Salgı yolunda protein sıralaması, hücre bölümlenmesinin ve homeostazın korunması için gereklidir. Kabuk aracılı sıralamaya ek olarak, salgısal taşıma sürecinde kinezin sıralamasında lipitlerin rolü, uzun zamandır cevaplanmamış temel bir sorudur. Burada, çok uzun seramid lipit kısımlarına sahip yeni sentezlenmiş glikozilfosfatidilinositol ile immobilize edilmiş proteinlerin, transmembran proteinler tarafından kullanılanlardan farklı olan özel endoplazmik retikulum çıkış bölgelerinde kümelendiğini ve sınıflandırıldığını in vivo olarak kanıtlamak için 3 boyutlu eş zamanlı çok renkli yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı görüntüleme gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, endoplazmik retikulum zarındaki seramid zincir uzunluğunun bu sıralama seçiciliği için kritik olduğunu gösteriyoruz. Çalışmamız, salgı yolunda protein yüklerini lipit zincir uzunluğuna göre seçici ihracat bölgelerine sınıflandırmak için ilk doğrudan in vivo kanıtı sağlamaktadır.
Ökaryotik hücrelerde, endoplazmik retikulumda (ER) sentezlenen proteinler, uygun hücresel hedeflerine iletilmek üzere salgı yolu boyunca taşınma sırasında sıralanır (1). Kaplama aracılı sıralamaya ek olarak, belirli lipitlerin, belirli proteinleri belirli membran alanlarına kümeleyerek seçici çıkış noktaları olarak da hizmet edebileceği uzun zamandır tahmin edilmektedir (2-5). Bununla birlikte, bu olası lipit bazlı mekanizmayı kanıtlamak için hala doğrudan in vivo kanıt eksikliği vardır. Bu temel sorunu çözmek için, mayada glikozilfosfatidilinositol (GPI) bağlantılı proteinlerin (GPI-AP'ler) ER'den nasıl farklı şekilde ihraç edildiğini inceledik. GPI-AP'ler, çeşitli lipit bağlantılı hücre yüzey proteinleridir (6, 7). GPI-AP, glikolipit kısmı (GPI çapası) aracılığıyla plazma zarının dış yapraklarına bağlı salgılanan bir proteindir. ER lümeninde koruyucu post-translasyonel modifikasyonlar olarak GPI çapalarını kabul ederler (8). Bağlanmanın ardından, GPI-AP, ER'den plazma zarına Golgi aygıtından geçer (5, 9). GPI çapalarının varlığı, GPI-AP'nin salgı yolu boyunca transmembran salgılanan proteinlerden (diğer plazma zarı proteinleri dahil) ayrı olarak taşınmasına neden olur (5, 9, 10). Maya hücrelerinde, GPI-AP'ler endoplazmik retikulumda diğer salgılanan proteinlerden ayrılır ve daha sonra kaplama protein kompleksi II (COPII) ile sarılmış benzersiz veziküllere paketlenir (6, 7). ER ihracat sürecindeki bu sınıflandırma sürecinin belirleyicileri belirsizdir, ancak bu mekanizmanın lipitleri, özellikle de GPI çapasının lipit kısmının yapısal yeniden şekillendirilmesini gerektirebileceği tahmin edilmektedir (5, 8). Mayada, GPI lipit yeniden şekillendirilmesi, GPI bağlandıktan hemen sonra başlar ve birçok durumda, seramidin 26 karbonlu uzun zincirli doymuş yağ asidine (C26:0) bağlanmasına neden olur (11, 12). C26 seramid, maya hücreleri tarafından bugüne kadar üretilen ana seramiddir. ER'de sentezlenir ve büyük bir kısmı COPII vezikülleri aracılığıyla Golgi aygıtına ihraç edilir (13). GPI-AP'nin ER'den ihracatı, özellikle devam eden seramid sentezini gerektirir (14, 15) ve buna karşılık, Golgi aygıtında seramidin inositol fosfat seramide (IPC) dönüşümü, GPI çapa sentezine bağlıdır (16). Yapay membranlarla yapılan biyofiziksel çalışmalar, çok uzun asil zincirli seramidlerin, benzersiz fiziksel özelliklere sahip düzenli alanlar oluşturmak üzere birleşebileceğini göstermiştir (17, 18). Bu veriler, C26 seramidin ve C26 seramidli GPI-AP'nin, nispeten dağınık ER membran lipid ortamında düzenli bölgeler veya bölgeler oluşturmak için fiziksel özelliklerini kullandığı hipotezine yol açmaktadır. Esas olarak kısa ve doymamış gliserolipitlerden (C16:1 ve C18:1) oluşur (19, 20). Bu bölgeler, seramid ve seramid bazlı GPI-AP'nin aynı özel COPII vezikülünde Golgi'ye birlikte taşınabileceği belirli ER çıkış bölgelerine (ERES) seçici olarak odaklanacaktır (5).
Bu çalışmada, floresan etiketli proteinleri eş zamanlı olarak gözlemleyebilen son teknoloji ürünü bir mikroskopi tekniği olan süper çözünürlüklü konfokal gerçek zamanlı görüntüleme mikroskobu (SCLIM) kullanarak bu lipit bazlı mekanizmayı doğrudan test ettik. Üç renkli ve üç boyutlu (3D) görüntüler, canlı hücrelerde son derece yüksek çözünürlük ve hıza sahiptir (21, 22).
Öncelikle, S. cerevisiae'de ER'den ayrıldıktan sonra transmembran salgılanan proteinlerden C26 seramid grubu içeren normal GPI-AP'nin nasıl tarandığını daha ayrıntılı olarak tanımlamak için SCLIM teknolojisini uyguladık. ER sınıflandırmasını kontrol etmek için, in vivo olarak ERES'e giren yeni sentezlenmiş kargoyu doğrudan görselleştirebilen genetik bir sistem kullandık (7, 23). Kargo olarak, her ikisi de plazma zarını hedefleyen yeşil floresan protein (GFP) ile etiketlenmiş C26 seramid bazlı GPI-AP Gas1 ve yakın kızılötesi floresan protein (iRFP) ile etiketlenmiş transmembran salgılanan protein Mid2'yi seçtik (24-26). sec31-1 sıcaklığa duyarlı mutantta, bu iki kargo, galaktozla indüklenebilir bir promotör ve konstitütif bir ERES işaretleyicisi altında ifade edilir. Aşırı sıcaklıkta (37°C), sec31-1 mutasyonu COPII germinasyonunu ve ER ihracatını engellemek için COPII kaplama bileşeni Sec31'in işlevini etkilediğinden, yeni sentezlenen kargo ER'de birikir (23). Düşük bir sıcaklığa (24°C) soğutulduktan sonra, sec31-1 mutant hücreleri salgı bölgesinden kurtuldu ve biriken yeni sentetik kargo ER'den ihraç edilmeye başlandı. CLIM görselleştirmesi, 37°C'de inkübasyondan sonra sec31-1 mutant hücrelerinin ER'sinde yeni sentezlenen Gas1-GFP ve Mid2-iRFP'nin çoğunun hala biriktiğini ve ardından 24°C'de 5 dakika boyunca serbest bırakıldığını gösterdi (Şekil 1). Mid2-iRFP tüm ER membranına dağıldığından ve Gas1-GFP kesintili ER membran alanında yoğunlaşıp toplandığından, dağılımları tamamen farklıdır (Şekil 1, A'dan C'ye ve Film S1). Ek olarak, Şekil 1D'de gösterildiği gibi, Gas1-GFP kümesi Mid2-iRFP'ye sahip değildir. Bu sonuçlar, GPI-AP ve transmembran proteinlerinin erken dönemde farklı ER membran bölgelerine ayrıldığını göstermektedir. Gas1-GFP kümesi, mCherry'nin COPII kaplama proteini Sec13 ile etiketlenmiş spesifik bir ERES'e bitişiktir (Şekil 1, E ve F ve film S1) (23).
