Tarayıcınızda Javascript şu anda devre dışı bırakılmış durumda. Javascript devre dışı bırakıldığında bu web sitesinin bazı özellikleri çalışmayacaktır.
Lütfen bilgilerinizi ve ilgilendiğiniz ilacı belirterek kayıt olun; biz de verdiğiniz bilgileri kapsamlı veri tabanımızdaki makalelerle eşleştirip size hemen PDF kopyasını e-posta ile göndereceğiz.
Ban-Lan-Gen granülleri, bağırsak mikrobiyotasını düzenleyerek ve bağırsak SCFA Türevli GLP-1 üretimini geri kazandırarak, farelerde dekstran sodyum sülfat kaynaklı kronik tekrarlayan koliti hafifletir.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Pekin Üniversitesi Shenzhen Hastanesi Eczacılık Bölümü, Shenzhen, Çin Halk Cumhuriyeti; 2Shenzhen Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Eczacılık Fakültesi, Shenzhen, Çin Halk Cumhuriyeti; 3Guizhou Tıp Üniversitesi Etnik Tıp ve Geleneksel Çin Tıbbı Geliştirme ve Uygulama Mühendislik Teknolojisi Araştırma Merkezi, Eğitim Bakanlığı, Guizhou Eyaleti Eczacılık Anahtar Laboratuvarı, Guizhou Tıp Üniversitesi, Guiyang, Çin Halk Cumhuriyeti; 4 Gastroenteroloji Bölümü, Pekin Üniversitesi Shenzhen Hastanesi, Shenzhen, Çin Halk Cumhuriyeti; 5 Eczacılık Fakültesi, Guizhou Tıp Üniversitesi, Tıbbi Bitki Fonksiyonu ve Uygulaması Devlet Anahtar Laboratuvarı, Guiyang; 6 Laboratuvar Tıp Bölümü, Pekin Üniversitesi Shenzhen Hastanesi, Shenzhen, Çin [email protected] Shen Xiangchun, Eczacılık Fakültesi, Guizhou Tıp Üniversitesi, Guizhou, Çin Halk Cumhuriyeti, 550004, E-posta [email protected] Amaç: GLP-1 bazlı tedavi, inflamatuar bağırsak hastalığı için yeni bir tedavi seçeneğidir. Ban-Lan-Gen (BLG) granülleri, çeşitli inflamatuar durumların tedavisinde potansiyel anti-inflamatuar aktivite gösteren bilinen bir antiviral TCM formülasyonudur. Bununla birlikte, kolit üzerindeki anti-inflamatuar etkisi ve etki mekanizması hala belirsizdir. YÖNTEMLER: Farelerde dekstran sodyum sülfat (DSS) ile indüklenen kronik tekrarlayan kolit oluşturmak. BLG'nin koruyucu etkisini değerlendirmek için hastalık aktivite indeksleri, hasarın histolojik belirteçleri ve proinflamatuar sitokin düzeyleri incelendi. BLG'nin bağırsak mikrobiyotası ve bağırsak üzerindeki etkileri, serum GLP-1 düzeyleri ve kolonik Gcg, GPR41 ile karakterize edildi. BLG tedavisi, GRP43 ekspresyonunu, bağırsak mikrobiyota bileşimini, dışkıdaki kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) seviyelerini ve birincil fare kolon epitel hücrelerinden GLP-1 salınımını ve SCFA kaynaklı GLP-1 üretimini önemli ölçüde azalttı. Sonuçlar: BLG tedavisi, vücut ağırlığı kaybını, DAI'yi, kolon kısalmasını, kolon dokusu hasarını ve kolon dokusundaki TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi proinflamatuar sitokin seviyelerini önemli ölçüde azalttı. Ek olarak, BLG tedavisi, kolitli farelerde kolondaki Gcg, GPR41 ve GRP43 ekspresyonunu ve serum GLP-1 seviyelerini önemli ölçüde geri kazandırabilir ve Akkermansia ve Prevotellaceae_UCG-001 gibi SCFA üreten bakterileri artırarak ve Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ve Oscillibacter gibi bakterilerin bolluğunu azaltarak bunu sağlar. Ayrıca, BLG tedavisi, kolitli farelerin dışkısındaki SCFA seviyesini önemli ölçüde artırabilir. Aynı zamanda, in vitro deneyler, BLG ile tedavi edilen farelerin dışkı özütünün, birincil küçük fare kolon epitel hücrelerinin GLP-1 salgılamasını büyük ölçüde uyarabildiğini de göstermiştir. Sonuç: Bu bulgular, BLG'nin anti-kolit etkisi olduğunu düşündürmektedir. BLG, en azından kısmen bağırsak mikrobiyotasını modüle ederek ve bağırsak kısa zincirli yağ asitlerinden türetilen GLP-1 üretimini geri kazandırarak, kronik tekrarlayan kolit için umut vadeden bir ilaç olarak geliştirilme potansiyeline sahiptir. Anahtar kelimeler: kolit, Ban-Lan-Gen granülleri, bağırsak mikrobiyotası, kısa zincirli yağ asitleri, GLP-1
