nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, en son tarayıcı sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli desteği sağlamak için bu sitede stil veya JavaScript yer almayacaktır.
Hidrojen sülfürün (H2S) insan vücudunda çok sayıda fizyolojik ve patolojik etkisi vardır. Sodyum hidrosülfür (NaHS), biyolojik deneylerde H2S'nin etkilerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir farmakolojik araçtır. NaHS çözeltilerinden H2S kaybı sadece birkaç dakika sürse de, bazı hayvan çalışmalarında içme suyunda H2S için verici bileşikler olarak kullanılmıştır. Bu çalışma, bazı yazarların önerdiği gibi, sıçan/fare su şişelerinde hazırlanan 30 μM NaHS konsantrasyonuna sahip içme suyunun en az 12-24 saat boyunca stabil kalıp kalamayacağını araştırmıştır. İçme suyunda 30 μM NaHS çözeltisi hazırlanmış ve hemen sıçan/fare su şişelerine dökülmüştür. Sülfür içeriğini metilen mavisi yöntemiyle ölçmek için su şişesinin ucundan ve içinden 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ve 24 saat sonra örnekler alınmıştır. Ek olarak, erkek ve dişi sıçanlara iki hafta boyunca NaHS (30 μM) enjekte edildi ve serum sülfür konsantrasyonları ilk hafta boyunca iki günde bir ve ikinci haftanın sonunda ölçüldü. Su şişesinin ucundan alınan örnekteki NaHS çözeltisi kararsızdı; 12 ve 24 saat sonra sırasıyla %72 ve %75 oranında azaldı. Su şişelerinin içinden alınan örneklerde, NaHS'deki azalma 2 saat içinde anlamlı değildi; ancak 12 ve 24 saat sonra sırasıyla %47 ve %72 oranında azaldı. NaHS enjeksiyonu, erkek ve dişi sıçanların serum sülfür seviyesini etkilemedi. Sonuç olarak, içme suyundan hazırlanan NaHS çözeltileri, çözeltinin kararsız olması nedeniyle H2S bağışı için kullanılmamalıdır. Bu uygulama yolu, hayvanları düzensiz ve beklenenden daha az miktarda NaHS'ye maruz bırakacaktır.
Hidrojen sülfür (H2S), 1700'lerden beri toksin olarak kullanılmaktadır; ancak, endojen bir biyosinyal molekülü olarak olası rolü, 1996 yılında Abe ve Kimura tarafından tanımlanmıştır. Son otuz yılda, H2S'nin çeşitli insan sistemlerindeki çok sayıda işlevi aydınlatılmış ve H2S verici moleküllerinin belirli hastalıkların tedavisinde veya yönetiminde klinik uygulamalara sahip olabileceği anlaşılmıştır; yakın tarihli bir inceleme için Chirino ve ark.'ya bakınız.
Sodyum hidrosülfür (NaHS), birçok hücre kültürü ve hayvan çalışmasında H2S'nin etkilerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir farmakolojik araçtır5,6,7,8. Bununla birlikte, NaHS ideal bir H2S vericisi değildir çünkü çözeltide hızla H2S/HS-'ye dönüşür, polisülfitlerle kolayca kirlenir ve kolayca oksitlenir ve buharlaşır4,9. Birçok biyolojik deneyde, NaHS suda çözülür ve bu da pasif buharlaşmaya ve H2S kaybına10,11,12, H2S'nin kendiliğinden oksidasyonuna11,12,13 ve fotolize14 neden olur. Orijinal çözeltideki sülfür, H2S'nin buharlaşması nedeniyle çok hızlı bir şekilde kaybolur11. Açık bir kapta, H2S'nin yarı ömrü (t1/2) yaklaşık 5 dakikadır ve konsantrasyonu dakikada yaklaşık %13 azalır10. NaHS çözeltilerinden hidrojen sülfürün kaybı sadece birkaç dakika sürse de, bazı hayvan çalışmalarında NaHS çözeltileri 1-21 hafta boyunca içme suyunda hidrojen sülfür kaynağı olarak kullanılmış ve NaHS içeren çözelti her 12-24 saatte bir değiştirilmiştir.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Bu uygulama, ilaç dozlarının diğer türlerde, özellikle insanlarda kullanımına göre belirlenmesi gerektiği için bilimsel araştırma ilkeleriyle tutarlı değildir.27
Biyomedikal alanındaki preklinik araştırmalar, hasta bakımının kalitesini veya tedavi sonuçlarını iyileştirmeyi amaçlamaktadır. Bununla birlikte, çoğu hayvan çalışmasının sonuçları henüz insanlara aktarılamamıştır28,29,30. Bu aktarım başarısızlığının nedenlerinden biri, hayvan çalışmalarının metodolojik kalitesine yeterince önem verilmemesidir30. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, bazı çalışmalarda iddia edildiği veya önerildiği gibi, sıçan/fare su şişelerinde hazırlanan 30 μM NaHS çözeltilerinin içme suyunda 12-24 saat boyunca stabil kalıp kalamayacağını araştırmaktı.