sec31-1 hücreleri galaktozla indüklenen salgıları, uzun bir asil zinciri (C26) seramid GPI-AP Gas1-GFP'yi (GPI-AP, yeşil) ve transmembran protein Mid2-iRFP'yi (TMP, mavi) ifade eder ve bu Yapısal ERES etiketlemesi Sec13-mCherry (ERES, macenta) 37°C'de 30 dakika inkübe edildi, 24°C'ye alındı ​​ve 5 dakika sonra SCLIM ile görüntülendi. (A'dan C'ye) bir düzlemin temsili birleştirilmiş veya tek 2B görüntüsünü (A), 10 z-kesitinin 2B projeksiyon görüntüsünü (B) veya kargo ve ERES işaretleyicilerinin 3B hücre yarım küresi görüntüsünü (C) göstermektedir. Ölçek çubuğu 1 μm (A ve B). Ölçek birimi 0,551 μm'dir (C). Gas1-GFP, ayrı ER bölgelerinde veya kümelerinde tespit edilirken, Mid2-iRFP ER membranı boyunca dağılmış olarak tespit edildi (C). (D) Grafik, beyaz ok çizgisi boyunca (solda) Gas1-GFP kümesindeki Gas1-GFP ve Mid2-iRFP'nin göreceli floresans yoğunluğunu göstermektedir. AU, keyfi birim. (E ve F), ürünleri ve ERES işaretini birleştiren 3 boyutlu görüntüyü temsil eder. Gas1-GFP kümeleri, belirli ERES'in yakınında tespit edildi. Ölçek birimi 0,551 μm'dir. (F) Beyaz düz ok, ERES ile ilişkili Gas1-GFP kümesini işaretler. Orta ve sağ paneller, birleştirilmiş büyütülmüş 3 boyutlu görüntüyü ve seçilen Gas1-GFP kümesinin döndürülmüş görünümünü göstermektedir.
Gas1-GFP kümesi ile belirli bir ERES arasındaki yakın mekansal ilişki, Gas1-GFP'nin seçici ERES'lere girebildiğini göstermektedir; bu, Mid2-iRFP'nin ER'den ayrılmak için kullandığı seçicilikten farklıdır. Bu olasılığı ele almak için, yalnızca bir veya iki madde için ERES oranını ölçtük (Şekil 2, A'dan C'ye). Çoğu ERES'in (%70) yalnızca bir tür kargo içerdiğini bulduk. Şekil 2C'nin alt görüntüsü, yalnızca Gas1-GFP (Şekil 1) veya yalnızca Mid2-iRFP (Şekil 2) içeren iki tipik ERES örneğini göstermektedir. Buna karşılık, ERES'lerin yaklaşık %20'si aynı alanda örtüşen iki kargo içermektedir. Bazı ERES'lerin (%10) iki tür kargo içerdiği, ancak bunların açıkça farklı alanlarda izole edildiği bulundu. Bu nedenle, bu istatistiksel analiz, ER'den dışarı aktarıldıktan sonra, GPI-AP Gas1-GFP ve transmembran kargo Mid2-iRFP'nin farklı ERES'lere ayrıldığını göstermektedir (Şekil 2D). Bu sıralama verimliliği, önceki biyokimyasal analiz (6) ve morfolojik belirleme (7) ile oldukça tutarlıdır. Ayrıca, ERES'e giren karantinaya alınmış kargonun davranışını da gözlemleyebiliriz (Şekil 2E ve Film S2). Şekil 2E, Gas1-GFP'nin (panel 3) veya Mid2-iRFP'nin (panel 4) yalnızca küçük bir kısmının ERES'e bir taraftan girdiğini ve ayrı bir alanda tutulduğunu göstermektedir. Şekil 2E'nin 5. paneli, Gas1-GFP ve Mid2-iRFP'nin bazen aynı ERES'te bulunduğunu, ancak farklı taraflardan girdiklerini ve farklı COPII veziküllerini temsil edebilecek ayrı bölgelerde yoğunlaştıklarını göstermektedir. Ayrıca, C26 seramid bazlı GPI-AP Gas1'in seçici ERES olarak gözlemlenen ayrımının ve sınıflandırılmasının spesifik olduğunu doğruladık, çünkü Mid2-iRFP'ye benzer davranış gösteren başka bir transmembran salgılama kargosu olan GFP etiketli plazma membran proteini Axl2 (27) de mevcuttur. (Resim S1 ve Film S3). Yeni sentezlenen Axl2-GFP, Mid2-iRFP gibi ER zarı boyunca dağılır (Şekil S1, A ve B) ve çoğu ERES'te Mid2-iRFP ile birlikte lokalize olur (Şekil S1, B ila D). Şekil 1. S1C'nin 1. ve 2. panelleri, iki transmembran yükün üst üste geldiği iki tipik ERES örneğini göstermektedir. Bu durumlarda, her iki madde de ERES'e birlikte girer (Şekil S1E, Panel 3 ve Film S3).
Galaktoz ile indüklenebilir salgıları ifade eden sec31-1 hücreleri, Gas1-GFP (GPI-AP, yeşil) ve Mid2-iRFP (TMP, mavi) ve konstitütif ERES etiketlemesi Sec13-mCherry (ERES, macenta) 37 °C'de inkübe edildi. 30 dakika boyunca 24 °C'de inkübe edildikten sonra, salgı bloğunu serbest bırakmak için 24 °C'ye alın ve 20 dakika sonra SCLIM ile görüntülendi. (A'dan C'ye) Kargonun ve ERES ile işaretlenmiş 10 z-kesitinin temsili 2B projeksiyon görüntüleri (A; ölçek çubuğu, 1 μm) veya 3B hücre yarım küre görüntüleri (B ve C; ölçek birimi, 0,456 μm). (B)'deki alt panel ve (C)'deki panel, yalnızca ERES'te (macenta) bulunan malları [Gas1-GFP (gri) ve Mid2-iRFP (açık mavi)] göstermek için işlenmiş görüntüleri sergiler. (C) Açık ok: ERES yalnızca tek bir kargo parçası taşır (1 ila 4). Gri ok: ERES ayrışmış kargo içerir (5). Beyaz dolu ok: ERES birlikte bulunan kargo içerir. Aşağıda: Seçilen tek ERES yalnızca Gas1-GFP (1) veya Mid2-iRFP (2) içerir. Ölçek çubuğu, 100 nm. (D) (C)'de açıklanan fotomikrografın nicel analizi. Yalnızca bir kargo (Gas1-GFP veya Mid2-iRFP), ayrışmış kargo ve örtüşen kargo içeren ERES'lerin ortalama yüzdesi. Üç bağımsız deneyde, 54 hücrede n=432. Hata çubuğu = SD. İki kuyruklu eşleştirilmemiş t testi. *** P = 0,0002. (E) (C) ile işaretlenmiş karantinaya alınmış kargonun seçilen ERES'lerinin 3 boyutlu görüntüsü. Gas1-GFP (yeşil) (3) veya Mid2-iRFP (mavi) (4), ERES'e (macenta) bir taraftan girer ve ERES içindeki küçük bir alana hapsedilir. Bazen, her iki kargo türü de aynı ERES'e (5) aynı taraftan girer ve ERES içindeki izole bir alana hapsedilir. Ölçek çubuğu, 100 nm.