Ülseratif kolit (ÜK), tekrarlayan ishal, karın ağrısı, kilo kaybı ve mukopürülan kanlı dışkı ile karakterize, kolon ve rektumun uzun süreli inflamatuar bir hastalığıdır.¹ Son zamanlarda, Batı yaşam tarzlarının artan popülaritesiyle birlikte, Çin de dahil olmak üzere daha önce düşük insidanslı ülkelerde ÜK prevalansı artmaktadır.² Bu artış, halk sağlığı için büyük sorunlar oluşturmakta ve hastaların çalışma yeteneği ve yaşam kalitesi üzerinde ciddi sonuçlar doğurmaktadır. Özellikle, ÜK'nin patogenezi büyük ölçüde belirsizliğini korumaktadır, ancak genel olarak genetik, çevresel faktörler, bağırsak mikrobiyotası ve bağışıklık sisteminin ÜK gelişimine katkıda bulunduğu kabul edilmektedir.³ Şu anda bile ÜK için bir tedavi bulunmamaktadır ve tedavinin amacı klinik olarak klinik semptomları kontrol etmek, remisyonu sağlamak ve sürdürmek, mukozal iyileşmeyi teşvik etmek ve tekrarlamayı azaltmaktır. Klasik tedaviler arasında aminosalisilatlar, kortikosteroidler, immünosupresanlar ve biyolojik ilaçlar yer almaktadır. Bununla birlikte, bu ilaçlar çeşitli yan etkileri nedeniyle istenen etkiyi sağlayamamaktadır.⁴ Son zamanlarda birçok vaka çalışması göstermiştir ki Geleneksel Çin tıbbının (GÇT), düşük toksisite ile ülseratif kolitin (ÜK) hafifletilmesinde büyük potansiyel gösterdiği ve yeni GÇT tedavilerinin geliştirilmesinin ÜK için umut vadeden bir tedavi stratejisi olduğu öne sürülmüştür.5-7
Banlangen Granülleri (BLG), Banlangen kökünün su özütünden yapılan geleneksel bir Çin tıbbi preparatıdır.8 Antiviral etkinliğine ek olarak, BLG çeşitli inflamatuar durumların tedavisinde potansiyel anti-inflamatuar aktivite göstermektedir.9,10 Ayrıca, Radix isatidis'in sulu özütlerinden glukosinolatlar (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin ve glukozit) ve nükleozitler (hipoksantin, adenozin, uridin ve guanozin) ve indigo ve indirubin gibi indigo alkaloidleri izole edilmiş ve tanımlanmıştır.11,12 Önceki çalışmalar, adenozin, uridin ve indirubin bileşiklerinin farklı hayvan kolit modellerinde güçlü anti-kolit etkileri gösterdiğini iyi bir şekilde belgelemiştir.13-17 Bununla birlikte, BLG'nin kolitteki etkinliğini değerlendirmek için kanıta dayalı hiçbir çalışma yapılmamıştır. Bu çalışmada, BLG'nin dekstran sodyum sülfat üzerindeki koruyucu etkisini araştırdık. C57BL/6 farelerinde (DSS) kaynaklı kronik tekrarlayan kolit üzerinde yapılan çalışmada, BLG'nin oral yolla uygulanmasının DSS kaynaklı kronik tekrarlayan kolon iltihabını önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. İltihaplanma ve düzenleyici mekanizmaları, bağırsak mikrobiyotasının modülasyonu ve bağırsak kaynaklı glukagon benzeri peptid-1 (GLP-1) üretiminin restorasyonu ile ilişkilidir.
BLG granülleri (şekersiz, NMPA onaylı Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pekin, Çin; parti numarası: 20110966) eczanelerden satın alındı. DSS (Moleküler Ağırlık: 36.000–50.000 Dalton) MP Biologicals'tan (Santa Ana, ABD) satın alındı. Sülfasalazin (SASP) (≥ %98 saflık), hematoksilin ve eozin Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. Fare TNF-α, IL-1β ve IL-6 Luminex Elisa test kitleri R&D Systems'ten (Minneapolis, MN, ABD) satın alındı. Asetik asit, propiyonik asit ve bütirik asit Aladdin Industries'ten (Şanghay, Çin) satın alındı. 2-Etilbütirik asit Merck'ten satın alındı. KGaA (Darmstadt, Almanya).
6-8 haftalık erkek C57BL/6 fareler (vücut ağırlığı 18-22 g), Beijing Wetahe Laboratuvar Hayvan Teknolojisi Şirketi'nden (Pekin, Çin) satın alındı ​​ve 12 saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip 22 ± 2 °C'lik bir ortamda barındırıldı. Fareler, yeni ortama alışmaları için bir hafta boyunca standart kemirgen diyetiyle beslendi ve içme suyuna serbest erişim sağlandı. Daha sonra fareler rastgele dört gruba ayrıldı: kontrol grubu, DSS model grubu, SASP ile tedavi edilen grup (200 mg/kg, oral) ve BLG ile tedavi edilen grup (1 g/kg, oral). Şekil 1A'da gösterildiği gibi, önceki çalışmamıza göre, farelerde deneysel kronik tekrarlayan kolit, 5 gün boyunca %1,8'lik DSS'nin üç döngüsü ve ardından 7 gün boyunca damıtılmış su ile indüklendi.18 SASP ve BLG ile tedavi edilen gruplardaki fareler, sırasıyla SASP ve BLG ile her gün tedavi edildi. 0. günden itibaren. Ön deneylere göre, BLG dozu 1 g/kg olarak belirlendi. Bu arada, literatüre göre SASP dozu 200 mg/kg olarak belirlendi.4 Kontrol ve DSS model gruplarına deney boyunca aynı hacimde su verildi.
Şekil 1 BLG, farelerde DSS kaynaklı kronik tekrarlayan koliti iyileştirir. (A) Kronik tekrarlayan kolit ve tedavi deney tasarımı, (B) vücut ağırlığı değişimi, (C) hastalık aktivite indeksi (DAI) skoru, (D) kolon uzunluğu, (E) kolonun temsili görüntüsü, (F) H&E boyamalı kolon (büyütme, ×100) ve (G) histolojik skor. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (n = 6). ##p < 0,01 veya ###p < 0,001 kontrol (Con) grubuna kıyasla; *p < 0,05 veya **p < 0,01 veya ***p < 0,001 DSS grubuna kıyasla.