Bu çalışmadaki tüm deneyler, İran'da laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yayınlanan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir31. Bu çalışmadaki tüm deneysel raporlar ayrıca ARRIVE yönergelerine de uygun olarak hazırlanmıştır32. Bu çalışmadaki tüm deneysel prosedürler, Şehid Beheshti Tıp Bilimleri Üniversitesi Endokrinoloji Bilimleri Enstitüsü Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.
Çinko asetat dihidrat (CAS: 5970-45-6) ve susuz demir(III) klorür (CAS: 7705-08-0), Biochem, Chemopahrama'dan (Cosne-sur-Loire, Fransa) satın alındı. Sodyum hidrosülfür hidrat (CAS: 207683-19-0) ve N,N-dimetil-p-fenilendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0), Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO, ABD) satın alındı. İzofluran, Piramal'dan (Bethlehem, PA, ABD) satın alındı. Hidroklorik asit (HCl), Merck'ten (Darmstadt, Almanya) satın alındı.
İçme suyunda 30 μM'lik bir NaHS çözeltisi hazırlayın ve hemen sıçan/fare su şişelerine dökün. Bu konsantrasyon, H2S kaynağı olarak NaHS kullanan çok sayıda yayına dayanarak seçilmiştir; Tartışma bölümüne bakınız. NaHS, değişen miktarlarda hidratasyon suyu içerebilen (yani, NaHS•xH2O) hidratlanmış bir moleküldür; üreticiye göre, çalışmamızda kullanılan NaHS yüzdesi %70,7'dir (yani, NaHS•1,3 H2O) ve biz de hesaplamalarımızda bu değeri dikkate aldık; burada susuz NaHS'nin moleküler ağırlığı olan 56,06 g/mol moleküler ağırlığını kullandık. Hidratasyon suyu (kristalleşme suyu olarak da adlandırılır), kristal yapıyı oluşturan su molekülleridir33. Hidratlar, susuzlara kıyasla farklı fiziksel ve termodinamik özelliklere sahiptir34.
İçme suyuna NaHS eklemeden önce çözücünün pH'ını ve sıcaklığını ölçün. NaHS çözeltisini hemen hayvan kafesindeki sıçan/fare su şişesine dökün. Sülfür içeriğini ölçmek için 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 ve 24 saat sonra su şişesinin ucundan ve içinden örnekler alındı. Sülfür ölçümleri her örneklemeden hemen sonra yapıldı. Su tüpünün ucundan örnekler aldık çünkü bazı çalışmalar, su tüpünün küçük gözenek boyutunun H2S buharlaşmasını en aza indirebileceğini göstermiştir15,19. Bu durum, şişedeki çözelti için de geçerli gibi görünmektedir. Bununla birlikte, bu durum, daha yüksek buharlaşma oranına sahip ve otoksidasyona uğrayan su şişesinin boynundaki çözelti için geçerli değildi; aslında hayvanlar önce bu suyu içtiler.
Çalışmada erkek ve dişi Wistar sıçanları kullanıldı. Sıçanlar, standart koşullar altında (sıcaklık 21–26 °C, nem %32–40) 12 saat aydınlık (sabah 7'den akşam 7'ye) ve 12 saat karanlık (akşam 7'den sabah 7'ye) olacak şekilde polipropilen kafeslerde (kafes başına 2–3 sıçan) barındırıldı. Sıçanların musluk suyuna serbest erişimi vardı ve standart yemle (Khorak Dam Pars Şirketi, Tahran, İran) beslendiler. Yaşları eşleştirilmiş (6 aylık) dişi (n=10, vücut ağırlığı: 190–230 g) ve erkek (n=10, vücut ağırlığı: 320–370 g) Wistar sıçanları rastgele kontrol ve NaHS (30 μM) ile tedavi edilen gruplara ayrıldı (grup başına n=5). Örneklem büyüklüğünü belirlemek için, önceki deneyim ve güç analizini birleştiren KISS (Keep It Simple, Stupid - Basit Tut, Aptalca Olmasın) yaklaşımını kullandık. Öncelikle 3 sıçan üzerinde bir pilot çalışma yürüttük ve ortalama serum toplam sülfür seviyesini ve standart sapmasını (8,1 ± 0,81 μM) belirledik. Daha sonra, %80 güç ve iki taraflı %5 anlamlılık düzeyini varsayarak, Festing'in deneysel hayvanların örneklem büyüklüğünü hesaplamak için önerdiği önceden tanımlanmış değerle 2,02'lik standartlaştırılmış bir etki büyüklüğüne karşılık gelen ön bir örneklem büyüklüğü (önceki literatüre dayanarak n = 5) belirledik. Bu değeri SD ile (2,02 × 0,81) çarptıktan sonra, tahmin edilen tespit edilebilir etki büyüklüğü (1,6 μM) %20 oldu ki bu kabul edilebilir bir değerdir. Bu, gruplar arasında %20'lik bir ortalama değişimi tespit etmek için n = 5/grup sayısının yeterli olduğu anlamına gelir. Sıçanlar, Excel yazılımının rastgele fonksiyonu kullanılarak rastgele kontrol ve NaSH ile tedavi edilen gruplara ayrıldı 36 (Ek Şekil 1). Körleme, sonuç düzeyinde gerçekleştirildi ve biyokimyasal ölçümleri yapan araştırmacılar grup atamalarından haberdar değildi.