Daha sonra, ER membranında bulunan uzun asil zincirli seramidin (C26), Gas1'in seçici ERES'lere özgül kümelenmesini ve sıralanmasını sağladığı hipotezini test ettik. Bu amaçla, iki endojen seramid sentazı Lag1 ve Lac1'in GhLag1 (pamuktaki Lag1 homologu) ile değiştirildiği, hücre zarı seramidi vahşi tipten daha kısa olan bir maya suşu olan modifiye edilmiş bir maya suşu GhLag1 kullandık (Şekil 3A) (28). Kütle spektrometresi (MS) analizi, vahşi tip suşlarda toplam seramidin %95'inin çok uzun (C26) zincirli seramid olduğunu, GhLag1'de ise seramidin %85'inin çok uzun (C18 ve C16) zincirli seramid olduğunu, sadece %2'sinin ise çok uzun (C26) zincirli seramid olduğunu gösterdi. Şimdiye kadar GhLag1 membranında tespit edilen ana seramidler C18 ve C16 seramidler olmasına rağmen, MS analizi ayrıca GhLag1 suşunda ifade edilen Gas1-GFP'nin GPI çapasının, vahşi tip lipitlerle karşılaştırılabilir nitelikte olan C26 seramid içerdiğini de doğruladı (Şekil 3A) (26). Bu nedenle, bu, seramid yeniden şekillendirme enzimi Cwh43'ün C26 seramid için oldukça seçici olduğu anlamına gelir; Şekil 26'da gösterildiği gibi, GhLag1 suşundaki az miktarda C26 seramidden GPI çapasını tercihli olarak dahil eder. S2 (29). Bununla birlikte, GhLag1'in hücre zarı temelde yalnızca C18-C16 seramid içerirken, Gas1-GFP hala C26 seramid içermektedir. Bu gerçek, bu suşu, ER'deki membran seramidinin asil zincir uzunluğu sorununu özel olarak çözmek için ideal bir araç haline getirir. Sınıflandırma ve sıralamanın varsayımsal rolü. Daha sonra, öncelikle C26 Gas1-GFP'nin, sec31-1'in sıcaklığa duyarlı mutant aleline sahip GhLag1'de kümeler halinde birikme yeteneğini, geleneksel floresan mikroskopi yoluyla inceledik; burada sadece uzun (C18-C16) zincir ER membran seramidinde mevcuttur (Şekil 3). sec31-1'de Gas1-GFP'nin çoğunun kümeler halinde yoğunlaştığını, buna karşılık uzun (C18-C16) seramid ER membranına sahip sec31-1 GhLag1'deki Gas1-GFP'nin çoğunlukla kümelenmediğini ve tüm ER membranına dağıldığını gözlemledik. Daha açık olmak gerekirse, C26 seramid bazlı kümelenme spesifik ERES ile yakından ilişkili olduğundan (Şekil 1), bu sürecin ER ihracat protein mekanizmasının işlevini de içerip içermediğini araştırdık. GPI-AP, ER ihracatı için özel bir COPII sistemi kullanır ve bu sistem, Ted1'in GPI çapasının glikan kısmının yapısal yeniden şekillendirilmesiyle aktif olarak düzenlenir (30, 31). Rekombinant GPI-glikan daha sonra transmembran kargo reseptörü p24 kompleksi tarafından tanınır ve bu kompleks de sırayla ana COPII kargo bağlayıcı alt birimi Sec24'ün spesifik bir izoformu olan Lst1'i seçici olarak toplar ve GPI-AP açısından zengin bir COPII vezikülleri oluşturur (31-33). Bu nedenle, bu tek proteinlerin (p24 kompleks bileşeni Emp24, GPI-glikan yeniden şekillendirme enzimi Ted1 ve spesifik COPII alt birimi Lst1) silinmesini sec31-1 mutant suşuyla birleştiren bir çift mutant oluşturduk ve bunların Gas1-küme GFP oluşturmasının mümkün olup olmadığını inceledik (Şekil 3). sec31-1emp24Δ ve sec31-1ted1Δ'da, Gas1-GFP'nin esas olarak kümelenmemiş ve daha önce sec31-1 GhLag1'de görüldüğü gibi ER membranı boyunca dağılmış olduğunu gözlemledik; sec31-1lst1Δ'da ise Gas1-GFP, sec31-1'e benzer şekilde dağılmıştır. Bu sonuçlar, ER membranında C26 seramidin varlığına ek olarak, Gas1-GFP'nin kümelenmesinin p24 kompleksine bağlanmayı da gerektirdiğini ve spesifik Lst1 alımına ihtiyaç duymadığını göstermektedir. Daha sonra, ER membranındaki seramidin zincir uzunluğunun Gas1-GFP'nin p24'e bağlanmasını düzenleyip düzenleyemeyeceğini araştırdık. Bununla birlikte, membranda C18-C16 seramidin varlığının, p24 kompleksi tarafından yeniden oluşturulan GPI-glikanları (Şekil S3 ve S4, A ve B) veya GPI-AP'ye bağlanmayı ve GPI-AP'yi dışarı aktarma yeteneğini etkilemediğini bulduk. COPII alt tipi Lst1'i işe alın (Şekil S4C). Bu nedenle, C26 seramid bağımlı kümelenme, farklı ER ihracat protein mekanizmalarıyla protein etkileşimlerini gerektirmez, ancak lipid uzunluğu tarafından yönlendirilen alternatif bir sıralama mekanizmasını destekler. Daha sonra, ER zarındaki seramid açil zincir uzunluğunun, Gas1-GFP'nin seçici ERES olarak etkili sınıflandırılması için önemli olup olmadığını analiz ettik. Kısa zincirli seramide sahip GhLag1 suşundaki Gas1, ER'den ayrılıp plazma zarına girdiğinden (Şekil S5), sıralamanın seramid açil zincir uzunluğu tarafından yönlendirildiğini varsayarsak, GhLag1 suşundaki Gas1'in yeniden yönlendirilebileceğine ve aynı zarla çaprazlanabileceğine inanıyoruz.
