklı bolluğu. Volkan grafikleri, PPA ve kontrol örnekleri arasındaki cins (A) veya tür (B) bolluğundaki farklılıkları göstermektedir. Gri noktalar, takson bolluğunda anlamlı bir fark olmadığını göstermektedir. Renkli noktalar, bollukta anlamlı farklılıkları göstermektedir (p değeri ≤ 0,05). Örnek tipleri arasında bollukta en büyük farklılıklara sahip ilk 20 takson sırasıyla kırmızı ve açık mavi (kontrol ve PPA örnekleri) ile gösterilmiştir. Sarı ve mor noktalar, kontrol veya PPA örneklerinde kontrollere göre en az 2,7 kat daha fazla bolluk göstermiştir. Siyah noktalar, ortalama CLR farkları -1 ile 1 arasında olan, anlamlı derecede farklı bolluklara sahip taksonları temsil etmektedir. P değerleri, Mann-Whitney U testi kullanılarak hesaplanmış ve Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak çoklu test düzeltmesi yapılmıştır. Kalın yazılmış ortalama CLR farkları, bollukta anlamlı farklılıkları göstermektedir.
Bağırsak mikrobiyal bileşimini analiz ettikten sonra, mikrobiyomun fonksiyonel açıklamasını gerçekleştirdik. Düşük kaliteli genleri filtreledikten sonra, tüm örneklerde toplam 378.355 benzersiz gen tanımlandı. Bu genlerin dönüştürülmüş bolluğu, temel bileşen analizi (PCA) için kullanıldı ve sonuçlar, fonksiyonel profillerine göre örnek tiplerinin yüksek derecede kümelendiğini gösterdi (Şekil 4).
Şekil 4. Fare bağırsak mikrobiyomunun fonksiyonel profili kullanılarak elde edilen PCA sonuçları. PCA grafiği, örneklerin ilk iki temel bileşen üzerindeki dağılımını göstermektedir. Renkler örnek tipini belirtir: PPA'ya maruz kalan fareler mor, kontrol fareleri ise sarıdır. Birinci ve ikinci temel bileşenler sırasıyla x eksenine ve y eksenine çizilmiştir ve açıklanan varyans oranları olarak ifade edilmiştir.
Daha sonra farklı örnek tiplerindeki KEGG gen susturmalarının bolluğunu inceledik. Toplam 3648 benzersiz gen susturması tespit edildi; bunlardan 196'sı kontrol örneklerinde, 106'sı ise PPA örneklerinde anlamlı derecede daha boldu (Şekil 5). Kontrol örneklerinde toplam 145 gen, PPA örneklerinde ise 61 gen tespit edildi ve bollukları anlamlı derecede farklıydı. Lipid ve aminoşeker metabolizmasıyla ilgili yollar PPA örneklerinde anlamlı derecede daha zenginleşmişti (Ek Tablo 3). Azot metabolizması ve kükürt aktarım sistemleriyle ilgili yollar kontrol örneklerinde anlamlı derecede daha zenginleşmişti (Ek Tablo 3). Aminoşeker/nükleotid metabolizması (ko:K21279) ve inositol fosfat metabolizması (ko:K07291) ile ilgili genlerin bolluğu PPA örneklerinde anlamlı derecede daha yüksekti (Şekil 5). Kontrol örneklerinde benzoat metabolizması (ko:K22270), azot metabolizması (ko:K00368) ve glikoliz/glukoneogenez (ko:K00131) ile ilgili genlerin sayısı anlamlı derecede daha fazlaydı (Şekil 5).