Her iki cinsiyetten NaHS gruplarına, içme suyunda hazırlanan 30 μM NaHS çözeltisi 2 hafta boyunca uygulandı; her 24 saatte bir taze çözelti verildi ve bu süre zarfında vücut ağırlığı ölçüldü. Birinci ve ikinci haftanın sonunda, her iki günde bir, izofluran anestezisi altında tüm sıçanların kuyruk uçlarından kan örnekleri alındı. Kan örnekleri 10 dakika boyunca 3000 g'de santrifüjlendi, serum ayrıldı ve serum üre, kreatinin (Cr) ve toplam sülfür ölçümü için -80°C'de saklandı. Serum üre, enzimatik üreaz yöntemiyle, serum kreatinin ise ticari olarak temin edilebilen kitler (Man Şirketi, Tahran, İran) ve otomatik bir analizör (Selectra E, seri numarası 0-2124, Hollanda) kullanılarak fotometrik Jaffe yöntemiyle belirlendi. Üre ve Cr için intra- ve interassay varyasyon katsayıları %2,5'ten azdı.
Metilen mavisi (MB) yöntemi, içme suyunda ve NaHS içeren serumda toplam sülfürü ölçmek için kullanılır; MB, toplu çözeltilerde ve biyolojik örneklerde sülfürü ölçmek için en yaygın kullanılan yöntemdir11,37. MB yöntemi, toplam sülfür havuzunu tahmin etmek38 ve sulu fazda H2S, HS- ve S2 formundaki inorganik sülfürleri ölçmek için kullanılabilir39. Bu yöntemde, kükürt, çinko asetat varlığında çinko sülfür (ZnS) olarak çöktürülür11,38. Çinko asetat çöktürme, sülfürleri diğer kromoforlardan ayırmak için en yaygın kullanılan yöntemdir11. ZnS, güçlü asidik koşullar altında HCl11 kullanılarak yeniden çözülür. Sülfür, demir klorür (Fe3+ oksitleyici madde görevi görür) tarafından katalize edilen bir reaksiyonda 1:2 stokiyometrik oranda DMPD ile reaksiyona girerek 670 nm'de spektrofotometrik olarak tespit edilen MB boyasını oluşturur40,41. MB yönteminin tespit limiti yaklaşık 1 μM'dir11.
Bu çalışmada, her bir numuneden (çözelti veya serum) 100 μL bir tüpe eklendi; daha sonra 200 μL çinko asetat (%1 a/h damıtılmış suda), 100 μL DMPD (7,2 M HCl'de 20 mM) ve 133 μL FeCl3 (1,2 M HCl'de 30 mM) eklendi. Karışım 37°C'de karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Çözelti 10.000 g'de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatantın absorbansı bir mikroplaka okuyucu (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, ABD) kullanılarak 670 nm'de okundu. Sülfür konsantrasyonları, ddH2O'da NaHS (0–100 μM) kalibrasyon eğrisi kullanılarak belirlendi (Ek Şekil 2). Ölçümler için kullanılan tüm çözeltiler taze olarak hazırlandı. Sülfür ölçümleri için intra- ve interassay varyasyon katsayıları sırasıyla %2,8 ve %3,4 idi. Ayrıca, güçlendirilmiş örnek yöntemi42 kullanılarak sodyum tiyosülfat içeren içme suyu ve serum örneklerinden geri kazanılan toplam sülfür miktarını da belirledik. Sodyum tiyosülfat içeren içme suyu ve serum örnekleri için geri kazanım oranları sırasıyla %91 ± 1,1 (n = 6) ve %93 ± 2,4 (n = 6) idi.