Vücut ağırlığı, dışkı kıvamı ve rektal kanama günlük olarak kaydedildi. Hastalık aktivite indeksi (DAI), daha önce açıklandığı gibi vücut ağırlığı, dışkı kıvamı ve rektal kanama skorlarının birleştirilmesiyle belirlendi.19 Deneyin sonunda tüm fareler ötenazi edildi ve daha sonraki deneyler için kan, dışkı ve kolon toplandı.
Kolon dokusu formalinle sabitlendi ve parafine gömüldü. 5 mikronluk kesitler alındı ​​ve hematoksilin-eozin (H&E) ile boyandı, ardından körleme yapıldı ve daha önce açıklandığı gibi puanlandı.19
Kolon dokusunun toplam RNA'sı Trizol reaktifi (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile ekstrakte edildi, ardından ters transkriptaz (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japonya) ile cDNA ekstraksiyonu yapıldı. Kantitatif PCR, SYBR Green Master (Roche, Basel, İsviçre) ile gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Hedef gen transkriptleri β-aktine göre normalize edildi ve veriler 2-ΔΔCT yöntemi kullanılarak analiz edildi. Gen primer dizileri Tablo 1'de gösterilmiştir.
Primer fare kolon epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi.20 Kısaca, 6-8 haftalık farelerin kolonları, servikal dislokasyonla öldürüldükten sonra önce çıkarıldı, ardından uzunlamasına açıldı, Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS, kalsiyum ve magnezyum içermeyen) ile muamele edildi ve 0,5-1 mm'lik küçük parçalara ayrıldı. Daha sonra, dokular serbest DMEM ortamında 0,4 mg/mL kollajenaz XI (Sigma, Poole, İngiltere) ile sindirildi ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüjlendi. Pelet, 37 °C'de DMEM ortamında ( %10 fetal sığır serumu, 100 Ünite/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş) yeniden süspansiyon haline getirildi ve naylon bir ağdan (gözenek boyutu ~250 µm) geçirildi. Kolon epitel hücrelerinin alikotları cam tabanlı kaplara yerleştirildi. Kaplara konulan örnekler, asetik asit, propiyonik asit, bütirik asit ve fare dışkısı özütleriyle 37°C'de, %5 CO2 ortamında 2 saat süreyle inkübe edildi.
Kolon dokusu PBS ile homojenize edildi ve kolon dokusundaki IL-6, TNF-α ve IL-1β sitokinlerinin düzeyleri Luminex ELISA test kitleri (R&D Systems, Minneapolis, MN, ABD) kullanılarak tespit edildi. Benzer şekilde, birincil fare kolon epitelyal hücrelerinin serum ve kültür ortamındaki GLP-1 düzeyleri, üreticinin talimatlarına göre bir ELISA kiti (Bioswamp, Wuhan, Çin) ile belirlendi.
Dışkıdan toplam DNA, bir DNA ekstraksiyon kiti (Tiangen, Çin) kullanılarak ekstrakte edildi. DNA'nın kalitesi ve miktarı sırasıyla 260 nm/280 nm ve 260 nm/230 nm oranlarında ölçüldü. Daha sonra, ekstrakte edilen her DNA'yı şablon olarak kullanarak, 16S rRNA geninin V3-V4 bölgelerini farklı bölgelerde çoğaltmak için spesifik primerler 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) ve 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) kullanıldı. PCR ürünleri, QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (QIAGEN, Almanya) kullanılarak saflaştırıldı, gerçek zamanlı PCR ile nicelendirildi ve IlluminaMiseq PE300 sekanslama platformu (Illumina Inc., CA, ABD) kullanılarak sekanslandı. Biyoinformatik analiz için, veri işleme daha önce bildirilen protokollere göre gerçekleştirildi.21,22 Kısaca, Cutadapt kullanıldı. (V1.9.1) sürümü, ham express dosyalarını filtrelemek için kullanıldı. OTU'lar, %97'lik bir benzerlik eşiği ile UPARSE (sürüm 7.0.1001) kullanılarak kümelendi ve kimerik dizileri kaldırmak için UCHIME kullanıldı. Topluluk bileşimi analizi ve sınıflandırması, SILVA ribozomal RNA gen veritabanına dayalı olarak RDP sınıflandırıcısı (http://rdp.cme.msu.edu/) kullanılarak gerçekleştirildi.
Kısa zincirli yağ asitlerinin (asetik asit, propiyonik asit ve bütirik asit) seviyeleri, Tao ve ark. tarafından daha önce açıklandığı gibi, bazı değişikliklerle ölçülmüştür.23 Kısaca, 100 mg dışkı önce 0,4 mL deiyonize suda, ardından 0,1 mL %50 sülfürik asit ve 0,5 mL 2-etilbütirik asit (dahili standart) ile süspansiyon haline getirilmiş, daha sonra homojenize edilmiş ve 4°C'de ısıtılmıştır. Santrifüj işlemi 12.000 rpm'de 15 dakika boyunca C'de gerçekleştirildi. Süpernatant 0,5 mL eter ile ekstrakte edildi ve analiz için GC'ye enjekte edildi. Gaz kromatografisi (GC) analizi için numuneler, alev iyonizasyon dedektörü (FID) ile donatılmış bir GC-2010 Plus gaz kromatografı (Shimadzu, Inc.) kullanılarak analiz edildi. Ayırma işlemi, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Çin) ZKAT-624 kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler, GC solution yazılımı (Shimadzu, Inc.) kullanılarak elde edildi. Bölme oranı 10:1, taşıyıcı gaz azot ve akış hızı 6 mL/dak idi. Enjeksiyon hacmi 1 μL idi. Enjektör ve dedektör sıcaklığı 300°C idi. Fırın sıcaklığı 13,5 dakika boyunca 140°C'de tutuldu, ardından artırıldı. Sıcaklık 250°C'ye dakikada 120°C artırıldı; sıcaklık 5 dakika boyunca sabit tutuldu.
