Daha önce, bağırsaktan türetilen triptofan metaboliti indol-3-propiyonik asit (IPA) serum seviyelerinin karaciğer fibrozisi olan hastalarda daha düşük olduğunu bildirmiştik. Bu çalışmada, obez karaciğerlerdeki transkriptom ve DNA metilomunu serum IPA seviyeleriyle ilişkili olarak ve ayrıca IPA'nın in vitro olarak hepatik stellat hücrelerinin (HSC'ler) fenotipik inaktivasyonunu indüklemedeki rolünü araştırdık.
Çalışmaya, Kuopio Bariatrik Cerrahi Merkezi'nde (KOBS) bariatrik cerrahi geçiren, tip 2 diyabeti (T2DM) olmayan 116 obez hasta (yaş 46,8 ± 9,3 yıl; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) dahil edildi. Dolaşımdaki IPA düzeyleri sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) ile ölçüldü, karaciğer transkriptom analizi toplam RNA sekanslaması ile gerçekleştirildi ve DNA metilasyon analizi Infinium HumanMethylation450 BeadChip kullanılarak yapıldı. İn vitro deneyler için insan hepatik stellat hücreleri (LX-2) kullanıldı.
Serum IPA düzeyleri, karaciğerdeki apoptotik, mitofajik ve uzun ömürlülük yollarında yer alan genlerin ekspresyonuyla ilişkilidir. AKT serin/treonin kinaz 1 (AKT1) geni, karaciğer transkript ve DNA metilasyon profillerinde en bol ve baskın etkileşimli gen olmuştur. IPA tedavisi, LX-2 hücrelerinin fibrozunu, apoptozunu ve hayatta kalmasını düzenlediği bilinen genlerin ekspresyonunu modüle ederek apoptozu indüklemiş, mitokondriyal solunumu azaltmış ve hücre morfolojisini ve mitokondriyal dinamikleri değiştirmiştir.
Bu veriler bir araya getirildiğinde, IPA'nın potansiyel terapötik etkilere sahip olduğunu ve apoptozu indükleyerek HSC fenotipini inaktif bir duruma doğru kaydırabileceğini, böylece HSC aktivasyonuna ve mitokondriyal metabolizmaya müdahale ederek karaciğer fibrozunu engelleme olasılığını genişlettiğini desteklemektedir.
Obezite ve metabolik sendromun yaygınlığı, metabolik olarak ilişkili yağlı karaciğer hastalığının (MASLD) artan sıklığıyla ilişkilendirilmiştir; hastalık genel popülasyonun %25 ila %30'unu etkiler [1]. MASLD etiyolojisinin ana sonucu, sürekli lifli hücre dışı matris (ECM) birikimi ile karakterize dinamik bir süreç olan karaciğer fibrozisidir [2]. Karaciğer fibrozisinde rol oynayan ana hücreler, dört bilinen fenotip sergileyen hepatik stellat hücrelerdir (HSC'ler): durgun, aktif, inaktif ve yaşlanmış [3, 4]. HSC'ler aktif hale gelebilir ve durgun formdan yüksek enerji talepleri olan, α-düz kas aktini (α-SMA) ve tip I kollajen (Col-I) ekspresyonu artmış proliferatif fibroblast benzeri hücrelere transdiferansiyasyona uğrayabilir [5, 6]. Karaciğer fibrozisinin geri dönüşü sırasında, aktif HSC'ler apoptoz veya inaktivasyon yoluyla ortadan kaldırılır. Bu süreçler fibrojenez genlerinin aşağı düzenlenmesini ve hayatta kalmayı destekleyen genlerin (NF-κB ve PI3K/Akt sinyal yolları gibi) modülasyonunu [7, 8] ve ayrıca mitokondriyal dinamiklerde ve fonksiyonda değişiklikleri [9] içerir.