İstatistiksel analiz, Windows için GraphPad Prism yazılımı sürüm 8.0.2 (GraphPad Software, San Diego, CA, ABD, www.graphpad.com) kullanılarak gerçekleştirildi. İçme suyunun sıcaklığı ve pH'ı, NaHS ilavesinden önce ve sonra karşılaştırmak için eşleştirilmiş t-testi kullanıldı. NaHS içeren çözeltideki H2S kaybı, bazal alımdan yüzde azalma olarak hesaplandı ve kaybın istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını değerlendirmek için, tek yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA'sı ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi uygulandı. Vücut ağırlığı, serum üre, serum kreatinin ve toplam serum sülfür değerleri, farklı cinsiyetlerdeki kontrol ve NaHS ile tedavi edilen sıçanlar arasında zaman içinde iki yönlü karışık (arasında-içinde) ANOVA ve ardından Bonferroni post hoc testi kullanılarak karşılaştırıldı. İki yönlü P değerleri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
İçme suyunun pH değeri NaHS ilavesinden önce 7,60 ± 0,01 iken, NaHS ilavesinden sonra 7,71 ± 0,03 olmuştur (n = 13, p = 0,0029). İçme suyunun sıcaklığı 26,5 ± 0,2 iken, NaHS ilavesinden sonra 26,2 ± 0,2'ye düşmüştür (n = 13, p = 0,0128). İçme suyunda 30 μM NaHS çözeltisi hazırlanıp bir su şişesinde saklanmıştır. NaHS çözeltisi kararsızdır ve konsantrasyonu zamanla azalır. Su şişesinin ağzından alınan örneklerde, ilk saat içinde önemli bir azalma (%68,0) gözlemlenmiş ve çözeltideki NaHS içeriği 12 ve 24 saat sonra sırasıyla %72 ve %75 oranında azalmıştır. Su şişelerinden alınan örneklerde, NaHS'deki azalma 2 saate kadar önemli değildi, ancak 12 ve 24 saat sonra sırasıyla %47 ve %72 oranında azaldı. Bu veriler, içme suyunda hazırlanan 30 μM'lik bir çözeltideki NaHS yüzdesinin, örnekleme konumundan bağımsız olarak, 24 saat sonra başlangıç ​​değerinin yaklaşık dörtte birine düştüğünü göstermektedir (Şekil 1).
Sıçan/fare şişelerinde içme suyunda NaHS çözeltisinin (30 μM) stabilitesi. Çözelti hazırlandıktan sonra, su şişesinin ucundan ve iç kısmından örnekler alındı. Veriler ortalama ± standart sapma (n = 6/grup) olarak sunulmuştur. * ve #, 0. zamana göre P < 0,05. Su şişesinin fotoğrafı, şişenin ucunu (açıklığıyla birlikte) ve gövdesini göstermektedir. Uç hacmi yaklaşık 740 μL'dir.
Yeni hazırlanmış 30 μM'lik çözeltideki NaHS konsantrasyonu 30,3 ± 0,4 μM (aralık: 28,7–31,9 μM, n = 12) idi. Ancak 24 saat sonra NaHS konsantrasyonu daha düşük bir değere düştü (ortalama: 3,0 ± 0,6 μM). Şekil 2'de gösterildiği gibi, sıçanların maruz kaldığı NaHS konsantrasyonları çalışma süresi boyunca sabit kalmadı.
Dişi sıçanların vücut ağırlığı zamanla önemli ölçüde arttı (kontrol grubunda 205,2 ± 5,2 g'dan 213,8 ​​± 7,0 g'a ve NaHS ile tedavi edilen grupta 204,0 ± 8,6 g'dan 211,8 ± 7,5 g'a); ancak NaHS tedavisi vücut ağırlığı üzerinde herhangi bir etki göstermedi (Şekil 3). Erkek sıçanların vücut ağırlığı zamanla önemli ölçüde arttı (kontrol grubunda 338,6 ± 8,3 g'dan 352,4 ± 6,0 g'a ve NaHS ile tedavi edilen grupta 352,4 ± 5,9 g'dan 363,2 ± 4,3 g'a); ancak NaHS tedavisi vücut ağırlığı üzerinde herhangi bir etki göstermedi (Şekil 3).
Dişi ve erkek sıçanlarda NaHS (30 μM) uygulamasından sonra vücut ağırlığındaki değişiklikler. Veriler ortalama ± standart hata olarak sunulmuştur ve Bonferroni post hoc testi ile iki yönlü karışık (grup içi-gruplar arası) varyans analizi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Her grupta her cinsiyetten 5 sıçan bulunmaktadır.
Çalışma boyunca kontrol ve NaSH ile tedavi edilen sıçanlarda serum üre ve kreatin fosfat konsantrasyonları karşılaştırılabilir düzeydeydi. Ayrıca, NaSH tedavisi serum üre ve kreatin krom konsantrasyonlarını etkilemedi (Tablo 1).
Kontrol ve NaHS ile tedavi edilen erkek (8,1 ± 0,5 μM'ye karşı 9,3 ± 0,2 μM) ve dişi (9,1 ± 1,0 μM'ye karşı 6,1 ± 1,1 μM) sıçanlar arasında bazal serum toplam sülfür konsantrasyonları karşılaştırılabilir düzeydeydi. 14 gün boyunca NaHS uygulanmasının, erkek veya dişi sıçanlarda serum toplam sülfür seviyeleri üzerinde hiçbir etkisi olmadı (Şekil 4).
Erkek ve dişi sıçanlarda NaHS (30 μM) uygulamasından sonra serum toplam sülfür konsantrasyonlarındaki değişiklikler. Veriler ortalama ± standart hata olarak sunulmuştur ve Bonferroni post hoc testi ile iki yönlü karışık (iç-iç) varyans analizi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Her cinsiyet için n = 5/grup.
Bu çalışmanın temel sonucu, NaHS içeren içme suyunun kararsız olduğudur: fare/sıçan su şişelerinin ucundan ve içinden alınan örneklerden 24 saat sonra, başlangıçtaki toplam sülfür içeriğinin yalnızca yaklaşık dörtte biri tespit edilebilmektedir. Ayrıca, sıçanlar NaHS çözeltisindeki H2S kaybı nedeniyle kararsız NaHS konsantrasyonlarına maruz kalmışlardır ve içme suyuna NaHS eklenmesi vücut ağırlığını, serum üre ve kreatin kromunu veya toplam serum sülfürünü etkilememiştir.