Veriler ortalama ± standart hata (SEM) olarak sunulmuştur. Verilerin anlamlılığı, tek yönlü ANOVA ve ardından Duncan'ın çoklu aralık testi ile değerlendirilmiştir. Tüm hesaplamalar için GraphPad Prism 5.0 yazılımı (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ABD) kullanılmış ve p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Ülseratif kolitin (UC), şiddetli karın ağrısı, ishal ve kanama ile seyreden kronik tekrarlayan bir kolit hastalığı olduğu iyi bilinmektedir. Bu nedenle, BLG'nin anti-kolit etkinliğini değerlendirmek için farelerde DSS kaynaklı kronik tekrarlayan kolit modeli oluşturulmuştur (Şekil 1A). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, DSS model grubundaki farelerin vücut ağırlığı önemli ölçüde azalmış ve DAI değerleri daha yüksek bulunmuştur; bu değişiklikler 24 günlük BLG tedavisi sonrasında önemli ölçüde tersine çevrilmiştir (Şekil 1B ve C). Kolon kısalması, UC'nin önemli bir özelliğidir. Şekil 1D ve E'de gösterildiği gibi, DSS alan farelerin kolon uzunlukları önemli ölçüde kısalmış, ancak BLG tedavisi ile bu durum düzelmiştir. Daha sonra, kolon iltihabını değerlendirmek için histopatolojik analiz yapılmıştır. H&E boyalı görüntüler ve patolojik skorlar, DSS uygulamasının kolon mimarisini önemli ölçüde bozduğunu ve kript yıkımına yol açtığını, BLG tedavisinin ise kript yıkımını ve patolojik skorları önemli ölçüde azalttığını göstermiştir (Şekil 1F ve G). Özellikle, koruyucu etkisi 1 g/Kg dozundaki BLG, 200 mg/Kg dozundaki SASP ile karşılaştırılabilir düzeydeydi. Toplu olarak, bu bulgular BLG'nin farelerde DSS kaynaklı kronik tekrarlayan kolitin şiddetini azaltmada etkili olduğunu göstermektedir.
TNF-α, IL-1β ve IL-6, kolon iltihabının önemli inflamatuar belirteçleridir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, DSS, kontrol grubuna kıyasla kolonda TNF-α, IL-1β ve IL-6 gen ekspresyonunda önemli bir artışa neden olmuştur. BLG uygulaması, DSS aracılı bu değişiklikleri önemli ölçüde tersine çevirebilir. Daha sonra, kolon dokusundaki inflamatuar sitokinler TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyelerini belirlemek için ELISA kullandık. Sonuçlar ayrıca, DSS ile tedavi edilen farelerde kolondaki TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyelerinin önemli ölçüde arttığını, BLG tedavisinin ise bu artışları hafiflettiğini göstermiştir (Şekil 2B).
Şekil 2 BLG, DSS ile tedavi edilen farelerin kolonunda proinflamatuar sitokinler TNF-α, IL-1β ve IL-6'nın gen ekspresyonunu ve üretimini inhibe eder. (A) Kolonda TNF-α, IL-1β ve IL-6 gen ekspresyonu; (B) kolonda TNF-α, IL-1β ve IL-6 protein seviyeleri. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (n = 4–6). #p < 0,05 veya ##p < 0,01 veya ###p < 0,001 kontrol (Con) grubuna kıyasla; *p < 0,05 veya **p < 0,01 DSS grubuna kıyasla.
Bağırsak disbiyozu, Ülseratif Kolit (ÜK) patogenezinde kritik öneme sahiptir.24 BLG'nin DSS ile tedavi edilen farelerin bağırsak mikrobiyotasını modüle edip etmediğini araştırmak için, bağırsak içeriğinin bakteri topluluğunu analiz etmek amacıyla 16S rRNA dizilemesi yapıldı. Venn diyagramı, üç grubun 385 OTU'yu paylaştığını göstermektedir. Aynı zamanda, her grubun kendine özgü OTU'ları vardı (Şekil 3A). Ayrıca, Şekil 3B ve C'de gösterilen Chao1 indeksi ve Shannon indeksi, BLG ile tedavi edilen grupta Shannon indeksinin önemli ölçüde azalması nedeniyle, bağırsak mikrobiyotasının topluluk çeşitliliğinin BLG ile tedavi edilen farelerde azaldığını göstermiştir. Üç grup arasındaki kümeleme modellerini belirlemek için temel bileşen analizi (PCA) ve temel koordinat analizi (PCoA) kullanıldı ve DSS ile tedavi edilen farelerin topluluk yapısının BLG tedavisinden sonra açıkça ayrıldığı gösterildi (Şekil 3D ve E). Bu veriler, BLG tedavisinin ÜK'li farelerin topluluk yapısını önemli ölçüde etkilediğini göstermektedir. DSS kaynaklı kolit.
Şekil 3 BLG, DSS kaynaklı kolitli farelerde bağırsak mikrobiyotasının çeşitliliğini değiştirir. (A) OTU'nun Venn diyagramı, (B) Chao1 indeksi, (C) Shannon zenginlik indeksi, (D) OTU'nun Temel Bileşen Analizi (PCA) puan grafiği, (E) OTU Temel Koordinat Analizi (PCoA) puanı. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (n = 6). **p < 0,01, DSS grubuna kıyasla.