Bağırsakta üretilen triptofan metaboliti indol-3-propiyonik asit (IPA) serum seviyelerinin, MASLD dahil olmak üzere insan metabolik hastalıklarında azaldığı bulunmuştur [10–13]. IPA, diyet lifi alımıyla ilişkilidir, antioksidan ve anti-inflamatuar etkileriyle bilinir ve diyet kaynaklı alkolsüz steatohepatit (NASH) fenotipini in vivo ve in vitro olarak hafifletir [11–14]. Bazı kanıtlar, Kuopio Bariatrik Cerrahi Çalışması'nda (KOBS) karaciğer fibrozisi olan hastalarda serum IPA seviyelerinin karaciğer fibrozisi olmayan obez hastalara göre daha düşük olduğunu gösteren önceki çalışmamızdan gelmektedir. Ayrıca, IPA tedavisinin, insan hepatik stellat hücre (LX-2) modelinde hücre yapışması, hücre göçü ve hematopoetik kök hücre aktivasyonunun klasik belirteçleri olan genlerin ekspresyonunu azaltabileceğini ve potansiyel bir hepatoprotektif metabolit olduğunu gösterdik [15]. Ancak, IPA'nın HSC apoptozunu ve mitokondriyal biyoeenerjiyi aktive ederek karaciğer fibrozunun gerilemesini nasıl tetiklediği hala belirsizliğini koruyor.
Burada, serum IPA'nın obez ancak tip 2 diyabeti olmayan (KOBS) bireylerin karaciğerinde apoptoz, mitofaji ve uzun ömürlülük yollarında zenginleşmiş genlerin ekspresyonuyla ilişkili olduğunu gösteriyoruz. Ayrıca, IPA'nın inaktivasyon yoluyla aktif hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) temizlenmesini ve parçalanmasını indükleyebildiğini bulduk. Bu sonuçlar, IPA için yeni bir rol ortaya koyarak, karaciğer fibrozunun gerilemesini teşvik etmek için potansiyel bir terapötik hedef haline getiriyor.
KOBS kohortunda yapılan önceki bir çalışma, karaciğer fibrozisi olan hastaların karaciğer fibrozisi olmayan hastalara kıyasla dolaşımdaki IPA düzeylerinin daha düşük olduğunu göstermiştir [15]. Tip 2 diyabetin potansiyel karıştırıcı etkisini dışlamak için, devam eden KOBS çalışmasından tip 2 diyabeti olmayan 116 obez hastayı (ortalama yaş ± SD: 46,8 ± 9,3 yıl; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tablo 1) çalışma popülasyonu olarak dahil ettik [16]. Tüm katılımcılar yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve çalışma protokolü, Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak Kuzey Savo İlçe Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (54/2005, 104/2008 ve 27/2010).
Bariatrik cerrahi sırasında karaciğer biyopsi örnekleri alındı ​​ve deneyimli patologlar tarafından daha önce açıklanan kriterlere göre histolojik olarak değerlendirildi [17, 18]. Değerlendirme kriterleri Ek Tablo S1'de özetlenmiştir ve daha önce açıklanmıştır [19].
Açlık serum örnekleri, metabolomik analiz için hedeflenmemiş sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) ile analiz edildi (n = 116). Örnekler, daha önce açıklandığı gibi bir UHPLC-qTOF-MS sistemi (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Almanya) kullanılarak analiz edildi19. İzopropil alkolün (IPA) tanımlanması, tutma süresine ve MS/MS spektrumunun saf standartlarla karşılaştırılmasına dayanıyordu. IPA sinyal yoğunluğu (pik alanı) tüm sonraki analizlerde dikkate alındı ​​[20].
Tüm karaciğer RNA dizilemesi Illumina HiSeq 2500 kullanılarak gerçekleştirildi ve veriler daha önce açıklandığı gibi ön işleme tabi tutuldu [19, 21, 22]. Mitokondriyal fonksiyon/biyogenezi etkileyen transkriptlerin hedefli diferansiyel ekspresyon analizini, MitoMiner 4.0 veritabanından seçilen 1957 gen kullanarak gerçekleştirdik [23]. Karaciğer DNA metilasyon analizi, daha önce açıklandığı gibi aynı metodoloji kullanılarak Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, ABD) ile gerçekleştirildi [24, 25].