Şekil 5. PPA ve kontrol farelerinin bağırsak mikrobiyomundaki KO'ların farklı bolluğu. Volkan grafiği, fonksiyonel grupların (KO'lar) bolluğundaki farklılıkları göstermektedir. Gri noktalar, örnek tipleri arasında bolluğu anlamlı derecede farklı olmayan KO'ları (p-değeri > 0,05) göstermektedir. Renkli noktalar, bollukta anlamlı farklılıkları (p-değeri ≤ 0,05) göstermektedir. Örnek tipleri arasında bollukta en büyük farklılıklara sahip 20 KO, sırasıyla kontrol ve PPA örneklerine karşılık gelen kırmızı ve açık mavi renkte gösterilmiştir. Sarı ve mor noktalar, sırasıyla kontrol ve PPA örneklerinde en az 2,7 kat daha fazla bolluğa sahip KO'ları göstermektedir. Siyah noktalar, ortalama CLR farkları -1 ile 1 arasında olan, bollukları anlamlı derecede farklı olan KO'ları göstermektedir. P değerleri, Mann-Whitney U testi kullanılarak hesaplanmış ve Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için ayarlanmıştır. NaN, KO'nun KEGG'de bir yola ait olmadığını gösterir. Kalın yazılmış ortalama CLR fark değerleri, bollukta anlamlı farklılıkları göstermektedir. Listelenen KO'ların ait olduğu yollar hakkında ayrıntılı bilgi için Ek Tablo 3'e bakınız.
Açıklamalı genler arasında, örnek tipleri arasında anlamlı derecede farklı bolluğa sahip 1601 gen (p ≤ 0,05) bulunmuştur; her gen en az 2,7 kat daha fazla bolluğa sahipti. Bu genlerden 4'ü kontrol örneklerinde, 1597'si ise PPA örneklerinde daha bol miktarda bulunmuştur. PPA'nın antimikrobiyal özelliklere sahip olması nedeniyle, örnek tipleri arasında PPA metabolizması ve üretim genlerinin bolluğunu inceledik. 1332 PPA metabolizmasıyla ilgili gen arasında, 27 gen kontrol örneklerinde, 12 gen ise PPA örneklerinde anlamlı derecede daha bol miktarda bulunmuştur. 223 PPA üretimiyle ilgili gen arasında ise 1 gen PPA örneklerinde anlamlı derecede daha bol miktarda bulunmuştur. Şekil 6A, PPA metabolizmasında yer alan genlerin daha yüksek bolluğunu, kontrol örneklerinde anlamlı derecede daha yüksek bolluğu ve büyük etki büyüklüklerini daha ayrıntılı olarak göstermektedir; Şekil 6B ise PPA örneklerinde anlamlı derecede daha yüksek bolluğa sahip bireysel genleri vurgulamaktadır.
Şekil 6. Fare bağırsak mikrobiyomunda PPA ile ilgili genlerin farklı bolluğu. Volkan grafikleri, PPA metabolizması (A) ve PPA üretimi (B) ile ilişkili genlerin bolluğundaki farklılıkları göstermektedir. Gri noktalar, örnek tipleri arasında bolluğu anlamlı derecede farklı olmayan genleri (p-değeri > 0,05) göstermektedir. Renkli noktalar, bollukta anlamlı farklılıkları (p-değeri ≤ 0,05) göstermektedir. Bollukta en büyük farklılıklara sahip 20 gen sırasıyla kırmızı ve açık mavi (kontrol ve PPA örnekleri) ile gösterilmiştir. Sarı ve mor noktaların bolluğu, kontrol ve PPA örneklerinde kontrol örneklerine göre en az 2,7 kat daha fazlaydı. Siyah noktalar, ortalama CLR farkları -1 ile 1 arasında olan, bollukları anlamlı derecede farklı olan genleri temsil etmektedir. P değerleri, Mann-Whitney U testi kullanılarak hesaplanmış ve Benjamini-Hochberg prosedürü kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için düzeltilmiştir. Genler, tekrarlamayan gen kataloğundaki temsili genlere karşılık gelmektedir. Gen adları, bir KO genini gösteren KEGG sembolünden oluşmaktadır. Kalın yazılmış CLR farklılıkları, anlamlı derecede farklı bolluk seviyelerini gösterir. Tire (-) işareti, KEGG veritabanında gen için bir sembol bulunmadığını gösterir.
PPA metabolizması ve/veya üretimiyle ilgili genlere sahip taksonlar, kontiglerin taksonomik kimliklerinin genin kontig kimliğiyle eşleştirilmesiyle belirlendi. Cins düzeyinde, 130 cinsin PPA metabolizmasıyla ilgili genlere ve 61 cinsin PPA üretimiyle ilgili genlere sahip olduğu bulundu (Ek Tablo 4). Bununla birlikte, hiçbir cinste bolluk açısından anlamlı bir fark görülmedi (p > 0,05).