Bu çalışmada, içme suyunda hazırlanan 30 μM NaHS çözeltilerinden H2S kaybı oranı saatte yaklaşık %3 olarak bulunmuştur. Tamponlanmış bir çözeltide (10 mM PBS'de 100 μM sodyum sülfür, pH 7,4), sülfür konsantrasyonunun 8 saat boyunca %7 oranında azaldığı bildirilmiştir¹¹. Daha önce, içme suyunda 54 μM NaHS çözeltisinden sülfür kaybı oranının saatte yaklaşık %2,3 olduğunu (hazırlandıktan sonraki ilk 12 saatte %4/saat ve son 12 saatte %1,4/saat)⁸ bildirerek NaHS'nin intraperitoneal uygulamasını savunmuştuk. Daha önceki çalışmalar⁴³ NaHS çözeltilerinden, esas olarak buharlaşma ve oksidasyon nedeniyle, sürekli bir H2S kaybı olduğunu bulmuştur. Kabarcık eklenmese bile, stok çözeltideki sülfür, H2S buharlaşması nedeniyle hızla kaybolmaktadır¹¹. Çalışmalar, yaklaşık 30-60 saniye süren seyreltme işlemi sırasında, H2S'nin yaklaşık %5-10'unun buharlaşma nedeniyle kaybolduğunu göstermiştir⁶. Çözeltiden H2S'nin buharlaşmasını önlemek için araştırmacılar, çözeltinin hafifçe karıştırılması¹², ana çözeltinin plastik filmle örtülmesi⁶ ve çözeltinin havaya maruz kalmasının en aza indirilmesi¹³ gibi çeşitli önlemler almışlardır, çünkü H2S buharlaşma hızı hava-sıvı arayüzüne bağlıdır. H2S'nin kendiliğinden oksidasyonu esas olarak, özellikle suda bulunan safsızlıklar olan demir(III) iyonları olmak üzere geçiş metal iyonlarından kaynaklanır¹³. H2S'nin oksidasyonu, polisülfitlerin (kovalent bağlarla birbirine bağlı kükürt atomları)¹¹ oluşmasına neden olur. Oksidasyonunu önlemek için, H2S içeren çözeltiler oksijensizleştirilmiş çözücülerde hazırlanır44,45 ve daha sonra oksijensizleştirmeyi sağlamak için 20-30 dakika boyunca argon veya azot ile arındırılır.11,12,37,44,45,46 Dietilentriaminpentaasetik asit (DTPA), aerobik çözeltilerde HS- otoksidasyonunu önleyen bir metal şelatlayıcıdır (10–4 M). DTPA yokluğunda, HS-'nin otoksidasyon oranı 25°C'de yaklaşık 3 saatte yaklaşık %50'dir37,47. Ayrıca, 1e-sülfürün oksidasyonu ultraviyole ışık tarafından katalize edildiğinden, çözelti buz üzerinde saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır11.
Şekil 5'te gösterildiği gibi, NaHS suda çözündüğünde Na+ ve HS-6'ya ayrışır; bu ayrışma, sıcaklığa bağlı olan reaksiyonun pK1 değeri tarafından belirlenir: pK1 = 3,122 + 1132/T, burada T, 5 ila 30°C arasında değişir ve Kelvin (K) cinsinden ölçülür, K = °C + 273,1548. HS- yüksek bir pK2 değerine sahiptir (pK2 = 19), bu nedenle pH < 96,49'da S2- oluşmaz veya çok küçük miktarlarda oluşur. Buna karşılık, HS- bir baz gibi davranır ve bir H2O molekülünden H+ kabul eder ve H2O bir asit gibi davranır ve H2S ve OH-'ye dönüştürülür.
NaHS çözeltisinde (30 µM) çözünmüş H2S gazının oluşumu. aq, sulu çözelti; g, gaz; l, sıvı. Tüm hesaplamalar suyun pH'ının 7,0 ve su sıcaklığının 20 °C olduğunu varsaymaktadır. BioRender.com ile oluşturulmuştur.
