Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü CSS için sınırlı desteğe sahiptir. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Omurgalılardan farklı olarak, böceklerin erkeklere özgü seks steroid hormonlarından yoksun olduğu yaygın olarak düşünülmektedir. Anopheles gambiae'de, ecdizon steroidi 20-hidroksiecdizon (20E), dişiler tarafından sentezlendiğinde yumurta gelişimini kontrol etmek için evrimleşmiş gibi görünmektedir² ve erkekler tarafından cinsel olarak aktarıldığında çiftleşme refrakter dönemini tetiklemektedir³. Yumurta gelişimi ve çiftleşme temel üreme özellikleri olduğundan, dişi Anopheles sivrisineklerinin bu hormonal sinyalleri nasıl entegre ettiğini anlamak, yeni sıtma kontrol programlarının tasarlanmasını kolaylaştırabilir. Burada, bu üreme fonksiyonlarının, ecdisteroid aktive edici/inaktive edici enzimlerin karmaşık bir ağı aracılığıyla farklı seks steroidleri tarafından düzenlendiğini ortaya koyuyoruz. Cinsel aktarım ve defosforilasyon yoluyla aktivasyonun ardından dişi cinsel alıcılığını kapatarak ebeveynliği koruyan, erkeğe özgü oksitlenmiş bir ecdizon olan 3-dehidro-20E'yi (3D20E) tanımladık. Özellikle, 3D20E aktarımı, Plasmodium enfeksiyonu sırasında yumurta gelişimini sürdüren üreme genlerinin ifadesini de tetikledi. Enfekte dişi bireylerin sağlığını güvence altına almak. Dişi kaynaklı 20E cinsel bir tepkiyi tetiklemez, ancak 20E'yi inhibe eden kinazlar inhibe edildikten sonra çiftleşen bireylerin yumurta bırakmasına olanak tanır. Bu erkeklere özgü böcek steroid hormonunun tanımlanması ve dişi cinsel alıcılığını, doğurganlığını ve Plasmodium ile etkileşimini düzenlemedeki rolü, sıtma bulaştıran sivrisineklerin üreme başarısını azaltma potansiyelini göstermektedir.
Sıtma vakaları ve ölümleri, insan sıtması parazitlerinin tek vektörü olan Anopheles sivrisineklerinde yaygın insektisit direnci nedeniyle yeniden artış gösteriyor.4 Bu sivrisineklerin çiftleşme biyolojisi, yeni sıtma kontrol müdahaleleri için özellikle cazip bir hedeftir çünkü dişiler yalnızca bir kez çiftleşir;5 bu tek çiftleşme olayını kısırlaştırmak, sahadaki sivrisinek popülasyonlarını azaltmada büyük bir potansiyele sahip olacaktır.
Dişi bireyler, erkeklerden yüksek titreli steroid hormonları aldıktan sonra cinsel olarak işlevsiz hale gelirler. Çalışmalar, daha sonraki çiftleşme zorluğunun tetikleyicisinin, larva evresinde tüy dökme döngüsünün düzenleyicisi olarak daha iyi bilinen bir steroid hormon olan 20-hidroksiecdizon (20E) olduğunu göstermiştir. Erkeklerin 20E sentezleme ve aktarma yeteneği, özellikle Afrika'da yaygın olan ve Anopheles gambiae de dahil olmak üzere sıtmanın en tehlikeli vektörlerini içeren Cellia7 alt cinsinin bir parçası olan Anopheles türlerinde evrimleşmiştir. Bu özellikle dikkat çekicidir çünkü bu türlerde dişiler de her kan emme işleminden sonra 20E üretir ve 20E, oogenez döngüsünü yönlendirir (bkz. referans 8). Bununla birlikte, dişilerin kendi çiftleşme yeteneklerini tehlikeye atmadan iki farklı ecdizon kaynağından (erkek aktarımı ve kan emme indüksiyonu) gelen sinyalleri nasıl entegre ettikleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Aslında, dişiler tarafından üretilen 20E cinsel intoleransı tetiklerse, bu şunlara yol açacaktır: Bu sivrisineklerde çok yaygın bir davranış olan, ilk kez çiftleşen bireylerde kısırlık görülmesi.5
Olası bir açıklama, A. gambiae erkeklerinin dişi üreme sisteminde sinyal kaskadını aktive eden ve çiftleşme istikrarsızlığına yol açan, modifiye edilmiş erkeğe özgü bir ekdizonu aktarmalarıdır. Bununla birlikte, omurgalılarda östrojen ve androjen gibi birden fazla steroid hormonu bulunmasına rağmen (9 numaralı referansta incelenmiştir), bildiğimiz kadarıyla böceklerde androjenik eğilimli steroidler tespit edilmemiştir.
Cinsel olgunluğa ulaşmış A. gambiae'nin erkek yardımcı bezinde (MAG) steroid hormonlarının repertuarını belirlemek ve olası değiştirici steroidleri aramak amacıyla yola çıktık. Daha önce kullanılan daha az spesifik yöntem yerine, tandem kütle spektrometrisi ile birleştirilmiş yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC-MS/MS) kullanarak, bu dokuda ekdizon (E) ve 20E'yi tespit ettik ve önceki sonucu doğruladık. Bununla birlikte, örnekte oksitlenmiş fosforile steroidler baskındı ve bu da 3-dehidro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 formülüyle tutarlıydı (Şekil 1). Diğer formlar arasında 3-dehidro-20E (3D20E) ve 20E-22-fosfat (20E22P) bulunur. 3D20E22P'nin HPLC-MS/MS sinyal yoğunluğu, defosforile formu olan 3D20E'den iki kat daha yüksek ve diğer formlardan üç kat daha yüksekti. E ve 20E'nin (Şekil 1) diğer vücut bölgelerinde ve alt üreme sisteminde (LRT; Genişletilmiş Veri Şekil 1a) bulunmasına rağmen, yeni kapanmış (<1 günlük) erkek ve dişilerde de ekdisteroidleri analiz ettik ve 3D20E ve 3D20E22P'yi yalnızca MAG'da tespit ettik; E, 20E ve 20E22P her iki cinsiyette de mevcuttu (Genişletilmiş Veri Şekil 1b). Bu veriler, A. gambiae yetişkin erkeklerinin MAG'larında dişiler tarafından sentezlenmeyen yüksek titrelerde değiştirici hormonlar ürettiğini göstermektedir.
MAG ve dişi LRT (atriyum, seminal veziküller ve parovarium dahil) 4 günlük (4 günlük) bakir erkeklerden ve bakir ve çiftleşmiş dişilerden (0,5, 3 ve 12 hpm) diseksiyon edildi. Bu dokulardaki ekdizon, HPLC-MS/MS ile analiz edildi (ortalama ± standart hata; eşleştirilmemiş t-testi, iki taraflı, yanlış keşif oranı (FDR) düzeltilmiş; NS, anlamlı değil; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 saat vs. 0,5 saat, P = 0,035; 12 saat vs. 3 saat, P = 0,0015; 12 saat vs. 0,5 saat, P = 0,030. 3D20E22P: 3 saat vs. 0,5 saat, P = 0,25; 12 saat vs. 3 saat, P = 0,0032; 12 saat vs. 0,5 saat, P = 0,015). Veriler üç biyolojik tekrardan elde edilmiştir. İlgili her bir ekdizon için tepe alanı hesaplanmış ve sivrisinek sayısına göre normalize edilmiştir. Ekdizon aşağıdaki gibi renklerle temsil edilmiştir: E, yeşil; 20E, turuncu; 20E22P, mor; 3D20E, mavi; 3D20E22P, pembe. Ek kısım, daha düşük ekdizon seviyelerini göstermek için y eksenindeki ölçeği artırır.