(A) GhLag1'in hücre zarı esas olarak daha kısa C18-C16 seramidler içerirken, Gas1-GFP'nin GPI çapası hala yabani tip hücrelerle aynı C26 IPC'ye sahiptir. Üstte: Kütle spektrometresi (MS) ile yabani tip (Wt) ve GhLag1p suşlarının hücre zarındaki seramidin asil zincir uzunluğu analizi. Veriler toplam seramidin yüzdesini temsil eder. Üç bağımsız deneyin ortalaması. Hata çubuğu = SD. İki kuyruklu eşleştirilmemiş t testi. **** P ＜0.0001. Alt panel: Yabani tip ve GhLag1p suşlarında ifade edilen Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI çapasında bulunan IPC'nin asil zincir uzunluğunun MS analizi. Veriler toplam IPC sinyalinin yüzdesini temsil eder. Beş bağımsız deneyin ortalaması. Hata çubuğu = SD. İki kuyruklu eşleştirilmemiş t testi. ns, önemli değil. P = 0.9134. (B) Galaktoz ile indüklenen Gas1-GFP'yi ifade eden sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ve sec31-1lst1Δ hücrelerinin floresan mikrografları 37°C'de 30 dakika inkübe edildikten sonra 24°C'ye aktarılarak rutin floresan mikroskopi işlemi gerçekleştirildi. Beyaz ok: ER Gas1-GFP kümesi. Açık ok: Kümelenmemiş Gas1-GFP, tüm ER membranına dağılmış olup, ER'ye özgü nükleer halka boyamasını göstermektedir. Ölçek çubuğu, 5 μm. (C) (B)'de açıklanan fotomikrografın nicel değerlendirmesi. Noktasal Gas1-GFP yapısına sahip hücrelerin ortalama yüzdesi. Üç bağımsız deneyde, n≥300 hücre. Hata çubuğu = SD. İki kuyruklu eşleştirilmemiş t testi. **** P ＜0.0001.
Bu sorunu doğrudan çözmek için, sec31-1 sıcaklığa duyarlı mutant aleli ile GhLag1'de Gas1-GFP ve Mid2-iRFP'nin SCLIM görselleştirmesini gerçekleştirdik (Şekil 4 ve Ek Video S4). ER 37°C'de tutulduktan ve daha sonra 24°C'de serbest bırakıldıktan sonra, yeni sentezlenen Gas1-GFP'nin çoğu, geleneksel mikroskoplarla gözlemlendiği gibi, kümelenmemiş ve ER zarı boyunca dağılmıştı (Şekil 4, A ve B). Ek olarak, ERES'in büyük bir yüzdesi (%67), içinde birlikte bulunan iki tür kargo içermektedir (Şekil 4D). Şekil 4C'nin 1. ve 2. panelleri, örtüşen Gas1-GFP ve Mid2-GFP içeren ERES'in iki tipik örneğini göstermektedir. Ayrıca, her iki kargo da aynı ERES'e alınmıştır (Şekil 4E, panel 3 ve Ek Video S4). Dolayısıyla, sonuçlarımız ER zarındaki seramid açil zincirinin uzunluğunun ER protein agregasyonu ve sınıflandırılmasında önemli bir belirleyici olduğunu göstermektedir.
Galaktoz kaynaklı salgıları ifade eden Sec31-1 GhLag1 hücreleri, Gas1-GFP (GPI-AP, yeşil) ve Mid2-iRFP (TMP, mavi) ve konstitütif ERES etiketli Sec13-mCherry (ERES, macenta) 37°C'de inkübe edilir. 30 dakika daha devam ettirilir, salgıların salınması için sıcaklık 24°C'ye düşürülür ve 20 dakika sonra SCLIM ile görüntülenir. (A'dan C'ye) Kargo ve ERES ile işaretlenmiş 10 z-kesitinin temsili 2B projeksiyon görüntüleri (A; ölçek çubuğu, 1 μm) veya 3B hücre yarım küre görüntüleri (B ve C; ölçek birimi, 0,45 μm). (B)'deki alt panel ve (C)'deki panel, yalnızca ERES'te (macenta) bulunan malları [Gas1-GFP (gri) ve Mid2-iRFP (açık mavi)] göstermek için işlenmiş görüntüleri sergiler. (C) Beyaz dolu ok: ERES, ürünler üst üste biniyor. Açık ok: ERES yalnızca bir öğe içeriyor. Alt panel: Seçilen ERES, (C)'de işaretlenmiş üst üste binen ürünlere (1 ve 2) sahiptir. Ölçek çubuğu, 100 nm. (D) (C)'de açıklanan fotomikrografın nicel analizi. sec31-1 ve sec31-1 GhLag1 ünitelerinde yalnızca bir kargo (Gas1-GFP veya Mid2-iRFP) bulunur ve izole kargo ve üst üste binen kargo için ERES'in ortalama yüzdesi. Üç bağımsız deneyde, 54 hücrede n = 432 (sec31-1) ve 47 hücrede n = 430 (sec31-1 GhLag1). Hata çubuğu = SD. İki kuyruklu eşleştirilmemiş t testi. *** P = 0,0002 (sec31-1) ve ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C)'de işaretlenmiş örtüşen kargo (3) ile seçilen ERES'in 3 boyutlu görüntüsü. Gas1-GFP (yeşil) ve Mid2-iRFP (mavi), ERES'e (macenta) aynı taraftan yaklaşır ve aynı ERES kısıtlı alanında kalır. Ölçek çubuğu, 100 nm.
Bu çalışma, lipit bazlı protein yüklerinin salgı yolunda seçici ihracat bölgelerine sınıflandırıldığına dair doğrudan in vivo kanıtlar sunmakta ve sınıflandırma seçiciliği için asil zincir uzunluğunun önemini ortaya koymaktadır. SCLIM adı verilen güçlü ve son teknoloji ürünü bir mikroskopi tekniği kullanarak, mayada yeni sentezlenen Gas1-GFP'yi (çok uzun bir asil zincir (C26) seramid lipit kısmı içeren ana plazma membran GPI-AP) gösterdik. Ayrı ER'lerde kümelenen bölgeler, belirli ERES'lerle ilişkilidir, oysa transmembran salgılanan proteinler ER membranı boyunca dağılır (Şekil 1). Ek olarak, bu iki tür madde seçici olarak farklı ERES'lere girer (Şekil 2). Membrandaki hücresel seramidin asil zincir uzunluğu C26'dan C18-C16'ya düşürüldüğünde, Gas1-GFP kümesi ayrı ER bölgesine dağılır ve Gas1-GFP, transmembran proteinle birlikte aynı ERES'ten ER'den ayrılmak üzere yeniden yönlendirilir (Şekil 3 ve Şekil 3). 4).
GPI-AP, ER'den çıkmak için özel bir protein mekanizması kullanmasına rağmen, C26 seramid bağımlı ayrışmanın, ERES uzmanlaşmasına yol açabilecek farklı protein etkileşimlerine dayanmadığını bulduk (Şekil S4 ve S5). Bunun yerine, bulgularımız, lipid bazlı protein kümelenmesi ve ardından diğer yüklerin dışlanmasıyla yönlendirilen alternatif bir sınıflandırma mekanizmasını desteklemektedir. Gözlemlerimiz, belirli bir ERES ile ilişkili Gas1-GFP bölgesinin veya kümesinin, transmembran salgılanan protein Mid2-iRFP'den yoksun olduğunu göstermektedir; bu da C26 seramid bağımlı GPI-AP kümesinin, ilgili ERES'e girişlerini kolaylaştıracağını ve aynı zamanda transmembran salgıların bu özel ERES'e girmesini engelleyeceğini göstermektedir (Şekil 1 ve 2). Buna karşılık, ER zarında C18-C16 seramidlerin bulunması, GPI-AP'nin bölgeler veya kümeler oluşturmasına neden olmaz, bu nedenle aynı ERES'e transmembran salgılanan proteinleri dışlamaz veya değiştirmez (Şekil 3 ve 4). Bu nedenle, C26 seramidin, belirli ERES'lere bağlı proteinlerin kümelenmesini kolaylaştırarak ayrışmayı ve sınıflandırmayı yönlendirdiğini öne sürüyoruz.