Tür düzeyinde, 144 bakteri türünün PPA metabolizmasıyla ilişkili genlere sahip olduğu ve 68 bakteri türünün PPA üretimiyle ilişkili genlere sahip olduğu bulundu (Ek Tablo 5). PPA metabolize eden bakteriler arasında, sekiz bakteri örnek tipleri arasında bollukta önemli artışlar gösterdi ve hepsinde etkide önemli değişiklikler görüldü (Ek Tablo 6). Bollukta önemli farklılıklar gösteren tanımlanmış tüm PPA metabolize eden bakteriler, PPA örneklerinde daha boldu. Tür düzeyindeki sınıflandırma, örnek tipleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermeyen cinslerin temsilcilerini ortaya çıkardı; bunlar arasında çeşitli Bacteroides ve Ruminococcus türlerinin yanı sıra Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus ve Alcaligenes polymorpha yer almaktadır. PPA üreten bakteriler arasında, dört bakteri örnek tipleri arasında bollukta önemli farklılıklar gösterdi. Bollukta önemli farklılıklar gösteren türler arasında Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis ve Ruminococcus bovis bulunmaktadır.
Bu çalışmada, PPA maruziyetinin farelerin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkilerini inceledik. PPA, bazı türler tarafından üretildiği, diğer türler tarafından besin kaynağı olarak kullanıldığı veya antimikrobiyal etkileri olduğu için bakterilerde farklı tepkilere neden olabilir. Bu nedenle, diyet takviyesi yoluyla bağırsak ortamına eklenmesi, tolerans, duyarlılık ve besin kaynağı olarak kullanılabilme yeteneğine bağlı olarak farklı etkilere sahip olabilir. Hassas bakteri türleri ortadan kaldırılabilir ve PPA'ya daha dirençli veya onu besin kaynağı olarak kullanabilen türlerle değiştirilebilir, bu da bağırsak mikrobiyotasının bileşiminde değişikliklere yol açabilir. Sonuçlarımız, mikrobiyal bileşimde önemli farklılıklar olduğunu, ancak genel mikrobiyal çeşitlilik üzerinde bir etki olmadığını ortaya koydu. En büyük etkiler tür düzeyinde gözlemlendi; PPA ve kontrol örnekleri arasında bolluk açısından 70'ten fazla takson önemli ölçüde farklıydı (Ek Tablo 2). PPA'ya maruz kalan örneklerin bileşiminin daha ayrıntılı incelenmesi, maruz kalmayan örneklere kıyasla mikrobiyal türlerin daha fazla heterojenliğini ortaya koymuştur; bu da PPA'nın bakteriyel büyüme özelliklerini artırabileceğini ve PPA açısından zengin ortamlarda hayatta kalabilen bakteri popülasyonlarını sınırlayabileceğini düşündürmektedir. Dolayısıyla, PPA, bağırsak mikrobiyotası çeşitliliğinde yaygın bir bozulmaya neden olmaktan ziyade, seçici olarak değişikliklere yol açabilir.
PPA gibi gıda koruyucularının, genel çeşitliliği etkilemeden bağırsak mikrobiyomu bileşenlerinin bolluğunu değiştirdiği daha önce gösterilmiştir (Nagpal vd., 2021). Burada, PPA'ya maruz kalan farelerde önemli ölçüde zenginleşen Bacteroidetes türleri (önceden Bacteroidetes olarak biliniyordu) arasında en çarpıcı farklılıkları gözlemledik. Bacteroides türlerinin artan bolluğu, enfeksiyon riskini artırabilen ve iltihabı teşvik edebilen mukus bozulmasının artmasıyla ilişkilidir (Cornick vd., 2015; Desai vd., 2016; Penzol vd., 2019). Bir çalışma, Bacteroides fragilis ile tedavi edilen yenidoğan erkek farelerin otizm spektrum bozukluğunu (ASD) anımsatan sosyal davranışlar sergilediğini