İnsan hepatik stellat hücreleri (LX-2), Prof. Stefano Romeo tarafından nazikçe temin edildi ve DMEM/F12 ortamında (Biowest, L0093-500, %1 Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, %2 FBS; Gibco, 10270-106) kültüre edildi ve muhafaza edildi. IPA'nın çalışma dozunu seçmek için, LX-2 hücreleri DMEM/F12 ortamında 24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda IPA (10 μM, 100 μM ve 1 mM; Sigma, 220027) ile muamele edildi. Ayrıca, IPA'nın HSC'leri etkisiz hale getirme yeteneğini araştırmak için, LX-2 hücreleri serumsuz ortamda 24 saat boyunca 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) ve 1 mM IPA ile birlikte muamele edildi. İlgili taşıyıcı kontroller için, TGF-β1 tedavisi için %0,1 BSA içeren 4 nM HCl ve IPA tedavisi için %0,05 DMSO kullanıldı ve kombinasyon tedavisi için her ikisi birlikte kullanıldı.
Apoptotik hücre ölümü, üreticinin talimatlarına göre FITC Annexin V Apoptotik Hücre Ölümü Tespit Kiti (Biolegend, San Diego, CA, ABD, Kat# 640922) ve 7-AAD kullanılarak değerlendirildi. Kısaca, LX-2 hücreleri (1 × 10⁵ hücre/kuyu) 12 kuyucuklu plaklarda bir gece boyunca kültüre edildi ve daha sonra birden fazla dozda IPA veya IPA ve TGF-β1 ile muamele edildi. Ertesi gün, yüzen ve yapışık hücreler toplandı, tripsinize edildi, PBS ile yıkandı, Annexin V bağlanma tamponunda süspanse edildi ve 15 dakika boyunca FITC-Annexin V ve 7-AAD ile inkübe edildi.
Canlı hücrelerdeki mitokondriler, Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) kullanılarak oksidatif aktivite açısından boyandı. MTR analizleri için, LX-2 hücreleri eşit yoğunlukta IPA ve TGF-β1 ile inkübe edildi. 24 saat sonra, canlı hücreler tripsinize edildi, PBS ile yıkandı ve daha önce açıklandığı gibi [ 26 ] 37 °C'de 20 dakika boyunca serumsuz ortamda 100 μM MTR ile inkübe edildi. Canlı hücre morfolojisi analizi için, hücre boyutu ve sitoplazmik karmaşıklık sırasıyla ileri saçılım (FSC) ve yan saçılım (SSC) parametreleri kullanılarak analiz edildi.
Tüm veriler (30.000 olay) NovoCyte Quanteon (Agilent) kullanılarak elde edildi ve NovoExpress® 1.4.1 veya FlowJo V.10 yazılımı kullanılarak analiz edildi.
Oksijen tüketim hızı (OCR) ve hücre dışı asitlenme hızı (ECAR), üreticinin talimatlarına göre Seahorse XF Hücre Mito Stress ile donatılmış bir Seahorse Hücre Dışı Akış Analizörü (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) kullanılarak gerçek zamanlı olarak ölçüldü. Kısaca, 2 × 104 LX-2 hücresi/kuyu XF96 hücre kültürü plakalarına ekildi. Gece boyunca inkübasyondan sonra hücreler izopropanol (IPA) ve TGF-β1 ile muamele edildi (Ek Yöntemler 1). Veri analizi, Seahorse XF Hücre Enerji Fenotip Test Raporu Oluşturucu'yu içeren Seahorse XF Wave yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Bundan bir Biyoenerjetik Sağlık İndeksi (BHI) hesaplandı [27].
Toplam RNA, cDNA'ya dönüştürüldü. Spesifik yöntemler için [15] referansına bakınız. İnsan 60S ribozomal asidik protein P0 (RPLP0) ve siklofilin A1 (PPIA) mRNA seviyeleri, konstitütif gen kontrolleri olarak kullanıldı. QuantStudio 6 pro Gerçek Zamanlı PCR Sistemi (Thermo Fisher, Landsmeer, Hollanda), TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kiti (Applied Biosystems) veya Sensifast SYBR Lo-ROX Kiti (Bioline, BIO 94050) ile kullanıldı ve göreceli gen ekspresyon katı, karşılaştırmalı Ct değeri döngü parametreleri (ΔΔCt) ve ∆∆Ct yöntemi kullanılarak hesaplandı. Primerlerin ayrıntıları Ek Tablolar S2 ve S3'te verilmiştir.