Bu C26 seramid bağımlı kümelenmenin belirli bir ER bölgesinde nasıl gerçekleştirildiği sorusu akla geliyor. Membran seramidinin yanal olarak ayrılma eğilimi, GPI-AP ve C26 seramidin, daha kısa ve doymamış gliserolipidler içeren ER membranının daha düzensiz lipid ortamında küçük ve anlık olarak düzenli lipidler oluşturmasına neden olabilir. Kaliteli kümeler (17, 18). Bu küçük geçici kümeler, p24 kompleksine bağlandıktan sonra daha büyük, daha kararlı kümelere kaynaşabilir (34). Buna uygun olarak, C26 Gas1-GFP'nin daha büyük görünür kümeler oluşturmak için p24 kompleksiyle etkileşime girmesi gerektiğini gösterdik (Şekil 3). p24 kompleksi, mayada dört farklı p24 transmembran proteininden oluşan heterozigot bir oligomerdir (35), bu da çok değerlikli bağlanma sağlar ve bu da küçük GPI-AP kümelerinin çapraz bağlanmasına yol açarak daha büyük Kararlı kümeler oluşturabilir (34). GPI-AP'lerin protein ekto alanları arasındaki etkileşim, memeli polarize epitel hücrelerinde Golgi taşınması sırasında gösterildiği gibi, agregasyonlarına da katkıda bulunabilir (36). Bununla birlikte, ER membranında C18-C16 seramid mevcut olduğunda, p24 kompleksi Gas1-GFP'ye bağlandığında, büyük ayrı kümeler oluşmaz. Altta yatan mekanizma, uzun asil zincirli seramidin spesifik fiziksel ve kimyasal özelliklerine bağlı olabilir. Yapay membranların biyofiziksel çalışmaları, hem uzun (C24) hem de kısa (C18-C16) asil zincirli seramidlerin faz ayrımına neden olabileceğini, ancak yalnızca uzun asil zincirli seramidlerin (C24) yüksek eğrilik ve film bükülmesini teşvik ederek filmi yeniden şekillendirebileceğini göstermektedir. Karşılıklı referans yoluyla (17, 37, 38). Emp24'ün insan homologu olan TMED2'nin transmembran heliksinin sitoplazmik lobüllerde C18 seramid bazlı sfingomiyelin ile seçici olarak etkileşime girdiği gösterilmiştir (39). Moleküler dinamik (MD) simülasyonlarını kullanarak, hem C18 hem de C26 seramidlerin Emp24 transmembran heliksinin sitoplazmik lobülleri çevresinde biriktiğini ve benzer tercihlere sahip olduklarını bulduk (Şekil S6). Bunun, Emp24'ün transmembran heliksinin membranda lipidlerin asimetrik dağılımına yol açabileceğini gösterdiğini belirtmekte fayda var. Bu, memeli hücrelerine dayalı yeni bir sonuçtur. Benzer MD simülasyonları ayrıca eter lipidlerinin varlığını da göstermektedir (40). Bu nedenle, ER26'nın iki lobülündeki C26 seramidin yerel olarak zenginleştiğini tahmin ediyoruz. Lümen lobüllerindeki GPI-AP, çok değerlikli p24'e doğrudan bağlandığında ve sitoplazmik lobüllerde p24 çevresinde C26 seramid birikimi meydana geldiğinde, eşlik eden protein agregasyonunu ve parmaklar aracılığıyla membran eğriliğinin oluşmasını teşvik edebilir (41), bu da GPI-AP'nin ERES'e bitişik ayrı bölgelere ayrılmasına neden olur ve bu da ER membranının yüksek oranda eğri bölgelerini destekler (42). Önceki raporlar önerilen mekanizmayı desteklemiştir (43, 44). Oligolektinlerin, patojenlerin veya antikorların plazma membranındaki seramid bazlı glikosfingolipitlere (GSL) çok değerlikli bağlanması, büyük GSL agregasyonunu tetikler, faz ayrışmasını artırır ve membran deformasyonuna ve içselleşmeye neden olur (44). Iwabuchi ve diğerleri (43) Uzun (C24) ancak kısa (C16) asil zincirlerinin varlığında, GSL laktosilseramide bağlı çok değerlikli ligandın büyük kümelerin ve membran içe doğru kıvrılmasının oluşumuna neden olduğu ve sitoplazma Lyn aracılı sinyal iletiminin, bağlı nötrofillerde asil zincirler tarafından yaprakçıklar üzerinde iç içe geçtiği bulunmuştur.
Memeli polarize epitel hücrelerinde, apikal plazma membranı seviyesindeki anti-Golgi ağının (TGN) konsantrasyonu, GPI-AP'nin ayrılmasını ve sıralanmasını kontrol eder (10, 45). Bu agregasyon, GPI-AP oligomerizasyonu tarafından yönlendirilir (36), ancak mayada bulduğumuz seramid zincir uzunluğuna da bağlı olabilir. Memeli GPI-AP'nin eter lipit bazlı bir çapası olmasına ve kimyasal yapısının çok uzun asil zincirli seramidden çok farklı olmasına rağmen, yakın zamanda yapılan bir çalışma, her iki lipitin de evrimsel olarak benzer fiziksel ve kimyasal özelliklere ve fonksiyona sahip olduğunu bulmuştur (40). Bu nedenle, memeli hücrelerindeki eter lipit kısmı, mayadaki C26 seramidine benzer olabilir ve rolü, GPI-AP agregasyonunu ve sıralanmasını teşvik etmek için membrandaki uzun zincirli seramidle ilişki kurmaktır. Bu olasılığın doğrudan test edilmesi gerekmekle birlikte, önceki bulgular, uzun asil zincirli seramidin Golgi cisimciğine taşınmasının sitoplazmik transfer proteinleri tarafından gerçekleştirilmediğini, bunun yerine maya gibi GPI çapalarının sentezine bağlı olduğunu desteklemektedir. Bu nedenle, evrimsel olarak koruyucu mekanizma, çok uzun asil zincirli seramid ve GPI-AP'yi (13, 16, 20, 46, 47) aynı taşıma vezikülünde seçici olarak birlikte taşıyabiliyor gibi görünmektedir.
Maya ve memeli polarize epitel hücre sistemlerinde, GPI-AP agregasyonu ve diğer plazma membran proteinlerinden ayrılması, hücre yüzeyine ulaşmadan önce gerçekleşir. Paladino ve ark. (48), memeli polarize epitel hücrelerinin TGN'sinde, GPI-AP kümelenmesinin sadece GPI-AP'lerin apikal plazma membranına seçici sınıflandırılması için gerekli olmadığını, aynı zamanda GPI-AP'lerin kümelenme organizasyonunu ve biyolojik aktivitesini de düzenlediğini bulmuştur. Hücre yüzeyi. Mayada, bu çalışma, ER üzerindeki C26 seramid bağımlı GPI-AP kümesinin, plazma membranındaki GPI-AP'nin küme organizasyonunu ve fonksiyonel aktivitesini düzenleyebileceğini göstermiştir (24, 49). Bu modelle tutarlı olarak, GhLag1 hücreleri GPI inhibitörlerine veya hücre duvarı bütünlüğünü etkileyen ilaçlara alerjiktir (28) ve maya hücrelerinin çiftleşmesinde projeksiyon edilen uç seramidin fonksiyonel Gas1-GFP kümelerine (49) olan ihtiyaç, GhLag1 hücrelerinin olası fizyolojik sonuçlarını göstermektedir. GPI-AP hatası. Bununla birlikte, hücre yüzeyinin fonksiyonel organizasyonunun, lipid uzunluğuna dayalı bir sıralama yöntemiyle ER'den programlanıp programlanmadığının daha ayrıntılı olarak test edilmesi, gelecekteki araştırmalarımızın konusu olacaktır.