bulmuştur (Carmel vd., 2023) ve diğer çalışmalar, Bacteroides türlerinin bağışıklık aktivitesini değiştirebileceğini ve otoimmün inflamatuar kardiyomiyopatiye yol açabileceğini göstermiştir (Gil-Cruz vd., 2019). Ruminococcus, Prevotella ve Parabacteroides cinslerine ait türlerin de PPA'ya maruz kalan farelerde önemli ölçüde arttığı gözlemlenmiştir (Coretti vd., 2018). Bazı Ruminococcus türleri, proinflamatuar sitokinlerin üretimi yoluyla Crohn hastalığı gibi hastalıklarla ilişkilendirilirken (Henke vd., 2019), Prevotella humani gibi Prevotella türleri hipertansiyon ve insülin duyarlılığı gibi metabolik hastalıklarla ilişkilendirilmektedir (Pedersen vd., 2016; Li vd., 2017). Son olarak, Bacteroidetes (önceden Firmicutes olarak bilinen) ile Bacteroidetes oranının, Bacteroidetes türlerinin toplam bolluğunun daha yüksek olması nedeniyle, PPA'ya maruz kalan farelerde kontrol farelerine göre önemli ölçüde daha düşük olduğunu bulduk. Bu oranın daha önce bağırsak homeostazının önemli bir göstergesi olduğu ve bu orandaki bozulmaların çeşitli hastalık durumlarıyla (Turpin vd., 2016; Takezawa vd., 2021; An vd., 2023) ve inflamatuar bağırsak hastalıklarıyla (Stojanov vd., 2020) ilişkilendirildiği gösterilmiştir. Genel olarak, Bacteroidetes filumuna ait türlerin yüksek diyet PPA'sından en güçlü şekilde etkilendiği görülmektedir. Bu, PPA'ya karşı daha yüksek bir toleranstan veya PPA'yı enerji kaynağı olarak kullanma yeteneğinden kaynaklanıyor olabilir; bu durum en az bir tür olan Hoylesella enocea için doğru olduğu gösterilmiştir (Hitch vd., 2022). Alternatif olarak, anne PPA maruziyeti, fare yavrularının bağırsaklarını Bacteroidetes kolonizasyonuna daha duyarlı hale getirerek fetal gelişimi artırabilir; ancak çalışmamızın tasarımı böyle bir değerlendirmeye izin vermedi.
Metagenomik içerik değerlendirmesi, PPA metabolizması ve üretimiyle ilişkili genlerin bolluğunda önemli farklılıklar ortaya koymuştur; PPA'ya maruz kalan farelerde PPA üretiminden sorumlu genlerin bolluğu daha yüksekken, PPA'ya maruz kalmayan farelerde PAA metabolizmasından sorumlu genlerin bolluğu daha yüksekti (Şekil 6). Bu sonuçlar, PPA'nın mikrobiyal bileşim üzerindeki etkisinin yalnızca kullanımından kaynaklanmayabileceğini düşündürmektedir; aksi takdirde, PPA metabolizmasıyla ilişkili genlerin bolluğu, PPA'ya maruz kalan farelerin bağırsak mikrobiyomunda daha yüksek olmalıydı. Bir açıklama, PPA'nın bakteriyel bolluğu öncelikle antimikrobiyal etkileri yoluyla düzenlemesidir, bakteriler tarafından besin olarak kullanılması yoluyla değil. Önceki çalışmalar, PPA'nın Salmonella Typhimurium'un büyümesini doza bağlı olarak inhibe ettiğini göstermiştir (Jacobson vd., 2018). Daha yüksek konsantrasyonlarda PPA'ya maruz kalma, antimikrobiyal özelliklerine dirençli ve onu metabolize edemeyen veya üretemeyen bakterileri seçebilir. Örneğin, birkaç Parabacteroides türü PPA örneklerinde önemli ölçüde daha yüksek bolluk gösterdi, ancak PPA metabolizması veya üretimiyle ilgili hiçbir gen tespit edilmedi (Ek Tablolar 2, 4 ve 5). Ayrıca, fermantasyon yan ürünü olarak PPA üretimi çeşitli bakteriler arasında yaygın olarak dağılmıştır (Gonzalez-Garcia vd., 2017). Daha yüksek bakteri çeşitliliği, kontrol