3D20E22P ve 3D20E'nin çiftleşme sırasında aktarılıp aktarılmadığını araştırmak için, çiftleşmeden sonra çeşitli zaman noktalarında dişi LRT'lerini inceledik. Bakirelerde ekdizon bulunmamasına rağmen, çiftleşmeden hemen sonra (çiftleşmeden 0,5 saat sonra) LRT'de önemli miktarda 3D20E22P gözlemledik ve bu miktar zamanla azaldı, buna karşılık 3D20E seviyeleri önemli ölçüde arttı (Şekil 1). Kimyasal olarak sentezlenmiş 3D20E'yi standart olarak kullanarak, çiftleşme LRT'lerindeki bu steroid hormonunun seviyelerinin 20E'den en az 100 kat daha yüksek olduğunu belirledik (Genişletilmiş Veri Tablosu 1). Bu nedenle, 3D20E22P, çiftleşme sırasında dişi LRT'ye aktarılan başlıca erkek ekdizonudur ve defosforile edilmiş formu olan 3D20E, çiftleşmeden kısa bir süre sonra oldukça bol miktarda bulunur. Bu, ikinci ekdizonun dişi çiftleşme sonrası biyolojisinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
Özel olarak oluşturulmuş bir biyoinformatik işlem hattı kullanarak yeni bir RNA dizileme (RNA-seq) veri seti oluşturduktan sonra (Şekil 2a), ekdizon kinaz (EcK), ekdizon oksidaz (EO) ve ekdizon kodlayan 20E-modifiye fosfataz genini (EPP) aradık. EPP, üreme dokularında ifade edilir. Bir aday EPP geni ve iki potansiyel EcK geni (EcK1 ve EcK2) belirledik, ancak iyi bir aday EO geni bulamadık. Özellikle, bireysel EPP genleri, Gambiya MAG'larında yüksek seviyelerde (%98,9) ifade edilirken, dişi LRT'lerde ifade edilmedi (Şekil 2b), bu da beklentilerimizin aksineydi çünkü 3D20E22P'nin defosforilasyonu bu dişi dokuda gerçekleşti. Bu nedenle, erkek EPP'nin çiftleşme sırasında aktarılabileceğine inanıyoruz. Nitekim, çiftleşmeden sonra dişi proteini maskelemek için in vivo kararlı izotop etiketlemesi kullandık. Dişi atriyumda MS ile tanımlanan enzim (Şekil 2c ve Ek Tablo 1). MAG'da ve çiftleşmiş (ancak bakire olmayan) dişi LRT'de EPP'nin varlığı, spesifik antikorlar kullanılarak da doğrulandı (Şekil 2d).
a, Her iki cinsiyetin üreme dokularında EcK'leri, EO'ları ve EPP'leri kodlayan genleri aramak için özel olarak oluşturulmuş bir biyoinformatik işlem hattı. Okların yanındaki sayılar, her adımda erkek ve dişi aday sayısını gösterir. Bu analiz, erkeklerde ifade edilen bir EPP geni (EPP) ve bir EcK geni (EcK1) ile her iki cinsiyette de ifade edilen ancak aday bir EO geni üretmeyen bir EcK geni (EcK2) tanımladı. b, Bakire (V) ve çiftleşen (M) Anopheles gambiae ve Anopheles albicans dokularında aday gen ifadesini karşılaştıran ısı haritası. Spca, döllenme; MAG'ler, erkeklerdeki yardımcı bezler; Vücudun diğer kısımları, her iki cinsiyette de göğüsler, kanatlar, bacaklar, yağ dokuları ve iç organlar ile dişilerde yumurtalıklar dahil olmak üzere. EcK2, Gambiya'nın MAG ve atriyumlarında yüksek oranda ifade edilirken, EPP yalnızca MAG'da bulunur.c, 3, 12 ve 24 hpm'de erkek ejakülat grubunun dişi atriyumlarına translokasyonunun proteomik analizi, en bol bulunan 67 proteini göstermektedir. Dişiler, tüm proteinleri etiketlemek (ve maskelemek) için 15N içeren bir diyetle beslendi. Etiketlenmemiş erkekler, etiketlenmiş dişilerle çiftleştirildi ve dişi LRT'leri proteomik analiz için 3, 12 ve 24 hpm'de diseksiyon edildi (ejakülat proteinlerinin tam listesi için Ek Tablo 1'e bakınız). Ek olarak, EPP, Eck1 ve EcK2, bu dokuların proteomik analizi ile bakir erkeklerin MAG'ında tespit edildi.d, EPP, çiftleşmiş dişilerin MAG ve LRT'sinde western blot ile tespit edildi. Dişi bireylerde, ancak bakire dişi bireylerde, erkeklerde veya dişi vücudunun geri kalanında değil. Membranlar eş zamanlı olarak anti-aktin (yükleme kontrolü) ve anti-EPP antikorları ile incelendi. Tüm erkekler bakiredir. Jel kaynağı verileri için Ek Şekil 1'e bakınız. Western blot işlemleri benzer sonuçlarla iki kez gerçekleştirildi.
EPP'nin ekdisteroid fosfofosfataz aktivitesi, MAG'den izole edilen 3D20E22P ile HPLC-MS/MS ile inkübasyon sonrasında doğrulandı (Genişletilmiş Veri Şekil 2a). Ayrıca, EPP'yi RNA aracılı girişim (RNAi) ile susturduğumuzda, bu erkeklerin üreme dokularında fosfataz aktivitesinde güçlü bir azalma tespit ettik (Şekil 3a) ve EPP susturulmuş erkeklerle çiftleşen dişiler, kısmi gen susturmasına rağmen (Genişletilmiş Veri Şekil 2b,c) önemli ölçüde daha düşük oranda defosforile edilmiş 3D20E gösterdi (Şekil 3b). Buna karşılık, aynı sivrisineklerde 20E22P/20E oranında önemli bir değişiklik tespit etmedik, bu da enzimin 3D20E22P'ye özgü olduğunu düşündürebilir (Şekil 3b).