Nükleer DNA (ncDNA) ve mitokondriyal DNA (mtDNA), daha önce açıklandığı gibi [28] DNeasy kan ve doku kiti (Qiagen) kullanılarak ekstrakte edildi. mtDNA'nın nispi miktarı, Ek Yöntemler 2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, her bir hedef mtDNA bölgesinin üç nükleer DNA bölgesinin geometrik ortalamasına oranının (mtDNA/ncDNA) hesaplanmasıyla hesaplandı. mtDNA ve ncDNA için primerlerin ayrıntıları Ek Tablo S4'te verilmiştir.
Canlı hücreler, hücreler arası ve hücre içi mitokondriyal ağları görselleştirmek için Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) ile boyandı. LX-2 hücreleri (1 × 104 hücre/kuyu), ilgili cam tabanlı kültür plakalarında (Ibidi GmbH, Martinsried, Almanya) cam slaytlar üzerinde kültüre edildi. 24 saat sonra, canlı LX-2 hücreleri 37 °C'de 20 dakika boyunca 100 μM MTR ile inkübe edildi ve hücre çekirdekleri daha önce açıklandığı gibi DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ile boyandı [29]. Mitokondriyal ağlar, 37 °C'de nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 ile donatılmış bir Zeiss LSM 800 konfokal modülüne sahip bir Zeiss Axio Observer ters mikroskop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almanya) kullanılarak 63×NA 1.3 objektif ile görüntülendi. Her örnek tipi için on Z serisi görüntü elde ettik. Her Z serisi, her biri 9,86 μm kalınlığında 30 kesit içerir. Her örnek için, ZEN 2009 yazılımı (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Almanya) kullanılarak on farklı görüş alanının görüntüleri elde edildi ve mitokondriyal morfoloji analizi, Ek Yöntemler 3'te ayrıntılı olarak belirtilen parametrelere göre ImageJ yazılımı (v1.54d) [30, 31] kullanılarak gerçekleştirildi.
Hücreler, 0,1 M fosfat tamponunda %2 glutaraldehit ile sabitlendi, ardından %1 osmiyum tetroksit çözeltisi (Sigma Aldrich, MO, ABD) ile sabitlendi, kademeli olarak aseton (Merck, Darmstadt, Almanya) ile dehidrate edildi ve son olarak epoksi reçineye gömüldü. Ultra ince kesitler hazırlandı ve %1 uranil asetat (Merck, Darmstadt, Almanya) ve %1 kurşun sitrat (Merck, Darmstadt, Almanya) ile boyandı. Ultrastrüktürel görüntüler, 80 kV hızlandırma voltajında ​​bir JEM 2100F EXII transmisyon elektron mikroskobu (JEOL Ltd, Tokyo, Japonya) kullanılarak elde edildi.
IPA ile 24 saat süreyle işlem görmüş LX-2 hücrelerinin morfolojisi, Zeiss ters ışık mikroskobu (Zeiss Axio Vert.A1 ve AxioCam MRm, Jena, Almanya) kullanılarak 50x büyütme oranında faz kontrast mikroskopi ile analiz edildi.
Klinik veriler ortalama ± standart sapma veya medyan (çeyrekler arası aralık: IQR) olarak ifade edildi. Üç çalışma grubu arasındaki farklılıkları karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (sürekli değişkenler) veya χ² testi (kategorik değişkenler) kullanıldı. Çoklu test düzeltmesi için yanlış pozitif oranı (FDR) kullanıldı ve FDR < 0,05 olan genler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. CpG DNA metilasyonu ile IPA sinyal yoğunluğu arasındaki korelasyonu belirlemek için Spearman korelasyon analizi kullanıldı ve nominal p değerleri (p < 0,05) rapor edildi.