örneklerinde PPA metabolizmasıyla ilgili genlerin daha yüksek bolluğunun nedeni olabilir (Averina vd., 2020). Dahası, 1332 genin sadece 27'sinin (%2,14) yalnızca PPA metabolizmasıyla ilişkili genler olduğu tahmin edildi. PPA metabolizmasıyla ilişkili birçok gen, diğer metabolik yollarda da yer almaktadır. Bu, PPA metabolizmasında yer alan genlerin bolluğunun kontrol örneklerinde daha yüksek olduğunu daha da göstermektedir; bu genler, PPA kullanımına veya yan ürün olarak oluşumuna yol açmayan yollarda işlev görebilir. Bu durumda, PPA üretimiyle ilişkili yalnızca bir gen, örnek tipleri arasında bolluk açısından önemli farklılıklar gösterdi. PPA metabolizmasıyla ilişkili genlerin aksine, PPA üretimi için işaretleyici genler, PPA üretiminin bakteriyel yolunda doğrudan yer aldıkları için seçilmiştir. PPA'ya maruz kalan farelerde, tüm türlerin PPA üretme kapasitesinin ve bolluğunun önemli ölçüde arttığı bulunmuştur. Bu, PPA'ların PPA üreticilerini seçeceği ve dolayısıyla PPA üretim kapasitesinin artacağı tahminini desteklemektedir. Bununla birlikte, gen bolluğu mutlaka gen ekspresyonuyla ilişkili değildir; bu nedenle, PPA metabolizmasıyla ilişkili genlerin bolluğu kontrol örneklerinde daha yüksek olsa da, ekspresyon oranı farklı olabilir (Shi vd., 2014). PPA üreten genlerin yaygınlığı ile PPA üretimi arasındaki ilişkiyi doğrulamak için, PPA üretiminde yer alan genlerin ekspresyonu üzerine çalışmalar gereklidir.
PPA ve kontrol metagenomlarının fonksiyonel açıklaması bazı farklılıkları ortaya koydu. Gen içeriğinin PCA analizi, PPA ve kontrol örnekleri arasında ayrı kümeler ortaya çıkardı (Şekil 5). Örnek içi kümeleme, kontrol gen içeriğinin daha çeşitli olduğunu, PPA örneklerinin ise birlikte kümelendiğini gösterdi. Gen içeriğine göre kümeleme, tür bileşimine göre kümelemeyle karşılaştırılabilirdi. Bu nedenle, yol bolluğundaki farklılıklar, içlerindeki belirli türlerin ve suşların bolluğundaki değişikliklerle tutarlıdır. PPA örneklerinde, önemli ölçüde daha yüksek bolluğa sahip iki yol, aminosugar/nükleotid şeker metabolizması (ko:K21279) ve çoklu lipid metabolizması yolları (ko:K00647, ko:K03801; Ek Tablo 3) ile ilgiliydi. ko:K21279 ile ilişkili genlerin, PPA örneklerinde önemli ölçüde daha fazla türe sahip cinslerden biri olan Bacteroides cinsi ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu enzim, kapsüler polisakkaritleri ifade ederek bağışıklık tepkisinden kaçabilir (Wang vd., 2008). Bu durum, PPA'ya maruz kalan farelerde gözlemlenen Bacteroidetes artışını açıklayabilir. Bu, PPA mikrobiyomunda gözlemlenen artmış yağ asidi sentezini tamamlar. Bakteriler, konakçı metabolik yollarını etkileyebilecek yağ asitleri üretmek için FASIIko:K00647 (fabB) yolunu kullanır (Yao ve Rock, 2015; Johnson vd., 2020) ve lipid metabolizmasındaki değişiklikler nörogelişimde rol oynayabilir (Yu vd., 2020). PPA örneklerinde bolluğu artan bir diğer yol ise steroid hormon biyosentezidir (ko:K12343). Bağırsak mikrobiyotasının hormon seviyelerini etkileme yeteneği ile hormonlardan etkilenme yeteneği arasında ters bir ilişki olduğuna dair giderek artan kanıtlar vardır; bu nedenle yüksek steroid seviyelerinin sağlık açısından sonuçları olabilir (Tetel vd., 2018).