NaHS çözeltilerinin kararsız olduğuna dair kanıtlara rağmen, çeşitli hayvan çalışmalarında içme suyunda H2S verici bileşik olarak NaHS çözeltileri kullanılmıştır15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ve müdahale süreleri 1 ila 21 hafta arasında değişmektedir (Tablo 2). Bu çalışmalar sırasında, NaHS çözeltisi her 12 saatte, 15, 17, 18, 24, 25 saatte veya 24 saatte, 19, 20, 21, 22, 23 saatte bir yenilenmiştir. Sonuçlarımız, sıçanların NaHS çözeltisinden H2S kaybı nedeniyle kararsız ilaç konsantrasyonlarına maruz kaldığını ve sıçanların içme suyundaki NaHS içeriğinin 12 veya 24 saat boyunca önemli ölçüde dalgalandığını göstermiştir (bkz. Şekil 2). Bu çalışmalardan ikisi, sudaki H2S seviyelerinin 24 saat boyunca sabit kaldığını22 veya 12 saat boyunca sadece %2-3 H2S kaybı gözlemlendiğini15 bildirmiştir, ancak destekleyici veri veya ölçüm ayrıntıları sunmamışlardır. İki çalışma, su şişelerinin küçük çapının H2S buharlaşmasını en aza indirebileceğini göstermiştir15,19. Bununla birlikte, sonuçlarımız bunun bir su şişesinden H2S kaybını 12-24 saat yerine sadece 2 saat geciktirebileceğini göstermiştir. Her iki çalışma da, içme suyundaki NaHS seviyesinin değişmediğini varsaydığımızı, çünkü suda renk değişikliği gözlemlemediğimizi; bu nedenle, H2S'nin hava ile oksidasyonunun önemli olmadığını belirtmektedir19,20. Şaşırtıcı bir şekilde, bu öznel yöntem, NaHS'nin sudaki konsantrasyonundaki değişimi zaman içinde ölçmek yerine, sudaki NaHS'nin stabilitesini değerlendirmektedir.
NaHS çözeltisindeki H2S kaybı pH ve sıcaklıkla ilişkilidir. Çalışmamızda belirtildiği gibi, NaHS'nin suda çözünmesi alkali bir çözelti oluşumuna neden olur50. NaHS suda çözündüğünde, çözünmüş H2S gazının oluşumu pH değerine bağlıdır6. Çözeltinin pH'ı ne kadar düşükse, H2S gaz molekülleri olarak bulunan NaHS oranı o kadar yüksek olur ve sulu çözeltiden o kadar fazla sülfür kaybolur11. Bu çalışmalardan hiçbiri, NaHS için çözücü olarak kullanılan içme suyunun pH'ını bildirmemiştir. Çoğu ülke tarafından benimsenen DSÖ önerilerine göre, içme suyunun pH'ı 6,5-8,5 aralığında olmalıdır51. Bu pH aralığında, H2S'nin kendiliğinden oksidasyon hızı yaklaşık on kat artar13. Bu pH aralığında NaHS'nin suda çözünmesi, 1 ila 22,5 μM arasında çözünmüş H2S gaz konsantrasyonuna neden olur; bu da NaHS'yi çözmeden önce suyun pH'ının izlenmesinin önemini vurgular. Ayrıca, yukarıdaki çalışmada bildirilen sıcaklık aralığı (18–26 °C), sıcaklık değişimleri pK1'i değiştirdiğinden ve pK1'deki küçük değişikliklerin çözünmüş H2S gazı konsantrasyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden, çözeltideki çözünmüş H2S gazı konsantrasyonunda yaklaşık %10'luk bir değişikliğe neden olacaktır48. Buna ek olarak, büyük sıcaklık değişkenliğinin beklendiği bazı çalışmaların uzun süresi (5 ay)22 de bu sorunu daha da kötüleştirmektedir.
Bir çalışma hariç tüm çalışmalarda içme suyunda 30 μM NaHS çözeltisi kullanılmıştır. Kullanılan dozu (yani 30 μM) açıklamak için bazı yazarlar, sulu fazdaki NaHS'nin tam olarak aynı konsantrasyonda H2S gazı ürettiğini ve H2S'nin fizyolojik aralığının 10 ila 100 μM olduğunu, dolayısıyla bu dozun fizyolojik aralıkta olduğunu belirtmişlerdir15,16. Diğerleri ise 30 μM NaHS'nin plazma H2S seviyesini fizyolojik aralıkta, yani 5-300 μM'de tutabileceğini açıklamışlardır19,20. H2S'nin etkilerini incelemek için bazı çalışmalarda kullanılan 30 μM'lik (pH = 7,0, T = 20 °C) sudaki NaHS konsantrasyonunu ele alıyoruz. Çözünmüş H2S gazının konsantrasyonunun 14,7 μM olduğunu hesaplayabiliriz; bu da başlangıçtaki NaHS konsantrasyonunun yaklaşık %50'sidir. Bu değer, aynı koşullar altında diğer yazarlar tarafından hesaplanan değere benzerdir13,48.
Çalışmamızda, NaHS uygulaması vücut ağırlığını değiştirmedi; bu sonuç, erkek farelerde22,23 ve erkek sıçanlarda18 yapılan diğer çalışmaların sonuçlarıyla tutarlıdır; ancak, iki çalışma NaSH'nin nefrektomize sıçanlarda azalan vücut ağırlığını geri kazandırdığını bildirmiştir24,26, diğer çalışmalar ise NaSH uygulamasının vücut ağırlığı üzerindeki etkisini bildirmemiştir15,16,17,19,20,21,25. Ayrıca, çalışmamızda NaSH uygulaması serum üre ve kreatin krom seviyelerini etkilemedi, bu da başka bir raporun sonuçlarıyla tutarlıdır25.