Dışkı mikrobiyotasındaki spesifik değişiklikleri değerlendirmek için, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini tüm taksonomik seviyelerde analiz ettik. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, tüm gruplardaki ana filumlar Firmicutes ve Bacteroidetes, ardından Verrucobacterium idi. Firmicutes ve Firmicutes/Bacteroidetes oranlarının nispi bolluğu, kontrol farelerine kıyasla DSS ile tedavi edilen farelerin dışkı mikrobiyal topluluklarında önemli ölçüde artmıştı ve bu değişiklikler BLG tedavisi sonrasında önemli ölçüde tersine döndü. Özellikle, BLG tedavisi, DSS kaynaklı kolitli farelerin dışkısında Verrucobacterium'un nispi bolluğunu önemli ölçüde artırdı. Ev düzeyinde, dışkı mikrobiyal toplulukları Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae ve Prevotellaceae tarafından işgal edildi (Şekil 4B). DSS grubuyla karşılaştırıldığında, BLG'nin tükenmesi Akkermansiaceae'nin bolluğunu artırdı, ancak bolluğunu azalttı. Lachnospiraceae ve Ruminococcaceae. Özellikle cins düzeyinde, dışkı mikrobiyotası Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia ve Prevotellaceae_UCG-001 tarafından işgal edildi (Şekil 4C). Bu bulgu ayrıca, BLG tedavisinin, Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas ve Oscillibacter'da azalma ve Akkermansia ve Prevotellaceae_UCG-001'de artış ile karakterize edilen DSS zorlamasına yanıt olarak mikrobiyota dengesizliğini etkili bir şekilde tersine çevirdiğini gösterdi.
Şekil 4 BLG, DSS kaynaklı kolitli farelerde bağırsak mikrobiyota bolluğunu değiştirir. (A) Filum düzeyinde bağırsak mikrobiyota bolluğu; (B) Aile düzeyinde bağırsak mikrobiyota bolluğu; (C) Cins düzeyinde bağırsak mikrobiyota bolluğu. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (n = 6). #p < 0,05 veya ###p < 0,001 kontrol (Con) grubuna kıyasla; *p < 0,05 veya **p < 0,01 veya ***p < 0,001 DSS grubuna kıyasla.
Kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA'lar) Akkermansia ve Prevotellaceae_UCG-001'in başlıca metabolitleri olduğu, asetat, propiyonat ve bütiratın ise bağırsak lümeninde en bol bulunan SCFA'lar olduğu göz önüne alındığında, 25-27 çalışmamızda hala bu konuya değiniyoruz. Şekil 5'te gösterildiği gibi, DSS ile tedavi edilen grupta dışkıdaki asetat, propiyonat ve bütirat konsantrasyonları önemli ölçüde azalırken, BLG tedavisi bu azalmayı büyük ölçüde baskılayabildi.
Şekil 5. BLG, DSS kaynaklı kolitli farelerin dışkılarındaki kısa zincirli yağ asitleri (SCFA) seviyelerini artırır. (A) Dışkıdaki asetik asit içeriği; (B) dışkıdaki propiyonik asit içeriği; (C) dışkıdaki bütirik asit içeriği. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (n = 6). #p < 0,05 veya ##p < 0,01 kontrol (Con) grubuna kıyasla; *p < 0,05 veya **p < 0,01 DSS grubuna kıyasla.
Ayrıca, cins düzeyindeki farklı SCFA'lar ile dışkı mikrobiyotası arasındaki Pearson korelasyon katsayısını hesapladık. Şekil 6'da gösterildiği gibi, Akkermansia, propiyonik asit (Pearson = 0,4866) ve bütirik asit (Pearson = 0,6192) üretimiyle pozitif korelasyon gösterdi. Buna karşılık, hem Enteromonas hem de Oscillobacter, sırasıyla 0,4709 ve 0,5104 Pearson katsayılarıyla asetat üretimiyle negatif ilişki gösterdi. Benzer şekilde, Ruminococcaceae_UCG-014, sırasıyla propiyonik asit (Pearson = 0,4508) ve bütirik asit (Pearson = 0,5842) üretimiyle negatif korelasyon gösterdi.
Şekil 6. Diferansiyel SCFA'lar ve kolon mikropları arasındaki Pearson korelasyon analizi. (A) Asetik asit ile Enteromonas; (B) Asetik asit ile Concussion Bacillus; (C) Propiyonik asit ile Akkermansia; (D) Propiyonik asit ile Ruminococcus_UCG-014; (E) Butirik asit ile Akkermansia; (F) Butirik asit ile Ruminococcus_UCG-014.
Glukagon benzeri peptid-1 (GLP-1), anti-enflamatuar özelliklere sahip proglukagonun (Gcg) hücre tipine özgü bir post-translasyonel ürünüdür.28 Şekil 7'de gösterildiği gibi, DSS, Gcg mRNA ekspresyonunda önemli bir azalmaya neden olmuştur. Kolon ve BLG tedavisi, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında DSS'nin neden olduğu Gcg azalmasını önemli ölçüde tersine çevirebilmiştir (Şekil 7A). Aynı zamanda, DSS ile tedavi edilen grupta serumdaki GLP-1 seviyesi önemli ölçüde azalmış ve BLG tedavisi bu azalmayı büyük ölçüde önleyebilmiştir (Şekil 7B). Kısa zincirli yağ asitleri, G-protein-bağlı reseptör 43 (GRP43) ve G-protein-bağlı reseptör 41 (GRP41) aktivasyonu yoluyla GLP-1 salgılanmasını uyarabildiğinden, kolitli farelerin kolonunda GRP41 ve GRP43'ü de inceledik ve DSS'den sonra kolondaki GRP43 ve GRP41 mRNA ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını bulduk. Bu bir zorluktu ve BLG tedavisi bu azalmaları etkili bir şekilde giderebilirdi (Şekil 7C ve D).