Bu çalışma, sınırlamalar ve dikkate alınması gereken hususlar içermektedir. Önemli bir ayrım, hayvanların fizyolojik değerlendirmelerini yapmamış olmamızdır. Bu nedenle, mikrobiyomdaki değişikliklerin herhangi bir hastalıkla ilişkili olup olmadığı doğrudan sonuçlanamaz. Bir diğer husus ise, bu çalışmadaki farelerin anneleriyle aynı diyetle beslenmiş olmasıdır. Gelecekteki çalışmalar, PPA açısından zengin bir diyetten PPA içermeyen bir diyete geçmenin mikrobiyom üzerindeki etkilerini iyileştirip iyileştirmediğini belirleyebilir. Çalışmamızın bir sınırlaması, diğer birçok çalışmada olduğu gibi, sınırlı örneklem büyüklüğüdür. Geçerli sonuçlar çıkarılabilse de, daha büyük bir örneklem büyüklüğü, sonuçları analiz ederken daha büyük istatistiksel güç sağlayacaktır. Ayrıca, bağırsak mikrobiyomundaki değişiklikler ile herhangi bir hastalık arasındaki ilişki hakkında sonuç çıkarmakta da temkinliyiz (Yap vd., 2021). Yaş, cinsiyet ve diyet gibi karıştırıcı faktörler, mikroorganizmaların bileşimini önemli ölçüde etkileyebilir. Bu faktörler, bağırsak mikrobiyomunun karmaşık hastalıklarla ilişkisi konusunda literatürde gözlemlenen tutarsızlıkları açıklayabilir (Johnson vd., 2019; Lagod ve Naser, 2023). Örneğin, Bacteroidetes cinsine ait üyelerin, ASD'li hayvanlarda ve insanlarda artmış veya azalmış olduğu gösterilmiştir (Angelis vd., 2013; Kushak vd., 2017). Benzer şekilde, inflamatuar bağırsak hastalığı olan hastalarda bağırsak bileşimi üzerine yapılan çalışmalar, aynı taksonlarda hem artış hem de azalma bulmuştur (Walters vd., 2014; Forbes vd., 2018; Upadhyay vd., 2023). Cinsiyet yanlılığının etkisini sınırlamak için, farklılıkların büyük olasılıkla diyetten kaynaklandığı şekilde, cinsiyetlerin eşit temsilini sağlamaya çalıştık. Fonksiyonel açıklamanın zorluklarından biri, gereksiz gen dizilerinin çıkarılmasıdır. Gen kümeleme yöntemimiz, yanlış kümelemeyi ortadan kaldırmak için %95 dizi özdeşliği ve %85 uzunluk benzerliğinin yanı sıra %90 hizalama kapsamı gerektirir. Bununla birlikte, bazı durumlarda, aynı açıklamalara sahip COG'lar gözlemledik (örneğin, MUT) (Şekil 6). Bu ortologların farklı olup olmadığı, belirli cinslerle ilişkili olup olmadığı veya bunun gen kümeleme yaklaşımının bir sınırlaması olup olmadığı konusunda daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Fonksiyonel açıklamanın bir diğer sınırlaması da potansiyel yanlış sınıflandırmadır; bakteriyel gen mmdA, propiyonat sentezinde rol alan bilinen bir enzimdir, ancak KEGG bunu propiyonat metabolik yoluyla ilişkilendirmez. Buna karşılık, scpB ve mmcD ortologları ilişkilidir. Belirlenmiş gen susturma işlemi yapılmamış çok sayıda gen, gen bolluğunu değerlendirirken PPA ile ilgili genleri tanımlama yetersizliğine yol açabilir. Gelecekteki çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasının fonksiyonel özelliklerinin daha derinlemesine anlaşılmasını sağlayabilen ve gen ekspresyonunu potansiyel aşağı yönlü etkilere bağlayabilen metatranskriptom analizinden faydalanacaktır. Belirli nörogelişimsel bozukluklar veya inflamatuar bağırsak hastalıkları içeren çalışmalar için, mikrobiyom bileşimindeki değişiklikleri bu bozukluklarla ilişkilendirmek için hayvanların fizyolojik ve davranışsal değerlendirmeleri gereklidir. Bağırsak mikrobiyomunun mikropsuz farelere nakledilmesiyle ilgili ek çalışmalar, mikrobiyomun hastalığın bir itici gücü mü yoksa bir özelliği mi olduğunu belirlemek için de yararlı olacaktır.