a, Çift sarmallı EPP RNA (dsEPP) veya çift sarmallı GFP RNA (dsGFP) kontrolleri kullanılarak EPP susturulmasının neden olduğu MAG'deki fosfataz aktivitesindeki azalma. Her tekrarda yirmi MAG havuzu kullanıldı (P = 0,0046, eşleştirilmiş t-testi, iki taraflı), ayrı noktalarla gösterilmiştir. b, EPP susturulmuş erkeklerle çiftleşen dişilerde, 3 hpm'de defosforile edilmiş 3D20E oranı önemli ölçüde daha düşüktü (P = 0,0043, eşleştirilmemiş t-testi, iki taraflı), oysa 20E seviyeleri etkilenmedi (P = 0,063, eşleştirilmemiş). (t-testi, iki taraflı). Veriler, her biri 13, 16 ve 19 dişiden oluşan üç havuzdan elde edilen ortalama ± standart hata olarak sunulmuştur.c, EPP susturulmuş erkeklerle çiftleşen dişilerin yeniden çiftleşme oranları anlamlı derecede daha yüksekti (P ​​= 0,0002, Fisher'ın kesin testi, iki taraflı). Dişiler, çiftleşme durumlarını sağlamak için önce çiftleşmeye zorlandı; 2 gün sonra, transgenik sperm taşıyan diğer erkeklerle temasa geçirildiler ve transgenin kantitatif PCR tespiti ile yeniden çiftleşme oranları değerlendirildi.d, EPP susturulmuş erkeklerle çiftleşen kanla beslenen dişilerde doğurganlık önemli ölçüde azalmış (P < 0.0001; Mann-Whitney testi, iki yönlü) ve yumurta sayısı hafifçe azalmış (P = 0.088, Mann-Whitney testi, iki yönlü) iken, yumurtlama oranı etkilenmemiştir (P = 0.94, Fisher'ın kesin testi, iki yönlü). Tüm panellerde, n biyolojik olarak bağımsız sivrisinek örneklerinin sayısını temsil eder. NS, anlamlı değil. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Daha sonra, ekdizon defosforilasyonunun dişilerde çiftleşme direncini tetiklemek için önemli olup olmadığını değerlendirdik. Dikkat çekici bir şekilde, EPP'si eksik erkeklerle çiftleşen dişiler, ek (transgenik) erkeklere maruz kaldıklarında kontrol dişilerine (10.4%) kıyasla çok daha yüksek bir sıklıkta (%44.9) yeniden çiftleştiler (Şekil 3c). Ayrıca, doğurganlıkta önemli bir azalma (Şekil 3d, sol) ve bu dişiler tarafından bırakılan yumurta sayısında hafif bir azalma (Şekil 3d, orta) gözlemledik, ancak dişiler tarafından bırakılan yumurta yüzdesi (dişilerde çiftleşme ile ortaya çıkan başka bir yanıt) etkilenmedi (Şekil 3d, sağ). EPP'nin 3D20E22P'ye özgüllüğü göz önüne alındığında, bu sonuçlar, çiftleşme sırasında aktarılan EPP tarafından 3D20E'nin aktivasyonunun, daha önce 20E'nin cinsel transferine atfedilen bir davranış olan, dişilerin daha fazla çiftleşmeye karşı duyarlılığını kapatmada önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, Erkeklere özgü bu hormon, kadınların doğurganlığını da büyük ölçüde etkiler.
Daha sonra, kimyasal olarak sentezlenmiş 3D20E (Şekil 4a-c) ve ticari olarak temin edilebilen 20E kullanılarak, cinsel olarak olgun bakirelerde enjeksiyon deneylerinde 20E ve 3D20E'nin aktivitelerini karşılaştırdık. 3D20E'nin, her iki konsantrasyonda da dişi bireylerin çiftleşmeye karşı duyarlılığını kapatmada 20E'den önemli ölçüde daha etkili olduğunu gözlemledik (Şekil 4d). Özellikle, LRT'deki fizyolojik 3D20E seviyesinin yarısı (enjeksiyondan sonra 1.066 pg'ye karşılık çiftleşmeden sonra 2.022 pg), en yüksek konsantrasyon olan çiftleşmeden sonra 18 pg'de enjeksiyondan 24 saat sonra, fizyolojik 20E seviyesine (enjeksiyondan sonra 361 pg) göre 20 kat daha yüksek oranda dirençli dişi birey oluşmasına neden oldu; (Genişletilmiş Veri Tablosu 1). Bu sonuç, 20E'nin cinsel transferinin çiftleşme refrakter dönemlerine neden olmadığı fikriyle tutarlıdır ve ayrıca 3D20E'nin ebeveyn-çocuk ilişkisini sağlamada önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. 3D20E ayrıca, bakire dişilerde yumurtlama deneylerinde 20E'den önemli ölçüde daha aktifti (Şekil 4e), bu da kısmi EPP susturulmasından sonra gözlemlediğimiz normal yumurtlama oranının, çiftleşme kaynaklı dişi faktörler tarafından hala üretilen artık 3D20E aktivitesinin varlığından kaynaklandığını düşündürmektedir.
(a,b) 20E'den (a) çok yüksek dönüşüm/verimlilikle kimyasal olarak sentezlenen 3D20E (veriler üç bağımsız sentez reaksiyonundan elde edilen ortalama ± standart hata olarak sunulmuştur) (b).c, Kütle spektrumu (alt yarısı), çiftleşmiş dişi LRT'de bulunan ekdizon ile tam olarak eşleşir (üst yarısı).d, 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher'ın kesin testi, iki taraflı) ve %10 etanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher'ın kesin testi, iki taraflı) ile karşılaştırıldığında, 20E, kontrolden yalnızca daha yüksek dozlarda anlamlı derecede daha yüksekti (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisher'ın kesin testi, iki taraflı).e, 3D20E enjeksiyonu, %10 etanol kontrollerine kıyasla bakire dişilerde önemli ölçüde daha yüksek yumurtlama oranlarına neden oldu (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisher'ın kesin testi, iki taraflı), 20E ise kontrollere kıyasla sadece daha yüksek dozlarda önemli ölçüde daha yüksek yumurtlama oranlarına neden oldu (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisher'ın kesin testi, iki taraflı). 3D20E, daha yüksek dozlarda 20E'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek yumurtlama oranlarına neden oldu (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisher'ın kesin testi, iki taraflı). Tüm panellerde, n biyolojik olarak bağımsız sivrisinek sayısını temsil eder. Örnekler.NS, anlamlı değil.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.Veriler üç tekrardan elde edilmiştir.
Önceki çalışmalarda, steroid hormonlarının cinsel yolla aktarılmasının, A. gambiae dişilerini P. falciparum enfeksiyonundan koruyan dişi üreme geni MISO'nun (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) ekspresyonunu indüklediğini belirlemiştik. Sıtma endemik bölgelerinde Anopheles sivrisineklerinin üreme başarısı için MISO'nun önemi göz önüne alındığında, bu genin ekspresyonunu hangi hormonun (3D20E veya 20E) tetiklediğini belirlemeye karar verdik. 20E enjeksiyonunun, HR3 ve HR4 gibi bazı nükleer hormon reseptörlerini (HR) ve yumurta oluşumunu sağlayan Vg14, 15, 16 gibi tipik steroid hedef genlerini spesifik veya daha güçlü bir şekilde indüklediğini bulduk; ancak MISO, 3D20E tarafından daha güçlü bir şekilde indüklendi (Genişletilmiş Veri Şekil 3). Bu nedenle, bu androjenik steroid hormonunun cinsel yolla aktarılması, dişileri sıtmanın yol açtığı maliyetlerden koruyan mekanizmaları indüklemektedir. Parazitik enfeksiyon. Dahası, 3D20E, E reseptörü EcR'nin her iki izoformunu da farklı şekilde etkileyerek EcR-A'yı indükler ve EcR-B'yi baskılar ve HPX15 de dahil olmak üzere diğer çiftleşmeyi tetikleyen genleri daha güçlü bir şekilde harekete geçirir; bu da dişi doğurganlığını etkiler. Bu, EPP susturulmuş erkeklerle çiftleşen dişilerde gözlemlenen önemli kısırlığı açıklayabilir (Genişletilmiş Veri Şekil 3). Bu veriler, cinsiyete özgü işlevin altında yatan, iki ekdizon hormonu tarafından öncelikli olarak aktive edilen aşağı akış yollarının varlığını düşündürmektedir.