Çalışma, içme suyuna 2 hafta boyunca NaHS eklenmesinin erkek ve dişi sıçanlarda toplam serum sülfür konsantrasyonlarını etkilemediğini bulmuştur. Bu bulgu, Sen ve ark. (16)'nın sonuçlarıyla tutarlıdır: İçme suyunda 30 μM NaHS ile 8 haftalık tedavi, kontrol sıçanlarında plazma sülfür seviyelerini etkilememiştir; ancak, bu müdahalenin nefrektomize edilmiş farelerin plazmasındaki azalmış H2S seviyelerini geri kazandırdığını bildirmişlerdir. Li ve ark. (22) ayrıca, içme suyunda 30 μM NaHS ile 5 ay süren tedavinin, yaşlı farelerde plazma serbest sülfür seviyelerini yaklaşık %26 oranında artırdığını bildirmiştir. Diğer çalışmalar, içme suyuna NaHS eklenmesinden sonra dolaşımdaki sülfürde değişiklik bildirmemiştir.
Yedi çalışmada Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23 kullanıldığı bildirilmiş ancak hidratasyon suyuna ilişkin daha fazla ayrıntı verilmemiştir ve beş çalışmada ise hazırlama yöntemlerinde kullanılan NaHS kaynağı belirtilmemiştir17,18,24,25,26. NaHS, hidratlanmış bir moleküldür ve hidratasyon suyu içeriği değişebilir; bu da belirli bir molaritede çözelti hazırlamak için gereken NaHS miktarını etkiler. Örneğin, çalışmamızdaki NaHS içeriği NaHS•1.3 H2O idi. Bu nedenle, bu çalışmalardaki gerçek NaHS konsantrasyonları, bildirilenlerden daha düşük olabilir.
Pozgay ve ark.21, farelerde kolit üzerindeki NaHS etkilerini değerlendirirken, “Bu kadar kısa ömürlü bir bileşiğin bu kadar uzun süreli bir etkiye sahip olması nasıl mümkün olabilir?” sorusunu sormuşlardır. Gelecekteki çalışmaların bu soruyu yanıtlayabileceğini umuyorlar ve NaHS çözeltilerinin, NaHS21'in etkisine aracılık eden H2S ve disülfitlere ek olarak daha kararlı polisülfitler içerebileceğini tahmin ediyorlar. Bir diğer olasılık ise, çözeltide kalan çok düşük konsantrasyonlardaki NaHS'nin de faydalı bir etkiye sahip olmasıdır. Nitekim, Olson ve ark., kanda mikromolar düzeydeki H2S'nin fizyolojik olmadığını ve nanomolar aralığında veya tamamen yok olması gerektiğini kanıtlamışlardır13. H2S, birçok proteinin fonksiyonunu, stabilitesini ve lokalizasyonunu etkileyen geri dönüşümlü bir post-translasyonel modifikasyon olan protein sülfasyonu yoluyla etki edebilir52,53,54. Aslında, fizyolojik koşullar altında, birçok karaciğer proteininin yaklaşık %10 ila %25'i sülfile edilmiştir53. Her iki çalışma da NaHS19,23'ün hızlı yıkımını kabul ediyor ancak şaşırtıcı bir şekilde "içme suyundaki NaHS konsantrasyonunu günlük olarak değiştirerek kontrol ettik"23 diyor. Bir çalışma ise yanlışlıkla "NaHS standart bir H2S vericisidir ve klinik uygulamada H2S'nin kendisini değiştirmek için yaygın olarak kullanılır"18 ifadesini kullanmıştır.
Yukarıdaki tartışma, NaHS'nin çözeltiden buharlaşma, oksidasyon ve fotoliz yoluyla kaybolduğunu göstermektedir ve bu nedenle çözeltiden H2S kaybını azaltmak için bazı önerilerde bulunulmaktadır. Birincisi, H2S'nin buharlaşması gaz-sıvı arayüzüne13 ve çözeltinin pH'ına11 bağlıdır; bu nedenle, buharlaşma kaybını en aza indirmek için, su şişesinin boynu daha önce açıklandığı gibi mümkün olduğunca küçük yapılabilir15,19 ve suyun pH'ı buharlaşma kaybını en aza indirmek için kabul edilebilir bir üst sınıra (yani 6,5–8,551) ayarlanabilir11. İkincisi, H2S'nin kendiliğinden oksidasyonu, içme suyundaki oksijenin etkileri ve geçiş metal iyonlarının varlığı nedeniyle meydana gelir13, bu nedenle içme suyunun argon veya azotla oksijensizleştirilmesi44,45 ve metal şelatörlerin kullanımı37,47 sülfürlerin oksidasyonunu azaltabilir. Üçüncüsü, H2S'nin fotodekompozisyonunu önlemek için su şişeleri alüminyum folyo ile sarılabilir; Bu uygulama, streptozotosin55 gibi ışığa duyarlı maddeler için de geçerlidir. Son olarak, inorganik sülfür tuzları (NaHS, Na2S ve CaS), daha önce bildirildiği gibi içme suyunda çözülmek yerine gavaj yoluyla uygulanabilir56,57,58; çalışmalar, sıçanlara gavaj yoluyla uygulanan radyoaktif sodyum sülfürün iyi emildiğini ve hemen hemen tüm dokulara dağıldığını göstermiştir59. Bugüne kadar, çoğu çalışma inorganik sülfür tuzlarını intraperitoneal olarak uygulamıştır; ancak bu yol klinik ortamlarda nadiren kullanılmaktadır60. Öte yandan, oral yol insanlarda en yaygın ve tercih edilen uygulama yoludur61. Bu nedenle, H2S vericilerinin kemirgenlerdeki etkilerinin oral gavaj yoluyla değerlendirilmesini öneriyoruz.