Bu çalışmada kullanılan Saccharomyces cerevisiae suşları Tablo S1'de listelenmiştir. Canlı hücre görüntüleme için SCLIM'in MMY1583 ve MMY1635 suşları W303 arka planında oluşturulmuştur. Floresan protein etiketi ile Sec13-mCherry'yi ifade eden bu suşlar, şablon olarak pFA6a plazmidi kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı bir yöntemle oluşturulmuştur (23). GAL1 promotörünün kontrolü altında floresan protein ile etiketlenmiş Mid2-iRFP'yi ifade eden suş şu şekilde oluşturulmuştur: pKTiRFP-KAN vektöründen (E. O'Shea'nın hediyesi, Addgene plazmid numarası 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; araştırma kaynağı tanımlayıcısı (RRID): Addgene_64687) iRFP-KanMx dizisinin PCR amplifikasyonu ve endojen Mid2'nin C-terminaline eklenmesi. Mid2-iRFP genom dizisi çoğaltılıp GAL1 promotörüne klonlandıktan sonra, entegrasyon plazmidi pRS306'nın Not I-Sac I bölgesine entegre edildi. Elde edilen pRGS7 plazmidi, URA3 lokusuna entegre edilmesi için Pst I ile doğrusal hale getirildi.
Gas1-GFP füzyon geni, aşağıdaki şekilde oluşturulan sentromer (CEN) plazmidinde GAL1 promotörünün kontrolü altında ifade edilir. Gas1-GFP dizisi, pRS416-GAS1-GFP plazmidinden (24) (L. Popolo'nun hediyesi) PCR ile çoğaltıldı ve CEN plazmidi pBEVY-GL LEU2'nin (C. Miller'ın hediyesi; Addgene plazmid numarası 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225) Xma I–Xho I bölgesine klonlandı. Elde edilen plazmide pRGS6 adı verildi. Axl2-GFP füzyon geni de pBEVY-GL LEU2 vektörünün GAL1 promotörünün kontrolü altında ifade edilir ve yapısı aşağıdaki gibidir. Axl2-GFP dizisi, pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmidinden (23) PCR ile çoğaltıldı ve pBEVY-GL LEU2 vektörünün Bam HI-Pst I bölgesine klonlandı. Elde edilen plazmite pRGS12 adı verildi. Bu çalışmada kullanılan oligonükleotidlerin dizisi Tablo S2'de listelenmiştir.
Suş, karbon kaynağı olarak %0,2 adenin ve %2 glikoz [YP-dekstroz (YPD)], %2 rafinoz [YP-rafinoz] zengin maya özü proteini p (YP) ortamı (%1 maya özü ve %2 protein ept. (YPR)] veya %2 galaktoz [YP-galaktoz (YPG)] ile ya da beslenme için gerekli uygun amino asitleri ve bazları takviye etmek üzere sentetik minimal bir ortamda (%0,15 maya azot bazı ve %0,5 amonyum sülfat) ve karbon kaynağı olarak %2 glikoz (sentetik glikoz minimal ortamı) veya %2 galaktoz (sentetik galaktoz minimal ortamı) ile desteklenmiştir.
Gerçek zamanlı görüntüleme için, GAL1 promotörü altında yapıyı ifade eden sıcaklığa duyarlı sec31-1 mutant hücreleri, 24°C'de YPR ortamında gece boyunca orta log fazına kadar büyütüldü. 24°C'de 1 saat boyunca YPG'de indüksiyondan sonra, hücreler 37°C'de 30 dakika boyunca SG'de inkübe edildi ve daha sonra salgılama bloğundan kurtulmak için 24°C'ye aktarıldı. Hücreler, cam bir slayt üzerine Concanavalin A ile sabitlendi ve SCLIM ile görüntülendi. SCLIM, Olympus IX-71 ters floresan mikroskobu ve UPlanSApo 100×1.4 sayısal açıklıklı yağlı lensin (Olympus), yüksek hızlı ve yüksek sinyal-gürültü oranına sahip döner diskli konfokal tarayıcının (Yokogawa Electric), özel spektrometrenin ve özel soğutmanın birleşimidir. Sistemin görüntü yoğunlaştırıcısı (Hamamatsu Photonics), ×266,7'lik nihai büyütme sağlayan bir büyütme lens sistemi ve elektronları çoğaltan bir şarj bağlantılı cihaz kamerası (Hamamatsu Photonics) (21) sağlayabilir. Görüntü alımı, özel yazılım (Yokogawa Electric) tarafından gerçekleştirilir. 3B görüntüler için, objektif lensi dikey olarak titreştirmek üzere özel yapım bir piezoelektrik aktüatör kullandık ve optik parçaları 100 nm aralıklarla bir yığın halinde topladık. Z-yığın görüntüsü 3 boyutlu voksel verisine dönüştürülür ve döner diskli konfokal mikroskop için kullanılan teorik nokta yayılım fonksiyonu, Volocity yazılımı (PerkinElmer) tarafından dekonvolüsyon işlemi için kullanılır. Volocity yazılımı kullanılarak eş konum analizi için otomatik eşikleme yapılarak, kargo içeren ERES ölçüldü. MetaMorph yazılımı (Molecular Devices) kullanılarak çizgi tarama analizi gerçekleştirildi.
İstatistiksel anlamlılığı belirlemek için GraphPad Prism yazılımını kullanın. İki kuyruklu Student's t-testi ve sıradan tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi için, gruplar arasındaki farklılıkların P <0,05 (*) düzeyinde anlamlı bir etkiye sahip olduğu kabul edilir.
Gas1-GFP'nin floresan mikroskopisi için, log fazındaki hücreler YPD'de bir gece boyunca büyütüldü ve santrifüjleme yoluyla toplandı, fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkandı ve en az 15 dakika buz üzerinde inkübe edildi ve daha sonra daha önce açıklandığı gibi mikroskop altında incelendi (24). Görüntüleme için objektif lens, L5 (GFP) filtresi, Hamamatsu kamera ve Application Suite X (LAS X) yazılımı ile donatılmış Leica DMi8 mikroskobu (HCX PL APO 1003/1.40 yağ PH3 CS) kullanıldı.
Örnekler 65°C'de 10 dakika boyunca SDS örnek tamponu ile denatüre edildi ve ardından SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile ayrıştırıldı. İmmünoblotlama analizi için her şeride 10 μl örnek yüklendi. Birincil antikor: 1:3000 seyreltmede tavşan poliklonal anti-Gas1, 1:500 seyreltmede tavşan poliklonal anti-Emp24 ve 1:3000 seyreltmede tavşan poliklonal anti-GFP (H. Riezman'dan bir hediye) kullanıldı. Fare monoklonal anti-Pgk1 antikoru 1:5000 seyreltmede kullanıldı (J. de la Cruz'dan bir hediye). İkincil antikor: 1:3000 seyreltmede kullanılan at kestanesi peroksidaz (HRP) konjugeli keçi anti-tavşan immünoglobulin G (IgG) (Pierce). HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG, 1:3000 oranında seyreltilerek kullanıldı (Pierce). Bağışıklık yanıtı bölgesi, SuperSignal West Pico reaktifinin (Thermo Fisher Scientific) kemilüminesans yöntemiyle gözlemlendi.