Daha sonra, biyoinformatik işlem hattımızda tanımlanan iki EcK geninin işlevini test ettik. EcK1 veya EcK2'nin susturulması erkeklerde önemli bir ölüm oranına neden oldu (Genişletilmiş Veri Şekil 4a), bu da ekdizon fosforilasyonunun ve dolayısıyla inaktivasyonunun hayatta kalma için önemli olduğunu düşündürmektedir. EcK2, EcK1'den daha yüksek seviyelerde ifade edildiğinden ve proteomik yöntemlerle MAG'larda tespit edildiğinden (Şekil 2b,c ve Ek Tablo 2), 20E ile inkübe ederek ekdisteroid kinaz aktivitesini doğruladık ve bu da 20E22P fosforilasyonuna neden oldu (Genişletilmiş Veri Şekil 2). 4b). 3D20E'yi substrat olarak kullandığımızda, fosforile ürün 3D20E22P'yi tespit edemedik (Genişletilmiş Veri Şekil 4c), bu da 3D20E'den ziyade 20E'nin EcK2'nin tercih edilen hedefi olabileceğini düşündürmektedir.
RNA-seq analizimize göre, EcK2, bakire dişilerin LRT'sinde de yüksek oranda ifade ediliyordu ve çiftleşmeden sonra kapanıyordu (Şekil 2b). Bu verileri doğruladık ve EcK2 ifadesinin kan emme işleminden etkilenmediğini belirledik (Genişletilmiş Veri Şekil 5a). İlk MS deneylerimizi genişleterek, 20E22P'nin tepe noktasının 20E'nin tepe noktasıyla yakından ilişkili olduğunu belirledik (kan emme işleminden 22-26 saat sonra; Genişletilmiş Veri Şekil 5b). Bakire dişilerde EcK2'nin susturulması, kan emme işleminden 26 saat sonra 20E'nin 20E22P'ye göre nispi oranında 3 kat artışa neden oldu (Genişletilmiş Veri Şekil 2c ve 5c), bu da EcK2'nin dişilerde 20E'yi de fosforile ettiğini doğruluyor. Özellikle, EcK2 eksikliği olan bakireler tam cinsel alıcılığı korudu (Genişletilmiş Veri Şekil 5d,e), bu da dişi üretiminin 20E, çiftleşme refrakter dönemlerine neden olmaz. Bununla birlikte, bu dişilerin kontrollere kıyasla yumurtlama oranları önemli ölçüde artmıştır ve bakirelerin %30'undan fazlası yumurta bırakmıştır (Genişletilmiş Veri Şekil 5f). Kan emme işleminden sonra çift sarmallı Eck2 RNA (dsEcK2) enjeksiyonları yapıldığında, kan alımına bağlı 20E zirvesinin azaldığı noktada yumurtlama gerçekleşmemiştir. Genel olarak, bu sonuçlar, kan emme işleminden sonra üretilen 20E'nin yumurtlamayı tetikleyebileceği, ancak yalnızca yumurtlama engelinin (EcK2 ve muhtemelen diğer faktörler) çiftleşme ile kapatıldığı bir modeli desteklemektedir. Ne 20E ne de 3D20E enjeksiyonları bakirelerde EcK2 ekspresyonunu inhibe etmemiştir (Genişletilmiş Veri Şekil 5g), bu da diğer faktörlerin bu kinazın inhibisyonuna aracılık ettiğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, kan emme işleminden sonraki 20E seviyeleri çiftleşme rahatsızlığına neden olmak için yeterli değildi, ancak cinsel olarak aktarılan yüksek titreler tarafından etkili bir şekilde tetiklendi. 3D20E.
Sonuçlarımız, A. gambiae'nin üreme başarısını düzenleyen mekanizmalara ilişkin önemli bilgiler sağlamaktadır. Erkeklerin, dişileri daha fazla çiftleşmeye karşı duyarsızlaştırarak ebeveynliği sağlayan, erkeğe özgü modifiye edilmiş bir ekdizon olan 3D20E'nin yüksek titrelerini sentezlemek üzere evrimleştiği bir model ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda, bu sıtma vektörleri, erkeğe özgü EPP'nin cinsel transferine yanıt olarak dişilerde 3D20E'yi aktive etmek için verimli bir sistem de geliştirmiştir. Bildiğimiz kadarıyla, bu, böceklerde benzersiz ve kritik bir işlevi yerine getiren erkek ve dişi baskın bir steroid hormon sisteminin ilk örneğidir. Erkeğe özgü ekdizon işlevi varsayılmıştır ancak kesin olarak kanıtlanmamıştır. Örneğin, büyük ölçüde çürütülmüş bir hipotez 18, bu işlevlerin 20E öncüsü E1 tarafından gerçekleştirilebileceğidir. Drosophila'da, tek eşliliğin, dişi üreme sistemini innerve eden nöronlarla spesifik seks peptidi yoluyla etkileşime giren küçük seks peptitlerinin 19,20 cinsel transferiyle tetiklendiği iyi bilinmektedir. reseptörler21,22. A. gambiae dişilerinde 3D20E tarafından kontrol edilen aşağı yönlü sinyal iletim basamaklarını belirlemek ve bu basamakların sivrisinekler ve Drosophila arasında korunup korunmadığını tespit etmek için daha fazla çalışma gerekmektedir.
Çalışmamızda belirlenen dişi doğurganlığı ve davranışında 3D20E'nin önemli rolü göz önüne alındığında, 3D20E sentezi ve aktivasyonuna yol açan yollar, gelecekteki sivrisinek kontrol stratejileri için yeni fırsatlar sunmaktadır; örneğin, vahşi doğaya salınmada rekabetçi kısır erkeklerin üretilmesi veya bakire çiftleşmesinde 3D20E'nin taklit edilmesi gibi. 3D20E'nin erkeğe özgü işlevi, A. gambiae ve diğer Cellia türlerinin menilerini çiftleşme tıkaçlarına pıhtılaştırma yeteneğini kazandığında evrimleşmiş olabilir, çünkü bu, çok sayıda hormon ve hormon aktive edici enzimin verimli bir şekilde aktarılmasına olanak tanır. Buna karşılık, monandriyi uygulayan 3D20E evrimi, dişilerin (MISO'nun yüksek ifadesi yoluyla) yüksek sıtma prevalansı olan bölgelerde üreme yeteneklerini artırmaları için bir mekanizma sağlar ve bu da dolaylı olarak Plasmodium bulaşmasına katkıda bulunur. Dişi 20E'nin dişi Anopheles sivrisineklerinde P. falciparum'un hayatta kalması ve büyümesi üzerinde derin etkileri olduğu gösterildiğinden, hem erkek hem de dişi 3D20E'nin (MISO'nun yüksek ifadesi yoluyla) üreme yeteneklerini artırmaları için bir mekanizma sağlar. Ve dişi steroid hormon yolları artık sivrisinek-parazit etkileşimlerinin kilit unsurları arasında yer alıyor.