Şekil 7 BLG, DSS ile tedavi edilen farelerde serum GLP-1 düzeylerini ve kolonik Gcg, GPR41 ve GRP43 mRNA ekspresyonunu artırır. (A) Kolon dokusunda Gcg mRNA ekspresyonu; (B) Serumda GLP-1 düzeyi; (C) Kolon dokusunda GPR41 mRNA ekspresyonu; (D) Kolon dokusunda GPR43 mRNA ekspresyonu. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur (n = 5–6). #p < 0,05 veya ##p < 0,01 kontrol (Con) grubuna kıyasla; *p < 0,05 DSS grubuna kıyasla.
BLG tedavisinin DSS ile tedavi edilen farelerde serum GLP-1 düzeylerini, kolonik Gcg mRNA ekspresyonunu ve dışkı SCFA düzeylerini artırabileceği göz önüne alındığında, kontrol (F-Con), DSS koliti (F-Con) ve BLG ile tedavi edilen kolit (F-BLG) farelerinden elde edilen örneklerde, birincil fare kolon epitel hücrelerinden GLP-1 salınımı üzerindeki asetat, propiyonat ve bütiratın etkilerini daha ayrıntılı olarak inceledik. Şekil 8A'da gösterildiği gibi, sırasıyla 2 mM asetik asit, propiyonik asit ve bütirik asit ile tedavi edilen birincil fare kolon epitel hücreleri, önceki çalışmalarla tutarlı olarak GLP-1 salınımını önemli ölçüde uyardı.29,30 Benzer şekilde, tüm F-Con, F-DSS ve F-BLG (0,25 g dışkıya eşdeğer) birincil fare kolon epitel hücrelerinden GLP-1 salınımını büyük ölçüde uyardı. Özellikle, F-DSS ile tedavi edilen birincil farelerden salınan GLP-1 miktarı, Kolon epitel hücrelerindeki GLP-1 seviyesi, F-Con ve F-BLG ile tedavi edilen birincil fare kolon epitel hücrelerine göre çok daha düşüktü (Şekil 8B). Bu veriler, BLG tedavisinin bağırsak SCFA kaynaklı GLP-1 üretimini önemli ölçüde geri kazandırdığını göstermektedir.
Şekil 8 BLG'den türetilen SCFA, birincil fare kolon epitel hücrelerinden GLP-1 salınımını uyarır. (A) Asetik asit, propiyonik asit ve bütirik asit, birincil fare kolon epitel hücrelerinden GLP-1 salınımını uyardı; (B) dışkı özütleri F-Con, F-DSS ve F-BLG, birincil fare kolon epitel hücrelerinden salınan GLP-1 miktarını uyardı. Kolon epitel hücrelerinin örnekleri cam tabanlı petri kaplarına yerleştirildi ve sırasıyla 2 mM asetik asit, propiyonik asit, bütirik asit ve dışkı özütleri F-Con, F-DSS ve F-BLG (0,25 g dışkıya eşdeğer) ile muamele edildi. Sırasıyla 37°C'de, %5 CO2'de 2 saat süreyle inkübe edildi. Birincil fare kolon epitel hücrelerinden salınan GLP-1 miktarı ELISA ile tespit edildi. Veriler ortalama ± SEM (n = 3) olarak sunulmuştur. #p < 0,05 veya ##p < 0,01 boş veya F-Con'a kıyasla; *p < 0,05 F-DSS'ye kıyasla.
Kısaltmalar: Ace, asetik asit; Pro, propiyonik asit; however, bütirik asit; F-Con, kontrol farelerinden elde edilen dışkı özütü; F-DSS, kolitli farelerden elde edilen dışkı özütü; F-BLG, BLG ile tedavi edilen kolondan elde edilen dışkı özütü. İltihaplı farelerin dışkı özütleri.
Dünya Sağlık Örgütü tarafından tedaviye dirençli bir hastalık olarak listelenen ülseratif kolit, küresel bir tehlike haline geliyor; Ancak, hastalığı tahmin etme, önleme ve tedavi etme konusunda etkili yöntemler hala sınırlıdır. Bu nedenle, Ülseratif Kolit (ÜK) için yeni, güvenli ve etkili tedavi stratejilerinin araştırılması ve geliştirilmesi acil bir ihtiyaçtır. Geleneksel Çin tıbbı preparatları umut vadeden bir seçenektir çünkü birçok geleneksel Çin tıbbı preparatının yüzyıllar boyunca Çin popülasyonunda ÜK tedavisinde etkili olduğu gösterilmiştir ve bunların çoğu insan ve hayvanlar için çoğunlukla zararsız olan biyolojik organik ve doğal malzemelerdir.31,32 Bu çalışma, ÜK tedavisi için güvenli ve etkili bir geleneksel Çin tıbbı preparatı aramayı ve etki mekanizmasını araştırmayı amaçlamıştır. BLG, grip tedavisinde kullanılan iyi bilinen bir Çin bitkisel formülüdür.8,33 Laboratuvarımızda ve diğer laboratuvarlarda yapılan çalışmalar, BLG ile aynı ham maddeden işlenmiş bir geleneksel Çin tıbbı ürünü olan indigonun, insanlarda ve hayvanlarda ÜK tedavisinde önemli bir etkinlik gösterdiğini ortaya koymuştur.4,34 Bununla birlikte, BLG'nin anti-kolit etkileri ve etki mekanizması belirsizdir. Mevcut çalışmada, sonuçlarımız BLG'nin DSS kaynaklı ÜK'yi etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Bağırsak mikrobiyotasının düzenlenmesi ve bağırsak kaynaklı GLP-1 üretiminin yeniden sağlanmasıyla ilişkili olan kolon iltihabı.