(31)'de açıklandığı gibi, zenginleştirilmiş ER fraksiyonu üzerinde doğal bir immünopresipitasyon deneyi gerçekleştirildi. Kısaca, maya hücreleri TNE tamponu [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsülfonil florür ve proteaz inhibitör karışımı] ile 600 nm'de (OD600) 100 optik yoğunlukta iki kez yıkandı. Cam boncuklarla parçalandı ve ardından hücre kalıntıları ve cam boncuklar santrifüjleme ile uzaklaştırıldı. Süpernatant daha sonra 4°C'de 15 dakika boyunca 17.000 g'de santrifüjlendi. Pelet TNE'de yeniden süspansiyon haline getirildi ve son konsantrasyonu %1 olacak şekilde digitalis saponin eklendi. Süspansiyon 4°C'de 1 saat boyunca döndürülerek inkübe edildi ve ardından çözünmeyen bileşenler 4°C'de 60 dakika boyunca 13.000 g'de santrifüj edilerek uzaklaştırıldı. Gas1-GFP immünopresipitasyonu için, önce numune 4°C'de 1 saat boyunca boş agaroz boncuklarla (ChromoTek) ön inkübe edildi ve ardından 4°C'de 3 saat boyunca GFP-Trap_A (ChromoTek) ile inkübe edildi. İmmünopresipite edilmiş boncuklar %0,2 digoksigenin içeren TNE ile beş kez yıkandı, SDS numune tamponu ile elüe edildi, SDS-PAGE üzerinde ayrıştırıldı ve immünoblotlama ile analiz edildi.
(31)'de açıklandığı gibi, çapraz bağlama belirlemesi zenginleştirilmiş ER fraksiyonunda gerçekleştirildi. Kısaca, zenginleştirilmiş ER fraksiyonu 0,5 mM ditiobis(süksinimidil propiyonat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ABD; 20°C, 20 dk) ile inkübe edildi. Çapraz bağlama reaksiyonu, glisin (50 mM nihai konsantrasyon, 5 dk, 20°C) eklenerek söndürüldü.
Daha önce açıklandığı gibi (50), yabani tip ve GhLag1 suşlarında seramidin MS analizi gerçekleştirildi. Kısaca, hücreler 30°C'de YPD'de üstel faza (3 ila 4 OD600 birim/ml) kadar büyütüldü ve 25×107 hücre hasat edildi. Metabolizmaları trikloroasetik asit ile söndürüldü. Ekstraksiyon çözücüsü [etanol, su, eter, piridin ve 4,2 N amonyum hidroksit (15:15:5:1:0,018 v/v)] ve 1,2 nmol dahili standart C17 seramid (860517, Avanti polar lipid) kullanıldı. Ekstraktın hafif alkali hidrolizini gerçekleştirmek için monometilamin reaktifi [metanol, su, n-butanol ve metilamin çözeltisi (4:3:1:5 v/v)] kullanıldı ve daha sonra tuzdan arındırmak için suyla doyurulmuş n-butanol kullanıldı. Son olarak, ekstrakt pozitif mod çözücüsünde [kloroform/metanol/su (2:7:1) + 5 mM amonyum asetat] yeniden süspansiyon haline getirildi ve kütle spektrometresine enjekte edildi. Sfingolipid moleküllerinin tanımlanması ve nicelendirilmesi için çoklu reaksiyon izleme (MRM) gerçekleştirildi. Lipid analizi için robotik nanoflow iyon kaynağı Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ile donatılmış TSQ Vantage üçüncül dört kutuplu kütle spektrometresi (Thermo Fisher Scientific) kullanıldı. Çarpışma enerjisi her seramid kategorisi için optimize edildi. MS verileri pozitif modda elde edildi. Her biyolojik tekrar için lipid sinyali, üç bağımsız ölçümün medyanıdır.
(31)'de açıklandığı gibi, Gas1-GFP'yi ifade eden hücreler (800×107) doğal immünopresipitasyona tabi tutuldu. Saflaştırılmış Gas1-GFP, SDS-PAGE ile ayrıldı ve bir poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarıldı. Protein, PVDF'nin amid siyahı ile boyanmasıyla görselleştirildi. Gas1-GFP bandı PVDF'den kesildi ve 5 kez metanol ve bir kez sıvı kromatografi-MS (LC-MS) sınıfı su ile yıkandı. Membran şeridi, 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), tampon ve 500 μl taze çözülmüş 1 M sodyum nitrit karışımı ile 37°C'de 3 saat inkübe edilerek, lipid fraksiyonu Gas1-GFP'den serbest bırakıldı ve lizize edildi. Glukozamin ve inositol arasında inozin fosfat seramidin salınımı (51). Bundan sonra, membran şeridi LC-MS sınıfı su ile dört kez yıkandı, oda sıcaklığında kurutuldu ve analize kadar -80°C'de azot atmosferinde saklandı. Kontrol olarak, her deney için boş bir PVDF membran örneği kullanıldı. Gas1-GFP'den ekstrakte edilen lipit daha sonra açıklandığı gibi MS ile analiz edildi (50). Kısaca, GPI-lipit içeren PVDF şeritleri 75 μl negatif kalıp çözücüsünde [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM amonyum asetat] yeniden süspansiyon haline getirildi ve sfingolipit türlerinin elektrospray iyonizasyonu (ESI)-MRM/MS Analizi (TSQ Vantage) gerçekleştirildi. Bu durumda, MS verileri negatif iyon modunda elde edildi.
Daha önce belirtildiği gibi, GPI ankrajının lipit kısmı [3H]-inositol etiketli GPI-AP'den ayrıldı (16). Lipitler, bir çözücü sistemi (55:45:10 kloroform-metanol-0.25% KCl) kullanılarak ince tabaka kromatografisi ile ayrıldı ve FLA-7000 (Fujifilm) kullanılarak görüntülendi.