A. gambiae G3 suşları standart böcek koşullarında (26-28 °C, %65-80 bağıl nem, 12:12 saat aydınlık/karanlık fotoperiyodu) yetiştirildi. Larvalar toz balık yemi (TetraMin Tropikal Pul Yem, Koi Peletleri ve Tetra Gölet Çubukları 7:7:2 oranında) ile beslendi. Yetişkin sivrisinekler serbestçe %10 dekstroz çözeltisi ve haftalık insan kanı (çalışma kan bileşenleri) ile beslendi. Bakire sivrisinekler, pupa evresinde uçları mikroskopi ile incelendikten sonra cinsiyetlerin ayrılmasıyla elde edildi. DsRed transgenini taşıyan erkekler daha önce tanımlanmıştır.
Zorla çiftleştirme deneyleri, daha önce açıklanan protokollere göre gerçekleştirildi. Doğal çiftleşme için, 4 günlük bakire dişiler, iki gece boyunca cinsel olarak olgun bakire erkeklerle 1:3 oranında tutuldu. Erkeklere dsEPP enjekte edilen deneylerde, birlikte kafesleme, fosfataz aktivitesinin maksimum düzeyde susturulduğu enjeksiyondan sonraki 3-4. günlerle aynı zamana denk geldi (Genişletilmiş Veri Şekil 2b).
Sivrisinek dokuları, kalan cesetler (vücudun geri kalanı) veya tüm vücut %100 metanol içine alındı ​​ve bir boncuklu karıştırıcı (2 mm cam boncuklar, 2400 rpm, 90 sn) ile homojenize edildi. Doku miktarları ve metanol hacimleri şu şekildeydi: vücudun geri kalanı, 1000 µl'de 50; MAG, 80 µl'de 50–100; dişi LRT, 80 µl'de 25–50. Çökelti, aynı hacimde metanol ile ikinci bir metanol ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Hücre kalıntıları santrifüjleme ile uzaklaştırıldı. Her iki ekstraksiyondan elde edilen metanol birleştirildi ve azot akışı altında kurutuldu, ardından aşağıdaki hacimlerde %80 metanol içeren suda yeniden süspanse edildi: vücudun geri kalanı, 50 µl; MAG'lar ve dişi LRT, 30 µl.
Örnekler, bir LC cihazına (Vanquish, Thermo Fisher) bağlı bir kütle spektrometresi (ID-X, Thermo Fisher) üzerinde analiz edildi. 5 µl örnek, 25 °C'de tutulan 3 µm, 100 × 4,6 mm'lik bir kolona (Inspire C8, Dikma) enjekte edildi. LC için mobil fazlar A (su, %0,1 formik asit) ve B (asetonitril, %0,1 formik asit) idi. LC gradyanı şu şekildeydi: 1 dakika boyunca %5 B, ardından 11 dakika içinde %100 B'ye yükseltildi. %100'de 8 dakikadan sonra, kolon 4 dakika boyunca %5 B'de yeniden dengelendi. Akış hızı 0,3 ml min-1 idi. MS kaynağındaki iyonizasyon, pozitif ve negatif modlarda ısıtılmış elektrosprey iyonizasyonu ile gerçekleştirildi.
Kütle spektrometresi, tam MS modunda 60.000 çözünürlükte 350 ila 680 m/z aralığında veri ölçer. MS/MS verileri [M + H]+ (tüm hedefler), [M - H2O + H]+ (tüm hedefler) ve [M - H]- (fosforile hedefler) üzerinde elde edildi. MS/MS verileri, standart bulunmayan hedeflerin ekdizon özelliklerini doğrulamak için kullanıldı. Hedef dışı ekdisteroidleri tanımlamak için, %15'ten fazla nispi bolluğa sahip tüm HPLC pikleri için MS/MS verileri analiz edildi. Mutlak miktarları hesaplamak için saf standartlardan (20E, 3D20E) oluşturulan standart eğriler veya bir erkekte bulunan miktarlara eşdeğerliklerini hesaplamak için belirli bir örneğin (diğer tüm hedefler) seyreltmeleri kullanılarak nicelendirme yapıldı. 3D20E için nicelendirme, aşağıdaki eklentilerin toplamı kullanılarak gerçekleştirildi: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + [Cl]-, [M + NO3]-. Veriler Tracefinder (sürüm 4.1) kullanılarak çıkarıldı ve nicelendirildi. MS/MS verileri Xcalibur (sürüm 4.4) kullanılarak analiz edildi. E, 20E ve 3D20E'nin MS spektrumları ilgili standartlarla karşılaştırıldı. 3D20E22P, Girard reaktifi ile türevlendirme yoluyla analiz edildi. 20E22P, m/z oranı ile analiz edildi.
3D20E22P, MAG'den saflaştırıldı. Saflaştırma, HPLC-MS/MS analiziyle aynı LC koşulları altında, dört kutuplu kütle tabanlı dedektörlü (QDa, Acquity, Waters) ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (Acquity, Waters) kullanılarak analitik ölçekte gerçekleştirildi. Fraksiyon toplama işlemi, daha önce belirlenenle aynı tutunma süresinde 3D20E22P'ye karşılık gelen m/z değeri tespit edildiğinde tetiklendi. Ekstrakte edilen bileşiklerin saflığı daha sonra yukarıda açıklandığı gibi HPLC-MS/MS ile kontrol edildi.
Üretici firmanın talimatlarına göre TRI reaktifi (Thermo Fisher) kullanılarak 10-12 üreme dokusundan veya vücudun diğer kısımlarından (başsız) toplam RNA ekstrakte edildi. RNA, TURBO DNaz (Thermo Fisher) ile işlendi. cDNA, üretici firmanın talimatlarına göre Moloney fare lösemi virüsü ters transkriptazı (M-MLV RT; Thermo Fisher) kullanılarak sentezlendi. Ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR; Genişletilmiş Veri Tablosu 2) için primerler daha önce yayınlanmış24 veya Primer-BLAST26 kullanılarak tasarlanmıştır; 70-150 bp boyutunda ve ekson-ekson birleşimlerini kapsayan ürünlere veya eksonları ayıran primer çiftlerine öncelik verilmiştir. Üç ila dört biyolojik tekrardan elde edilen cDNA örnekleri, RT-qPCR için suda dört kat seyreltildi. Kantifikasyon, 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primerler ve 5 içeren 15 µl'lik tekrarlı reaksiyonlarda gerçekleştirildi. µl seyreltilmiş cDNA kullanıldı. Reaksiyonlar QuantStudio 6 Pro gerçek zamanlı PCR sistemi (Thermo Fisher) üzerinde gerçekleştirildi ve veriler Design and Analysis (sürüm 2.4.3) kullanılarak toplandı ve analiz edildi. Bu çalışmada gösterildiği gibi, göreceli miktarlar, kan emme 27 veya çiftleşme 3 ile ekspresyonu önemli ölçüde değişmeyen ribozomal gen RpL19'a (AGAP004422) göre normalize edildi.