Dolaşımdaki serum IPA düzeyleriyle ilişkili 3093 karaciğer transkriptinden 268 transkript (nominal p < 0,01), 119 mitokondri ile ilişkili transkript (nominal p < 0,05) ve 4350 CpG için web tabanlı bir gen seti analiz aracı (WebGestalt) kullanılarak yol analizi gerçekleştirildi. Çakışan genleri bulmak için ücretsiz olarak kullanılabilen Venny DB (sürüm 2.1.0) aracı, protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için ise StringDB (sürüm 11.5) kullanıldı.
LX-2 deneyi için örneklerin normalliği D'Agostino-Pearson testi kullanılarak test edildi. Veriler en az üç biyolojik tekrardan elde edildi ve Bonferroni post hoc testi ile tek yönlü ANOVA'ya tabi tutuldu. 0,05'ten küçük bir p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur ve her şekilde deney sayısı belirtilmiştir. Tüm analizler ve grafikler, Windows için GraphPad Prism 8 istatistiksel yazılımı (GraphPad Software Inc., sürüm 8.4.3, San Diego, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.
İlk olarak, serum IPA düzeylerinin karaciğer, tüm vücut ve mitokondriyal transkriptlerle olan ilişkisini araştırdık. Toplam transkript profilinde, serum IPA düzeyleriyle en güçlü ilişkili gen MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitojenle aktive olan protein kinaz-aktive protein kinaz 3) idi; mitokondri ile ilgili transkript profilinde ise en güçlü ilişkili gen AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treonin kinaz 1) idi (Ek dosya 1 ve Ek dosya 2).
Daha sonra global transkriptleri (n = 268; p < 0,01) ve mitokondri ile ilişkili transkriptleri (n = 119; p < 0,05) analiz ettik ve sonuç olarak apoptozu en önemli kanonik yol olarak belirledik (p = 0,0089). Serum IPA seviyeleriyle ilişkili mitokondriyal transkriptler için apoptoz (FDR = 0,00001), mitofaji (FDR = 0,00029) ve TNF sinyal yollarına (FDR = 0,000006) odaklandık (Şekil 1A, Tablo 2 ve Ek Şekiller 1A-B).
İnsan karaciğerinde serum IPA düzeyleriyle ilişkili olarak global, mitokondri ile ilişkili transkriptlerin ve DNA metilasyonunun örtüşen analizi. A, serum IPA düzeyleriyle ilişkili 3092 CpG bölgesine eşlenen 268 global transkripti, 119 mitokondri ile ilişkili transkripti ve DNA metilasyonlu transkriptleri temsil eder (global transkriptler ve DNA metilasyonlu için p değerleri < 0,01 ve mitokondriyal transkriptler için p değerleri < 0,05). Başlıca örtüşen transkriptler ortada gösterilmiştir (AKT1 ve YKT6). B, çevrimiçi araç StringDB kullanılarak serum IPA düzeyleriyle anlamlı şekilde ilişkili olan 56 örtüşen genden (siyah çizgi bölgesi) diğer genlerle en yüksek etkileşim puanına (0,900) sahip 13 genin etkileşim haritası oluşturulmuştur. Yeşil: Gen Ontolojisi (GO) hücresel bileşenine eşlenen genler: mitokondri (GO:0005739). AKT1, veri tabanına (metin madenciliği, deneyler, veritabanları ve birlikte ifadeye dayalı) göre diğer proteinlerle etkileşim açısından en yüksek puana (0,900) sahip proteindir. Ağ düğümleri proteinleri, kenarlar ise proteinler arasındaki bağlantıları temsil eder.
Bağırsak mikrobiyotası metabolitleri DNA metilasyonu yoluyla epigenetik bileşimi düzenleyebildiğinden [32], serum IPA seviyelerinin karaciğer DNA metilasyonu ile ilişkili olup olmadığını araştırdık. Serum IPA seviyeleriyle ilişkili iki ana metilasyon bölgesinin prolin-serin açısından zengin bölge 3 (C19orf55) ve ısı şok proteini ailesi B (küçük) üyesi 6 (HSPB6) yakınında olduğunu bulduk (Ek dosya 3). 4350 CpG'nin DNA metilasyonu (p < 0,01) serum IPA seviyeleriyle korelasyon gösterdi ve uzun ömürlülük düzenleyici yollarda zenginleşti (p = 0,006) (Şekil 1A, Tablo 2 ve Ek Şekil 1C).