Özetle, diyetle alınan PPA'nın bağırsak mikrobiyotasının bileşimini değiştiren bir faktör olarak hareket ettiğini gösterdik. PPA, uzun süreli maruz kalma durumunda normal bağırsak florasının bozulmasına yol açabilen, çeşitli gıdalarda yaygın olarak bulunan, FDA onaylı bir koruyucudur. Birkaç bakterinin bolluğunda değişiklikler bulduk, bu da PPA'nın bağırsak mikrobiyotasının bileşimini etkileyebileceğini düşündürmektedir. Mikrobiyotadaki değişiklikler, belirli metabolik yolların seviyelerinde değişikliklere yol açabilir ve bu da konakçı sağlığıyla ilgili fizyolojik değişikliklere neden olabilir. Diyetle alınan PPA'nın mikrobiyal bileşim üzerindeki etkilerinin disbiyoz veya diğer hastalıklara yol açıp açamayacağını belirlemek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu çalışma, PPA'nın bağırsak bileşimi üzerindeki etkilerinin insan sağlığını nasıl etkileyebileceğine dair gelecekteki çalışmalar için temel oluşturmaktadır.
Bu çalışmada sunulan veri setleri çevrimiçi veri depolarında mevcuttur. Veri deposunun adı ve erişim numarası şöyledir: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Bu hayvan çalışması, Orta Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (UCF-IACUC) tarafından onaylanmıştır (Hayvan Kullanım İzin Numarası: PROTO202000002). Bu çalışma, yerel yasalara, düzenlemelere ve kurumsal gerekliliklere uygundur.
NG: Kavramsallaştırma, Veri derleme, Biçimsel analiz, Araştırma, Metodoloji, Yazılım, Görselleştirme, Yazma (orijinal taslak), Yazma (inceleme ve düzenleme). LA: Kavramsallaştırma, Veri derleme, Metodoloji, Kaynaklar, Yazma (inceleme ve düzenleme). SH: Biçimsel analiz, Yazılım, Yazma (inceleme ve düzenleme). SA: Araştırma, Yazma (inceleme ve düzenleme). Baş Hakim: Araştırma, Yazma (inceleme ve düzenleme). SN: Kavramsallaştırma, Proje yönetimi, Kaynaklar, Denetim, Yazma (inceleme ve düzenleme). TA: Kavramsallaştırma, Proje yönetimi, Denetim, Yazma (inceleme ve düzenleme).
Yazarlar, bu makalenin araştırma, yazım ve/veya yayınlanması için herhangi bir mali destek almadıklarını beyan etmişlerdir.
Yazarlar, araştırmanın potansiyel çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya mali ilişki olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler. (Uygulanamaz.)
Bu makalede ifade edilen tüm görüşler yalnızca yazarlara aittir ve kurumlarının, yayıncılarının, editörlerinin veya hakemlerinin görüşlerini yansıtmayabilir. Bu makalede değerlendirilen herhangi bir ürün veya üreticileri tarafından yapılan herhangi bir iddia, yayıncı tarafından garanti edilmez veya onaylanmaz.
Bu makaleye ait ek materyallere şu adresten çevrimiçi olarak ulaşılabilir: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propiyonik asit, otizm spektrum bozukluklarında PTEN/AKT yolunu düzenleyerek gliyoz ve nöroinflamasyona neden olur. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Kompozisyonel verilerin istatistiksel analizi. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes oranı meme kanseri için bir risk faktörü olarak. Klinik Tıp Dergisi, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Dizi sayım verilerinin diferansiyel ifade analizi. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, ve diğerleri (2013). Otizm ve başka türlü sınıflandırılmamış yaygın gelişim bozukluğu olan çocuklarda dışkı mikrobiyotası ve metabolomu. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Otizm spektrum bozukluğu olan küçük çocuklarda bağırsak mikrobiyotasının bakteriyel nörometabolik özellikleri. Tıp Mikrobiyolojisi Dergisi 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiyom insan organı olarak. Klinik Mikrobiyoloji ve Enfeksiyon 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Propiyonik asit üreten bakterilerin fizyolojisine dair yeni bilgiler: Anaerotignum propionicum ve Anaerotignum neopropionicum (eskiden Clostridium propionicum ve Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmalar 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Anne beslenmesi ve fetal gelişim. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., ve Hochberg, J. (1995). Yanlış pozitif oranının kontrolü: Çoklu test için pratik ve verimli bir yaklaşım. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Yayın tarihi: 18 Nisan 2025