RNA kalitesi, Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) kullanılarak kontrol edildi. Illumina çift uçlu kütüphaneler, MIT ve Harvard'ın Broad Enstitüsü'nde hazırlandı ve çalıştırıldı. Dizileme okumaları, varsayılan parametrelerle HISAT2 (sürüm 2.0.5) kullanılarak A. gambiae genomuna (PEST suşu, sürüm 4.12) hizalandı. Eşleme kalitesi (MAPQ) puanları <30 olan okumalar, Samtools (sürüm 1.3.1) kullanılarak kaldırıldı. Genlere eşlenen okuma sayısı, varsayılan parametrelerle htseq-count (sürüm 0.9.1) kullanılarak sayıldı. Normalleştirilmiş okuma sayıları hesaplandı ve diferansiyel gen ekspresyonu, R'de (sürüm 4.0.3) DESeq2 paketi (sürüm 1.28.1) kullanılarak analiz edildi.
Ecdizon modifiye edici gen adayları, öncelikle A. gambiae genomunda PSI-BLAST algoritması (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) kullanılarak, varsayılan değerlerle ve aşağıdaki sorgu protein dizileriyle arama yapılarak belirlendi: Bombyx mori'den (Erişim No. NP_001038956.1), Musca domestica'dan (Erişim No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 ve XP_011294434.1) ve Microplitis demolitor'dan (Erişim No. XP_008552646.1 ve XP_008552645.1) EcK; B. mori'den (Erişim No. NP_001036900), Drosophila melanogaster'den (Erişim No. No. NP_651202), Apis mellifera (Erişim No. XP_394838) ve Acyrthosiphon pisum (Erişim No. XP_001947166); ve B. mori'den EPP (Erişim No. XP_001947166), NP_001177919.1 ve NP_001243996.1) ve D. melanogaster'den EO (Erişim No. NP_572986.1) (adım 1). Ardından, Gambiya'daki üreme dokusunda (dişi LRT veya MAG) yüksek mRNA ekspresyonuna (>100 fragman/kilobaz ekson/milyon eşlenmiş okuma (FPKM) veya >%85) göre eşleşmeleri filtreleyin (adım 2). Özgüllüğü artırmak için, çiftleşme sırasında ekdizon sentezlemeyen veya aktarmayan bir anofel türü olan A. albimanus'un üreme dokusunda da ifade edilen aday enzimleri seçtik. Aday genler, A. albimanus üreme dokusunda düşük ifadeye (<100 FPKM veya <85. yüzdelik dilim) göre filtrelendi (adım 3). Son bir filtre olarak (adım 4), aday genlerin aşağıdakilerden en az birini karşılaması gerekir: (1) farklı ifade edilen genlerin analizine göre çiftleşmeden sonra anlamlı derecede yukarı regüle edilmiş (P < 0,05) ve (2) üreme dışı dokularda (< %85 veya <100 FPKM).
Daha önce açıklanan yöntemleri 28,29,30, tüm organizmanın izotopik etiketlenmesini sağlamak için değiştirdik. Kısaca, yabani tip Saccharomyces cerevisiae tip II (YSC2, Sigma), %2 glikoz (G7528, Sigma), %1,7 amino asit içermeyen ve amonyum sülfat içeren (ağırlık/hacim) maya azot bazında (BD Difco, DF0335) ve tek azot kaynağı olarak %5 15N amonyum sülfat (NLM-713, >%99, Cambridge Isotope Laboratories) kültür ortamında test edildi. Maya santrifüjleme ile geri kazanıldı ve sivrisinek larvaları pupalaşana kadar serbestçe beslendi. Dördüncü larva evresindeki ölümleri önlemek için balık unu (300 larva başına 0,5 mg) ile takviye edildi. Daha sonra, çiftleşme sırasında aktarılan erkek proteomunu analiz etmek için sadece dişiler, etiketlenmemiş erkeklerle çiftleşme deneylerinde kullanıldı.
4-6 günlük 15N etiketli bakire dişiler, yaşlarına uygun etiketsiz bakire erkeklerle çiftleştirilmeye zorlandı. Başarılı çiftleşme, epifluoresans mikroskopi altında çiftleşme tıkaçlarının saptanmasıyla doğrulandı. 3, 12 ve 24 hpm'de, 45-55 çiftleşmiş dişinin kulakçıkları 50 µl amonyum bikarbonat tamponuna (pH 7,8) ayrıldı ve havanla homojenize edildi. Homojenat santrifüjlendi ve süpernatant 50 mM amonyum bikarbonat içinde %0,1 RapiGest (186001860, Waters) ile karıştırıldı. Her örnekten elde edilen süpernatant ve pelet, kuru buzda hızla donduruldu ve LC-MS/MS için örnek hazırlığının tamamlandığı Washington Üniversitesi'ndeki MacCoss laboratuvarına bir gecede gönderildi. Peleti 50 µl'de yeniden süspansiyon haline getirin. 0.1% RapiGest, 50 mM amonyum bikarbonat içinde su banyosunda sonikasyon işlemine tabi tutuldu. Pelet ve süpernatantın protein konsantrasyonu BCA testi ile ölçüldü, örnekler 5 mM ditiyotreitol (DTT; Sigma) ile indirgendi, 15 mM iyodoasetamid (Sigma) ile alkillendi ve 37 °C'de (1:0 50) 1 saat boyunca tripsinleme (tripsin:substrat oranı) ile inkübe edildi. RapiGest, 200 mM HCl ilavesiyle lizize edildi, ardından 37 °C'de 45 dakika inkübe edildi ve kalıntıları uzaklaştırmak için 4 °C'de 14.000 rpm'de 10 dakika santrifüj edildi. Örnekler, çift modlu katı faz ekstraksiyonu (Oasis MCX kartuşları, Waters) ile yıkandı ve son protein konsantrasyonu 0,33 µg olacak şekilde 0,1% formik asit içinde yeniden süspanse edildi. µl-1. Etiketlenmemiş MAG proteomları da benzer şekilde bakir erkeklerden analiz edildi. Her örnek için iki analitik tekrar analiz edildi. Ardından, her birinden 1 µg, Jupiter C12 ters faz reçinesi (Phenomenex) ile doldurulmuş 4 cm'lik kaynaştırılmış silika Kasil1 (PQ) frit kapanı içeren 25 cm'lik kaynaştırılmış silika 75 µm kolon ve 180 dakikalık sıvı kromatografisi kullanılarak analiz edildi. Örnek sindirimleri – MS/MS, nanoACQUITY UPLC Sistemi (Waters) ile birlikte bir Q-Exactive HF kütle spektrometresi (Thermo Fisher) üzerinde çalıştırıldı. Her çalıştırma için oluşturulan veriyle ilgili edinim verileri, Proteowizard (sürüm 3.0.20287) ve Anopheles gambiae (VectorBase sürüm 54), Anopheles coluzzi A protein dizilerini içeren FASTA veritabanına karşı Comet31 (sürüm 3.2) kullanılarak mzML formatına dönüştürüldü. Mali-NIH (VectorBase sürüm 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Mart 2021), A. gambiae RNA-seq ve bilinen insan kontaminantlarının üç çerçeveli çevirileri üzerinde arama yapıldı. Peptit haritasıyla eşleşen FDR'ler, 0,01 eşik değeriyle Percolator32 (sürüm 3.05) kullanılarak belirlendi ve peptitler, protein parsimonisi kullanılarak protein tanımlamalarına dönüştürüldü. Limelight33 (sürüm 2.2.0). Göreceli protein bolluğu, daha önce açıklandığı gibi her bir çalıştırmada her protein için hesaplanan normalize spektral bolluk faktörü (NSAF) kullanılarak tahmin edildi. Her proteine ​​göre NSAF, iki farklı biyolojik tekrardan alınan örnekler arasında ortalama alındı. 15N etiketlemesi dişi proteomunu başarıyla maskeledi, ancak etiketli bakirelerden az miktarda etiketlenmemiş protein tespit edilebildi. Dişi ham örneklerinde erkek protein azalmasının (1-5 spektrum) tespitini yalnızca teknik çalıştırmalarda, ham örneklerin erkek/çiftleşme örneklerinden sonra çalıştırıldığı durumlarda, HPLC "taşınması" sonucu olarak kaydettik. Etiketli bakirelerden 'kirletici' olarak bulunan ara sıra görülen proteinler Ek Tablo 1'de listelenmiştir.