İnsan karaciğerinde serum IPA düzeyleri, global transkriptler, mitokondri ile ilişkili transkriptler ve DNA metilasyonu arasındaki ilişkilerin altında yatan biyolojik mekanizmaları anlamak için, önceki yol analizinde tanımlanan genlerin örtüşme analizini gerçekleştirdik (Şekil 1A). 56 örtüşen genin (Şekil 1A'daki siyah çizgi içinde) yol zenginleştirme analizinin sonuçları, apoptoz yolunun (p = 0,00029) üç analizde de ortak olan iki geni vurguladığını gösterdi: AKT1 ve YKT6 (YKT6 v-SNARE homologu), Venn diyagramında gösterildiği gibi (Ek Şekil 2 ve Şekil 1A). İlginç bir şekilde, AKT1 (cg19831386) ve YKT6'nın (cg24161647) serum IPA düzeyleriyle pozitif korelasyon gösterdiğini bulduk (Ek dosya 3). Gen ürünleri arasındaki potansiyel protein etkileşimlerini belirlemek için, 56 örtüşen gen arasından en yüksek ortak bölge puanına (0,900) sahip 13 geni girdi olarak seçtik ve bir etkileşim haritası oluşturduk. Güven düzeyine (marjinal güven) göre, en yüksek puana (0,900) sahip AKT1 geni en üstte yer aldı (Şekil 1B).
Yol analizine dayanarak, apoptozun ana yol olduğunu bulduk, bu nedenle IPA tedavisinin in vitro olarak HSC'lerin apoptozunu etkileyip etkilemeyeceğini araştırdık. Daha önce farklı IPA dozlarının (10 μM, 100 μM ve 1 mM) LX-2 hücreleri için toksik olmadığını göstermiştik [15]. Bu çalışma, 10 μM ve 100 μM'de IPA tedavisinin canlı ve nekrotik hücre sayısını artırdığını gösterdi. Bununla birlikte, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 1 mM IPA konsantrasyonunda hücre canlılığı azalırken, hücre nekroz oranı değişmeden kaldı (Şekil 2A, B). Daha sonra, LX-2 hücrelerinde apoptozu indüklemek için en uygun konsantrasyonu bulmak amacıyla, 24 saat boyunca 10 μM, 100 μM ve 1 mM IPA'yı test ettik (Şekil 2A-E ve Ek Şekil 3A-B). İlginç bir şekilde, IPA 10 μM ve 100 μM apoptoz oranını (%) düşürürken, IPA 1 mM kontrol grubuna kıyasla geç apoptozu ve apoptoz oranını (%) artırdı ve bu nedenle daha sonraki deneyler için seçildi (Şekil 2A–D).
IPA, LX-2 hücrelerinde apoptozu indükler. Apoptoz oranını ve hücre morfolojisini akış sitometrisi ile ölçmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyama yöntemi kullanıldı. BA hücreleri, 24 saat boyunca 10 μM, 100 μM ve 1 mM IPA ile veya serumsuz ortamda 24 saat boyunca F–H TGF-β1 (5 ng/ml) ve 1 mM IPA ile inkübe edildi. A: canlı hücreler (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotik hücreler (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: erken evre (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: geç evre (Annexin V+/7AAD.+); E, H: apoptoz oranındaki toplam erken ve geç evre apoptotik hücrelerin yüzdesi (%). Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir, n = 3 bağımsız deney. İstatistiksel karşılaştırmalar, Bonferroni post hoc testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak yapılmıştır. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Daha önce gösterdiğimiz gibi, 5 ng/ml TGF-β1, klasik belirteç genlerinin ekspresyonunu artırarak HSC aktivasyonunu indükleyebilir [15]. LX-2 hücreleri, 5 ng/ml TGF-β1 ve 1 mM IPA kombinasyonu ile tedavi edildi (Şekil 2E–H). TGF-β1 tedavisi apoptoz oranını değiştirmedi, ancak IPA eş tedavisi, TGF-β1 tedavisine kıyasla geç apoptozu ve apoptoz oranını (%) artırdı (Şekil 2E–H). Bu sonuçlar, 1 mM IPA'nın TGF-β1 indüksiyonundan bağımsız olarak LX-2 hücrelerinde apoptozu teşvik edebileceğini göstermektedir.