Gas1-GFP eksprese eden hücreler (600×107), TNE tamponu ile iki kez yıkandı, cam boncuklarla parçalandı ve ardından hücre kalıntıları ve cam boncukları uzaklaştırmak için santrifüjlendi. Süpernatant daha sonra 4°C'de 1 saat boyunca 17.000 g'de santrifüjlendi. Pelet TNE'de yıkandı ve 37°C'de 1 saat boyunca %0,2 digitalis saponin içeren TNE'de 1 U PI-PLC (Invitrogen) ile inkübe edildi. Enzim işleminden sonra, membran 4°C'de 1 saat boyunca 17.000 g'de santrifüjlenerek uzaklaştırıldı. Gas1-GFP'yi immünopresipite etmek için, süpernatant 4°C'de gece boyunca GFP-Trap_A (ChromoTek) ile inkübe edildi. SDS-PAGE ile ayrılan saflaştırılmış Gas1-GFP, Coomassie brilliant blue ile boyandı. Gas1-GFP boyama bandı, su kanalını çevreleyen gri bölgeden kesildi ve daha sonra iyodoasetamid ile alkilasyon ve ditiyotreitol ile indirgeme işleminden sonra, tripsin ile jel içi sindirim gerçekleştirildi. Triptik peptitler ve GPI-glikanlı peptitler ekstrakte edildi ve kurutuldu. Kurutulmuş peptit 20 μl suda çözüldü. Bir kısmı (8 μl) LC'ye enjekte edildi. Peptitleri belirli gradyan koşulları altında ayırmak için bir oktadesilsilan (ODS) kolonu (Develosil 300ODS-HG-5; iç çap 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japonya) kullanıldı. Hareketli faz, çözücü A (%0,08 formik asit) ve çözücü B (%0,15 formik asit, %80 asetonitril içinde) idi. Kolon, 55 dakika içinde 50 μl min-1 akış hızında 5 dakika boyunca A çözücüsü ile elüe edilmek üzere bir Accela HPLC sistemi (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) kullanılarak elüe edildi ve ardından B çözücüsünün konsantrasyonu %40'a çıkarıldı (Amerika Birleşik Devletleri). Elüat sürekli olarak ESI iyon kaynağına verildi ve tripsin peptitleri ve GPI-glikanlı peptitler LTQ Orbitrap XL (hibrit doğrusal iyon kapanı-orbitrap kütle spektrometresi; Thermo Fisher Scientific) ile analiz edildi. MS kurulumunda, kılcal kaynak voltajı 4,5 kV'a ayarlandı ve transfer kılcalının sıcaklığı 300°C'de tutuldu. Kılcal voltajı ve tüp lens voltajı sırasıyla 15 V ve 50 V olarak ayarlandı. MS verileri, 300/m/z kütle/yük oranı (m/z) 3000 aralığında pozitif iyon modunda (çözünürlük 60.000; kütle doğruluğu milyonda 10 kısım) elde edilmiştir. MS/MS verileri, LTQ Orbitrap XL'deki iyon kapanı aracılığıyla elde edilir [verilerin bağlı olduğu ilk 3 basamak, çarpışma kaynaklı ayrışma (CID)].
MD simülasyonları GROMACS (52) yazılımı ve MARTINI 2 kuvvet alanı (53-55) kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra, dioleoilfosfatidilkolin (DOPC) ve Cer C18 veya DOPC ve Cer C26 içeren bir çift katman oluşturmak için CHARMM GUI Membran Oluşturucu (56, 57) kullanıldı. Cer C26'nın topolojisi ve koordinatları, sfingozin kuyruğundan fazla boncuklar çıkarılarak DXCE'den elde edildi. Çift katmanı dengelemek ve çalıştırmak için aşağıda açıklanan işlemi kullanın, ardından Emp24 içeren bir sistem oluşturmak için sistemin son koordinatlarını kullanın. Maya Emp24'ün transmembran alanı (173 ila 193 kalıntıları), görsel MD (VMD) aracı moleküler yapısı (58) kullanılarak bir α-heliks olarak oluşturuldu. Daha sonra, örtüşen lipitler çıkarıldıktan sonra, protein kaba bir şekilde granüle edildi ve CHARMM GUI kullanılarak çift katmana yerleştirildi. Son sistem 1202 DOPC ve 302 Cer C26 veya 1197 DOPC ve 295 Cer C18 ve Emp24 içermektedir. Sistemi 0,150 M konsantrasyona kadar iyonlaştırın. İki çift katmanlı bileşim için dört bağımsız tekrar yapılmıştır.
Lipit çift katmanı, CHARMM GUI işlemi kullanılarak dengelenir; bu işlem, konum kısıtlamalarının kademeli olarak azaltılıp ortadan kaldırıldığı ve zaman adımının 0,005 ps'den 0,02 ps'ye çıkarıldığı 405.000 adımlık bir minimizasyon ve ardından dengeleme içerir. Dengeleme sonrasında, 0,02 ps'lik bir zaman adımıyla 6 µs'lik bir süre elde edilir. Emp24 eklendikten sonra, sistemi minimize etmek ve dengelemek için aynı CHARMM GUI işlemi kullanılır ve ardından üretimde 8 saniye çalıştırılır.
Tüm sistemlerde, dengeleme işlemi sırasında basınç Berendsen barostatı (59) ile, üretim işlemi sırasında ise basınç Parrinello-Rahman barostatı (60) ile kontrol edilir. Tüm durumlarda ortalama basınç 1 bar olup yarı izotropik basınç eşleştirme şeması kullanılır. Dengeleme ve üretim işleminde, protein, lipit ve çözücü parçacıklarının sıcaklığını eşleştirmek için sırasıyla hız yeniden kalibrasyonlu bir termostat (61) kullanılır. Tüm işlem boyunca hedef sıcaklık 310K'dir. Bağlanmayan etkileşim, 0,005 tampon toleransı ile Verlet şeması kullanılarak bir eşleştirme listesi oluşturularak hesaplanır. Coulomb terimi, reaksiyon alanı ve 1,1 nm'lik bir kesme mesafesi kullanılarak hesaplanır. Vander Waals terimi, 1,1 nm'lik bir kesme mesafesi ile bir kesme şeması kullanır ve potansiyel kayma için Verlet kesme şeması kullanılır (62).
VMD kullanılarak, DOPC fosfat boncukları veya seramid AM1 boncukları ile protein arasındaki kesme dalga boyu 0,7 nm'dir ve proteinle etkileşime giren lipit sayısı hesaplanır. Aşağıdaki formüle göre, (63)'teki gibi tükenme-zenginleşme (DE) faktörünü hesaplayın: DE faktörü = (proteindeki toplam lipit miktarı 0,7) / proteindeki toplam lipit miktarı 0,7 (toplam lipitteki Cer miktarı)
Bildirilen değer ortalama olarak elde edilmiştir ve hata çubukları, standart hatanın dört bağımsız kopyasıdır. DE faktörünün istatistiksel anlamlılığı t testi [(ortalamaDE-faktör-1)/SE] ile hesaplanır. Tek yönlü dağılımdan P değerini hesaplayın.
GROMACS aracı, izlemenin son 250 ns'si içinde Emp24 içeren sistemin 2 boyutlu yanal yoğunluk haritasını hesaplamak için kullanıldı. Seramidin zenginleşme/azalma haritasını elde etmek için, Cer yoğunluk haritası, Cer ve DOPC haritalarının toplamına bölünür ve ardından vücuttaki Cer konsantrasyonuna bölünür. Aynı renk haritası ölçeği kullanılır.
Bu makaleye ait ek materyaller için lütfen şu adresi ziyaret edin: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Bu, Creative Commons Atıf-Ticari Olmayan Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir; bu lisans, son kullanımın ticari kazanç amacı taşımaması ve orijinal çalışmanın doğru olması şartıyla, herhangi bir ortamda kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin verir. Referans.
Not: Sizden yalnızca e-posta adresinizi istiyoruz, böylece sayfaya tavsiye ettiğiniz kişi e-postayı görmek istediğini ve bunun spam olmadığını anlasın. E-posta adreslerinizi hiçbir şekilde kaydetmeyeceğiz.
Bu soru, ziyaretçi olup olmadığınızı test etmek ve otomatik spam gönderimini önlemek için kullanılır.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho) Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3 boyutlu yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı görüntüleme, seçici çıkış bölgelerinde protein sıralaması için seramid zincir uzunluğunun önemini ortaya koymaktadır.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho) Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3 boyutlu yüksek çözünürlüklü gerçek zamanlı görüntüleme, seçici çıkış bölgelerinde protein sıralaması için seramid zincir uzunluğunun önemini ortaya koymaktadır.
©2020 Amerikan Bilimi İlerletme Derneği. her hakkı saklıdır. AAAS, HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ve COUNTER'ın ortağıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.