Genscript'te QTTDRVAPAPDQQQ (PA izotipinde) ve MESDGTTPSGDSEQ (PA ve PB izotiplerinde) olmak üzere iki antijenik peptit birleştirildi, ardından taşıyıcı protein KLH'ye bağlandı ve Yeni Zelanda tavşanlarına enjekte edildi. Tavşanlar dördüncü enjeksiyondan sonra kurban edildi ve toplam IgG, afinite saflaştırma yöntemiyle izole edildi. En EPP-spesifik tavşandan elde edilen IgG, daha sonraki Western blot analizleri için kullanıldı.
Western blot analizleri için, 4 günlük bakir erkeklerden ve bakir veya zorla çiftleştirilmiş dişilerden (<10 çiftleşme sonrası) alınan MAG (n = 10, burada n biyolojik olarak bağımsız sivrisinek örneklerinin sayısını temsil eder) ve dişi LRT (n = 30) proteinleri kullanıldı. Protein ekstraksiyon tamponu (50 mM Tris, pH 8.0; %1 NP-40; %0.25 sodyum deoksikolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteaz inhibitör kokteyli (Roche)) ayrı ayrı eklendi. Örnekler, diseksiyonun hemen ardından boncuklu elek (2 mm cam boncuklar, 2400 rpm, 90 sn) ile homojenize edildi. Çözünmeyen kalıntılar, 4 °C'de 20.000 g'de santrifüj edilerek uzaklaştırıldı. Proteinler Bradford testi (Bio-Rad) ile ölçüldü. Daha sonra, 20 µg MAG proteini, 40 µg LRT proteini ve 20 µg artık kütle proteini, MOPS tamponu kullanılarak %10 Bis-Tris NuPAGE ile denatüre edildi ve ayrıştırıldı. Proteinler, iBlot2 transfer sistemi (Thermo Fisher) kullanılarak poliviniliden florür membranlara aktarıldı. Membranlar, 1× PBS-T (PBS'de %0,1 Tween-20) ile iki kez yıkandı ve ardından 22°C'de 1 saat boyunca Odyssey bloke edici tamponda (Li-Cor) bloke edildi. Membranlar, özel tavşan anti-EPP poliklonal birincil antikor (bloke edici tamponda 1:700) ve sıçan anti-aktin monoklonal birincil antikor MAC237 (Abeam; 1:4000) ile 4 °C'de bir gece boyunca çalkalandı. Membranlar PBS-T ile yıkandı ve ardından ikincil antikorlarla (eşek anti-tavşan 800CW ve keçi anti-sıçan 680LT (Li-Cor)) inkübe edildi. 0.01% SDS ve 0.2% Tween-20 içeren bloke edici tampon çözeltisinde 1:20.000 oranında inkübe edilen membranlar, 22 °C'de 1 saat süreyle inkübe edildi. Membranlar PBS-T ile yıkandı ve Odyssey CLx tarayıcı ile görüntülendi. Görüntüler Image Studio (sürüm 5.2) programında toplandı ve işlendi. EPP-RA izoformuna (82 kDa) karşılık gelen spesifik bir bant tespit edilmedi.
EPP'nin (histidin fosfataz alanını içeren AGAP002463-RB izoformu olarak, NCBI korunmuş alan araması 34) ve EcK2'nin (AGAP002181) kodlama bölgeleri pET-21a(+) plazmidine (Novagen Millipore Sigma) klonlandı; Primerler Genişletilmiş Veri Tablosu 2'de listelenmiştir. pET-21a(+)-EcK2 yapısının C-terminal 6xHis etiketinden önce sekiz GS4 bağlayıcı (ardışık olarak) eklenmiştir. Rekombinant proteinler, NEBExpress hücre içermeyen E. coli protein sentezi reaksiyonu (New England BioLabs) kullanılarak üretilmiştir. Rekombinant proteinler, NEBExpress Ni spin kolonları (New England BioLabs) kullanılarak saflaştırılmıştır. Dihidrofolat redüktaz (DHFR) kontrol proteini, NEBExpress Hücre İçermeyen E. coli Protein Sentezi Kiti'nden alınan DNA şablonu kullanılarak üretilmiştir. Proteinler, 3 aya kadar -20 °C'de PBS içinde %50 gliserolde saklanmıştır.
EPP ve doku özütlerinin fosfataz aktivitesi, 4-nitrofenil fosfat (pNPP; Sigma-Aldrich) kullanılarak ölçüldü. Reaksiyon tamponu 25 mM Tris, 50 mM asetik asit, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA ve 1 mM DTT içeriyordu. Doku, reaksiyon tamponunda homojenize edildi ve hücre kalıntıları santrifüjleme ile uzaklaştırıldı. Reaksiyon, 2,5 mg ml-1 pNPP içeren reaksiyon tamponuna enzim veya doku özütü eklenerek başlatıldı. Reaksiyon karışımı oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edildi ve pNPP'den dönüştürülen pNP miktarı, çeşitli zamanlarda 405 nm'deki absorbans ölçülerek belirlendi.
İn vitro EcK aktivitesi için, protein 200 µl tampon çözelti (pH 7,5) içinde 10 mM HEPES–NaOH, %0,1 BSA, 2 mM ATP ve 10 mM MgCl2 ile 27 °C'de 2 saat inkübe edildi. Reaksiyon 800 µl metanol eklenerek durduruldu, ardından -20 °C'de 1 saat soğutuldu ve daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 g'de santrifüjlendi. Süpernatant daha sonra HPLC-MS/MS ile analiz edildi. Kontrol grubunda kullanılan proteinleri ısı ile inaktive etmek için, proteinler 95 °C'de 20 dakika boyunca PBS içinde %50 gliserolde inkübe edildi.
İn vitro EPP aktivitesi için, protein 25 mM Tris, 50 mM asetik asit, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA ve 1 mM DTT içeren 100 µl tampon çözeltisinde (pH 7,5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS ile saflaştırılmış 18 çift MAG'da bulunan miktara eşdeğer) ile 27 °C'de 3 saat inkübe edildi. Reaksiyon 400 µl metanol eklenerek durduruldu ve 1 saat boyunca -20 °C'de soğutuldu, ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 g'de santrifüjlendi. Süpernatant HPLC-MS/MS ile analiz edildi.