Ülseratif kolitin, kilo kaybı, ishal, rektal kanama ve yaygın kolon mukozal hasarı gibi tipik klinik özelliklere sahip tekrarlayan dönemlerle karakterize olduğu iyi bilinmektedir.35 Bu nedenle, kronik tekrarlayan kolit, beş gün boyunca %1,8 DSS'nin üç döngüsü uygulanarak ve ardından yedi gün boyunca içme suyu verilerek oluşturulmuştur. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, dalgalanan kilo kaybı ve DAI skorları, kronik tekrarlayan kolitin başarılı bir şekilde indüklendiğini göstermiştir. BLG ile tedavi edilen gruptaki fareler, 8. günden itibaren önemli ölçüde farklı bir iyileşme göstermiş ve bu durum 24. günden itibaren belirgin bir şekilde farklılık göstermiştir. Aynı değişiklikler DAI skorunda da gözlemlenmiş olup, kolitin klinik iyileşmesinde bir gelişme olduğunu düşündürmektedir. Kolon hasarı ve inflamatuvar durum açısından, kolon uzunluğu, kolon dokusu hasarı ve kolon dokusundaki proinflamatuar sitokinler TNF-α, IL-1β ve IL-6'nın gen ekspresyonu ve üretimi de BLG tedavisinden sonra büyük ölçüde iyileşmiştir. Toplu olarak, bu sonuçlar BLG'nin tedavide etkili olduğunu açıkça göstermektedir. Farelerde kronik tekrarlayan kolit hastalığının incelenmesi.
BLG farmakolojik etkilerini nasıl gösterir? Daha önceki birçok çalışma, bağırsak mikrobiyotasının Ülseratif Kolit (ÜK) patogenezinde önemli bir rol oynadığını ve mikrobiyom bazlı ve mikrobiyom hedefli tedavilerin ÜK tedavisi için çok cazip bir strateji olarak ortaya çıktığını göstermiştir. Bu çalışmada, BLG tedavisinin bağırsak mikrobiyota bileşiminde önemli değişikliklere yol açtığını gösterdik ve bu da BLG'nin DSS kaynaklı kolite karşı koruyucu etkisinin bağırsak mikrobiyotasının modülasyonuyla ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Bu gözlem, bağırsak mikrobiyotasının homeostazının yeniden programlanmasının, Geleneksel Çin Tıbbı (GÇT) preparatlarının etkinliğini anlamak için önemli bir yaklaşım olduğu fikriyle tutarlıdır.36,37 Özellikle, Akkermansia, bağırsak mukus tabakasında yaşayan, mukusları parçalayan, propiyonik asit üreten, goblet hücre farklılaşmasını uyaran ve mukozayı koruyan Gram-negatif ve kesinlikle anaerobik bir bakteridir. Bariyer bütünlüğünün işlevi.26 Çok sayıda klinik ve hayvan verisi, Akkermansia'nın sağlıklı mukoza ile yüksek oranda ilişkili olduğunu38 ve Akkermansia spp.'nin oral yolla uygulanmasının Mukozal inflamasyonu önemli ölçüde iyileştirebilir.39 Mevcut verilerimiz, BLG tedavisi sonrasında Akkermansia'nın nispi bolluğunun önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Ayrıca, Prevotellaceae_UCG-001, SCFA üreten bir bakteridir.27 Birçok çalışma, Prevotellaceae_UCG-001'in kolitli hayvanların dışkısında düşük nispi bollukta bulunduğunu göstermiştir.40,41 Mevcut verilerimiz ayrıca, BLG tedavisinin DSS ile tedavi edilen farelerin kolonunda Prevotellaceae_UCG-001'in nispi bolluğunu önemli ölçüde artırabileceğini göstermektedir. Buna karşılık, Oscillibacter mezofilik, kesinlikle anaerobik bir bakteridir.42 Oscillibacter'in nispi bolluğunun UC farelerinde önemli ölçüde arttığını ve IL-6 ve IL-1β seviyeleri ve patolojik skorlarla önemli ölçüde pozitif korelasyon gösterdiğini bildirmiştir.43,44 Özellikle, BLG tedavisi, Oscillibacter'in nispi bolluğunu dışkıda önemli ölçüde azaltmıştır. DSS ile tedavi edilen farelerde, özellikle bu BLG ile değiştirilmiş bakterilerin en fazla SCFA üreten bakteriler olduğu gözlemlenmiştir. Daha önceki birçok çalışma, SCFA'ların kolon iltihabı üzerindeki potansiyel faydalı etkilerini ve bağırsak epitel bütünlüğünün korunmasını göstermiştir.45,46 Mevcut verilerimiz ayrıca, DSS ile tedavi edilen dışkıdaki SCFA asetat, propiyonat ve bütirat konsantrasyonlarının BLG ile tedavi edilen farelerde büyük ölçüde arttığını gözlemlemiştir. Sonuç olarak, bu bulgular, BLG tedavisinin kronik tekrarlayan kolitli farelerde DSS kaynaklı SCFA üreten bakterileri etkili bir şekilde artırabileceğini açıkça göstermektedir.
GLP-1, esas olarak ileum ve kolonda üretilen ve mide boşalmasını geciktirmede ve yemek sonrası kan şekerini düşürmede önemli rol oynayan bir inkretindir.47 Kanıtlar, bir GLP-1 reseptör agonisti olan dipeptidil peptidaz (DPP)-4'ün ve bir GLP-1 nanomedikal ilacının farelerde bağırsak iltihabını etkili bir şekilde hafifletebileceğini göstermektedir.48-51 Önceki çalışmalarda bildirildiği gibi, yüksek SCFA konsantrasyonları insanlarda ve farelerde plazma GLP-1 seviyeleriyle ilişkilendirilmiştir.52 Mevcut verilerimiz, BLG tedavisinden sonra serum GLP-1 seviyelerinin ve Gcg mRNA ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Benzer şekilde, BLG ile tedavi edilen kolitli farelerden elde edilen dışkı özütleriyle uyarılmanın ardından kolon kültürlerinde GLP-1 salınımı, DSS ile tedavi edilen kolitli farelerden elde edilen dışkı özütleriyle uyarılmaya kıyasla önemli ölçüde artmıştır. SCFA'lar GLP-1 salınımını nasıl etkiler? Gwen Tolhurst ve ark. SCFA'ların GRP43 ve GPR41 aracılığıyla GLP-1 salgılanmasını uyarabileceği bildirilmiştir.29 Mevcut verilerimiz ayrıca BLG tedavisinin, DSS ile tedavi edilen farelerin kolonunda GRP43 ve GPR41'in mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bu veriler, BLG tedavisinin GRP43 ve GPR41'i aktive ederek SCFA'nın teşvik ettiği GLP-1 üretimini geri kazandırabileceğini düşündürmektedir.