Bir sınırlama, sulu çözelti ve serumdaki sülfürü MB yöntemiyle ölçmüş olmamızdır. Sülfür ölçüm yöntemleri arasında iyot titrasyonu, spektrofotometri, elektrokimyasal yöntem (potansiyometri, amperometri, kulometrik yöntem ve amperometrik yöntem) ve kromatografi (gaz kromatografisi ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi) yer almaktadır; bunlar arasında en yaygın kullanılan yöntem MB spektrofotometrik yöntemidir62. Biyolojik örneklerde H2S ölçümü için MB yönteminin bir sınırlaması, asidik koşullar altında gerçekleştirildiği için serbest H2S'yi değil, tüm kükürt içeren bileşikleri ölçmesidir63; bu da biyolojik kaynaktan kükürtün ekstraksiyonuna neden olur64. Bununla birlikte, Amerikan Halk Sağlığı Birliği'ne göre MB, suda sülfür ölçümü için standart yöntemdir65. Bu nedenle, bu sınırlama, NaHS içeren çözeltilerin kararsızlığı hakkındaki ana sonuçlarımızı etkilemez. Ayrıca, çalışmamızda, NaHS içeren su ve serum örneklerindeki sülfür ölçümlerinin geri kazanımı sırasıyla %91 ve %93 olmuştur. Bu değerler, daha önce bildirilen aralıklarla (77–92)66 uyumludur ve kabul edilebilir analitik hassasiyeti göstermektedir42. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine uygun olarak, klinik öncesi çalışmalarda yalnızca erkek hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalara aşırı güveni önlemek67 ve mümkün olduğunca hem erkek hem de dişi sıçanları dahil etmek68 için hem erkek hem de dişi sıçanlar kullandığımızı belirtmekte fayda var. Bu nokta başkaları tarafından da vurgulanmıştır69,70,71.
Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçları, içme suyundan hazırlanan NaHS çözeltilerinin kararsızlıkları nedeniyle H2S üretmek için kullanılamayacağını göstermektedir. Bu uygulama yöntemi, hayvanları kararsız ve beklenenden düşük seviyelerde NaHS'ye maruz bırakacaktır; bu nedenle, bulgular insanlar için geçerli olmayabilir.
Bu çalışmada kullanılan ve/veya analiz edilen veri setleri, makul bir talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir.
Szabo, K. Hidrojen sülfür (H2S) araştırmalarının zaman çizelgesi: çevresel toksinden biyolojik aracıya. Biyokimya ve Farmakoloji 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. ve Kimura, H. Hidrojen sülfürün endojen bir nöromodülatör olarak olası rolü. Nörobilim Dergisi, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. ve Papapetropoulos, A. Memeli hücrelerinde, dokularında ve organlarında hidrojen sülfürün fizyolojik rolü. Fizyoloji ve Moleküler Biyoloji İncelemeleri 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB ve Kashfi, K. Nitrik oksit ve hidrojen sülfür için hücresel dağıtım sistemlerinin gelişen vaadi: kişiselleştirilmiş tıbbın yeni bir çağı. Biyokimya ve Farmakoloji 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., ve diğerleri. Yavaş salınımlı hidrojen sülfür donörünün uzun süreli uygulanması miyokardiyal iskemi/reperfüzyon hasarını önleyebilir. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM ve Hermann, A. BK kanal fosforilasyonu hidrojen sülfür (H2S) duyarlılığını düzenler. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM ve Hermann, A. Hidrojen sülfür, sıçan hipofiz tümör hücrelerinde kalsiyumla aktive olan potasyum (BK) kanal aktivitesini artırır. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., ve diğerleri. Hidrojen sülfür, tip 2 diyabetli sıçanlarda miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarına karşı nitritin koruyucu etkisini artırır. Nitrik Oksit 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., ve diğerleri. H2S verici kimyasındaki eğilimler ve bunun kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkisi. Antioksidanlar 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF ve Olson, KR (2012). Biyolojik deneylerde hidrojen sülfürün pasif kayıpları. Analitik Biyokimya 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., ve diğerleri. Fizyolojik örneklerde hidrojen sülfür ölçümlerinin kimyasal yönleri. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Doğal sularda hidrojen sülfürün spektrofotometrik tayini. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Hidrojen sülfürün kimyası ve biyolojisi üzerine pratik eğitim. “Antioksidanlar.” Redoks Sinyallemesi. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).