Karışık cinsiyetli başsız sivrisinek cesetlerinden hazırlanan cDNA'dan EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ve EcK2 (556 bp) için PCR fragmanları çoğaltıldı. eGFP kontrolünün PCR fragmanı (495 bp), daha önce tanımlanan pCR2.1-eGFP'den çoğaltıldı; PCR primerleri Genişletilmiş Veri Tablosu 2'de listelenmiştir. PCR parçası, pL4440 plazmidindeki ters çevrilmiş T7 promotörleri arasına yerleştirilmiştir. Plazmid yapıları, NEB 5-α kompetan E. coli'den (New England Biolabs) elde edilmiş ve kullanımdan önce DNA dizilemesi ile doğrulanmıştır (eklenen parça dizisi için Ek Veri 1'e bakınız). T7 promotörüne uygun primerler (Genişletilmiş Veri Tablosu 2), pL4440 tabanlı plazmidden eklenen parçayı çoğaltmak için kullanılmıştır. PCR ürün boyutu, agaroz jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. dsRNA, Megascript T7 Transkripsiyon Kiti (Thermo Fisher) kullanılarak PCR şablonlarından transkribe edilmiş ve daha önce açıklanan modifikasyonlarla üreticinin talimatlarına göre saflaştırılmıştır.
dsRNA enjeksiyonu için, 10 ng nl-1 konsantrasyonunda 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP), yumurtadan çıkıştan sonraki 1 gün içinde yetişkin erkek veya dişi bireylerin toraksına enjekte edildi (Nanoject III, Drummond). Gen baskılama seviyeleri, RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve RT-qPCR ile en az üç biyolojik tekrarda belirlendi. Ecdizon enjeksiyonu için, 4 günlük veya 6 günlük bakire, kanla beslenmiş dişi bireylere, deney tasarımına bağlı olarak sırasıyla 1,3, 2,1 veya 6,3 ng nl-1 konsantrasyonlarında 0,13, 0,21 veya 0,63 µg 20E veya 3D20E (Nanoject III, Drummond) enjekte edildi. 100 nl enjekte edildi. Suda %10 (hacim/hacim) etanol; %10 etanol içinde 100 nl 3D20E22P (bir çift MAG'da bulunan miktarın %75'ine eşdeğer). Sivrisinekler rastgele enjeksiyon grubuna atandı.
Yumurta bırakma deneyleri için, 3 günlük dişi sivrisinekler insan kanıyla serbestçe beslendi. Kısmen beslenmiş veya beslenmemiş sivrisinekler uzaklaştırıldı. Tedaviye bağlı olarak, dişiler kan yemeğinden en az 48 saat sonra dört gece boyunca ayrı yumurta bırakma kaplarına yerleştirildi. Yumurtalar stereoskop (Stemi 508, Zeiss) altında sayıldı; çiftleşmiş dişiler için, larva haline gelen yumurtalar döllenmiş kabul edildi.
Çiftleşme denemeleri için, dişilere, uygulanan işleme bağlı olarak, çiftleşmeye direnç geliştirmeleri için en az 2 gün süre verildi ve daha sonra aynı kafese yaşça eşleşen yabani tip erkekler yerleştirildi. İki gece sonra, dişi döllenmiş kesecikler diseksiyon edildi ve genomik DNA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ve 25 mM NaCl (pH 8.2) içeren bir tamponda dondurma-çözme ve sonikasyon yoluyla serbest bırakıldı. Örnekler, 55 °C'de 15 dakika ve ardından 95 °C'de 10 dakika boyunca Proteinaz K (0,86 µg µl-1) ile inkübe edildi. Ham genomik DNA preparatları 10 kat seyreltildi ve Y kromozom dizilerinin qPCR ile tespiti için kullanıldı; primerler Genişletilmiş Veri Tablosu 2'de listelenmiştir. Y kromozom dizisinin yokluğu, çiftleşmenin olmadığını gösterir.
Yeniden çiftleşme deneyleri için, zorla çiftleştirilen dişiler, çiftleşme durumunu doğrulamak amacıyla çiftleşme tıkaçlarının varlığı açısından incelendi ve daha önce açıklandığı gibi 36, erkeklerin yokluğunda çiftleşmeye karşı direnç geliştirmeleri için 2 gün süre tanındı. Daha sonra DsRed transgenik sperm taşıyan erkekler dişi kafeslerine yerleştirildi. İki gece sonra, döllenme keseleri dişilerden çıkarıldı ve genomik DNA yukarıda açıklandığı gibi hazırlandı ve DsRed transgeninin qPCR ile tespiti için kullanıldı; primerler Genişletilmiş Veri Tablosu 2'de listelenmiştir. DsRed transgeninin yokluğu, yeniden çiftleşmenin gerçekleşmediğini gösterdi.
3D20E, daha önce açıklandığı gibi sentezlendi 37. Kısaca, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) 10 ml suda çözüldü, ardından 30 mg platin siyahı (toz halinde, Sigma-Aldrich) eklendi. Reaksiyon karışımına sürekli olarak hafif bir O2 akışı verildi ve karışım oda sıcaklığında karıştırıldı. 6 saat sonra, reaksiyonu durdurmak için 30 ml metanol eklendi. Karışım, katalizör parçacıklarını uzaklaştırmak için santrifüjlendi. Süpernatant, oda sıcaklığında vakum altında kurutuldu. Kurutulmuş reaksiyon ürünü, HPLC-MS/MS analizi için enjeksiyon için %10 etanol ve metanolde çözüldü. Dönüşüm oranı (20E'den 3D20E'ye) yaklaşık %97 idi (Şekil 4b) ve sentezlenen 3D20E'nin MS spektrumu, çiftleşmiş dişilerde bulunan spektrumla eşleşti (Şekil 4c).
Lejant, gerçekleştirilen istatistiksel testlerin özel ayrıntılarını içermektedir. Fisher'ın kesin testi, Mantel-Cox testi ve Student'ın t-testi GraphPad (sürüm 9.0) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Cochran-Mantel-Haenszel testleri, özel bir R betiği (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test adresinde mevcuttur) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veri dağılımı, 0,05 anlamlılık eşiği ile Shapiro-Wilk testi kullanılarak normallik açısından test edilmiştir. Veriler normallik testini geçemediğinde, Mann-Whitney testi uygulanmıştır. Sağkalım verileri Mantel-Cox testi kullanılarak analiz edilmiştir. RNA-seq gen düzeyinde diferansiyel ekspresyon analizi DESeq2 paketi (sürüm 1.28.1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Grafikteki yatay çubuk medyanı temsil etmektedir. Tüm testler için eşik olarak P = 0,05 anlamlılık değeri kullanılmıştır.
Çalışma tasarımına ilişkin daha fazla bilgi için, bu makaleye bağlantılı Nature Research Report özetine bakınız.
MS proteomik verileri, PXD032157 veri seti tanımlayıcısıyla PRIDE Ortak Deposu (https://www.ebi.ac.uk/pride/) aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na (http://proteomecentral.proteomexchange.org) yüklenmiştir.
RNA-seq veri seti, Gene Expression Comprehensive Library'de (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 seri numarası altında depolanmıştır.
Bu çalışmada oluşturulan ve/veya analiz edilen ek veri setleri, makul bir talep üzerine ilgili yazarlardan temin edilebilir. Bu makale kaynak verileri sunmaktadır.
De Loof, A. Ekdisteroidler: İhmal edilen böcek seks steroidleri mi? Erkek: Kara Kutu. Böcek Bilimi. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiecdysone ve Anopheles stephens'te yumurtalık gelişimi. J. Böcek Fizyolojisi. 28, 97–109 (1982).