BLG, Çin'de uzun süreli reçetesiz satılan bir ilaçtır. Kunming farelerinde BLG'nin maksimum tolere edilebilir dozu 80 g/kg'dır ve akut toksisite gözlenmemiştir.53 Şu anda insanlarda önerilen BLG dozu (şekersiz) günde 9-15 g'dır (günde 3 kez). Çalışmamız, 1 g/kg BLG'nin farelerde DSS kaynaklı kronik tekrarlayan koliti iyileştirdiğini göstermiştir. Bu doz, klinik olarak kullanılan BLG dozuna yakındır. Çalışmamız ayrıca, etki mekanizmasının en azından kısmen, bağırsak mikrobiyotasındaki değişiklikler, özellikle Akkermansia ve Prevotellaceae_UCG-001 gibi SCFA üreten bakteriler yoluyla, bağırsak kaynaklı GLP-1 üretimini geri kazandırarak gerçekleştiğini bulmuştur. Bu bulgular, BLG'nin klinik kolit tedavisi için potansiyel bir terapötik ajan olarak daha fazla değerlendirilmeyi hak ettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bağırsak mikrobiyotasını nasıl modüle ettiğine dair kesin mekanizma, mikrobiyota eksikliği olan fareler ve dışkı bakteri transplantasyonu ile doğrulanmalıdır.
Ace, asetik asit; but, bütirik asit; BLG, pandan; DSS, dekstran sodyum sülfat; DAI, hastalık aktivite indeksi; DPP, dipeptidil peptidaz; FID, alev iyonizasyon dedektörü; F-Con, kontrol fare dışkı özütleri; F-DSS, DSS kolitli farelerin dışkı özütleri; F-BLG, BLG ile tedavi edilen kolitli farelerin dışkı özütleri; GLP-1, glukagon benzeri peptid-1; Gcg, glukagon; gaz kromatografisi, gaz kromatografisi; GRP43, G proteinine bağlı reseptör 43; GRP41, G proteinine bağlı reseptör 41; H&E, hematoksilin-eozin; HBSS, Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi; OTC, reçetesiz satılan ilaçlar; PCA, temel bileşen analizi; PCoA, temel koordinat analizi; Pro, propiyonik asit; SASP, sülfasalazin; SCFA, kısa zincirli yağ asitleri; Çin tıbbı, geleneksel Çin tıbbı; UC, ülseratif kolit.
Tüm deneysel protokoller, Kurumsal Yönergeler ve Hayvan Yönetmeliklerine uygun olarak Pekin Üniversitesi Shenzhen-Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Tıp Merkezi Hayvan Etiği Komitesi (Shenzhen, Çin) tarafından onaylanmıştır (etik numarası A2020157).
Tüm yazarlar, kavram ve tasarım, veri toplama veya veri analizi ve yorumlama konularında önemli katkılarda bulunmuş; makalenin taslağının hazırlanmasına veya önemli entelektüel içeriğin eleştirel olarak gözden geçirilmesine katılmış; makalenin mevcut dergiye gönderilmesini kabul etmiş; yayınlanacak versiyonu nihai olarak onaylamış; çalışmanın tüm yönlerinden sorumlu olmuşlardır.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81560676 ve 81660479), Shenzhen Üniversitesi birinci sınıf projesi (86000000210), Shenzhen Bilim ve Teknoloji İnovasyon Komitesi Fonu (JCYJ20210324093810026), Guangdong Eyaleti Tıp Bilimi ve Teknolojisi Araştırma Fonu (A2020157 ve A2020272), Guizhou Tıp Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Guizhou Eyaleti Ana Laboratuvarı (YWZJ2020-01) ve Pekin Üniversitesi Shenzhen Hastanesi (JCYJ2018009) tarafından desteklenmiştir.
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, vd. Triptolidin, farelerde dekstran sodyum sülfat ile indüklenen deneysel kolitte antiinflamatuar ajan olarak terapötik potansiyeli. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG.İnflamatuvar bağırsak hastalığının küresel yükü: 2015'ten 2025'e. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue ve diğerleri. Bitkisel kaynaklı alkaloidler: inflamatuar bağırsak hastalığında umut vadeden hastalık değiştiriciler. Prepharmacology. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, vd. Indigo Naturalis, DSS kaynaklı kolitli farelerde kolonik oksidatif stresi ve Th1/Th17 yanıtlarını inhibe eder. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Ülseratif kolit tedavisinde Sophora flavescens (Sophora flavescens) Çin bitkisel ilacının etkinliği ve güvenliği: klinik kanıtlar ve potansiyel mekanizmalar. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Doğal ürünler: Enflamatuvar bağırsak hastalığının tedavisinde deneysel olarak etkili ilaçlar. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Geleneksel Çin tıbbı ile ülseratif kolitin adjuvan tedavisi üzerine düşünceler. Klinik Alerji ve İmmünizasyon Dergisi. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT ve diğerleri. Mevsimsel grip tedavisinde Banlangen granüllerinin etkinliği ve güvenliği: randomize kontrollü bir çalışma için çalışma protokolü. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x