IPA'nın LX-2 hücrelerindeki mitokondriyal solunum üzerindeki etkisini daha ayrıntılı olarak inceledik. Sonuçlar, 1 mM IPA'nın kontrol grubuna kıyasla oksijen tüketim hızı (OCR) parametrelerini (mitokondriyal olmayan solunum, bazal ve maksimal solunum, proton kaçağı ve ATP üretimi) azalttığını (Şekil 3A, B) gösterirken, biyoenerjetik sağlık indeksi (BHI) değişmedi.
IPA, LX-2 hücrelerinde mitokondriyal solunumu azaltır. Mitokondriyal solunum eğrisi (OCR), mitokondriyal solunum parametreleri (mitokondriyal olmayan solunum, bazal solunum, maksimum solunum, proton kaçağı, ATP üretimi, SRC ve BHI) olarak sunulmuştur. A ve B hücreleri sırasıyla 24 saat boyunca 10 μM, 100 μM ve 1 mM IPA ile inkübe edildi. C ve D hücreleri ise sırasıyla 24 saat boyunca serumsuz ortamda TGF-β1 (5 ng/ml) ve 1 mM IPA ile inkübe edildi. Tüm ölçümler CyQuant kiti kullanılarak DNA içeriğine göre normalize edildi. BHI: biyoenerjetik sağlık indeksi; SRC: solunum rezerv kapasitesi; OCR: oksijen tüketim hızı. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur, n = 5 bağımsız deney. İstatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve Bonferroni post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. *p < 0,05; **p < 0,01; ve ***p < 0,001
IPA'nın TGF-β1 ile aktive edilmiş LX-2 hücrelerinin biyoeenerjetik profili üzerindeki etkisini daha kapsamlı bir şekilde anlamak için, OCR ile mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu analiz ettik (Şekil 3C,D). Sonuçlar, TGF-β1 tedavisinin kontrol grubuna kıyasla maksimum solunumu, solunum rezerv kapasitesini (SRC) ve BHI'yi azaltabileceğini gösterdi (Şekil 3C,D). Ek olarak, kombinasyon tedavisi bazal solunumu, proton kaçağını ve ATP üretimini azalttı, ancak SRC ve BHI, TGF-β1 ile tedavi edilenlere göre anlamlı derecede daha yüksekti (Şekil 3C,D).
Ayrıca Seahorse yazılımı tarafından sağlanan “Hücresel Enerji Fenotip Testi”ni de gerçekleştirdik (Ek Şekil 4A–D). Ek Şekil 3B'de gösterildiği gibi, TGF-β1 tedavisi sonrasında hem OCR hem de ECAR metabolik potansiyelleri azalmıştır; ancak kontrol grubuna kıyasla kombinasyon ve IPA tedavi gruplarında herhangi bir fark gözlenmemiştir. Dahası, kontrol grubuna kıyasla kombinasyon ve IPA tedavisi sonrasında hem bazal hem de stres OCR seviyeleri azalmıştır (Ek Şekil 4C). İlginç bir şekilde, kombinasyon tedavisiyle de benzer bir durum gözlemlenmiş olup, TGF-β1 tedavisine kıyasla bazal ve stres ECAR seviyelerinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (Ek Şekil 4C). HSC'lerde, mitokondriyal oksidatif fosforilasyondaki azalma ve kombinasyon tedavisinin TGF-β1 tedavisine maruz kaldıktan sonra SCR ve BHI'yi geri kazandırma yeteneği, metabolik potansiyeli (OCR ve ECAR) değiştirmemiştir. Bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, IPA'nın HSC'lerdeki biyoeenerjiyi azaltabileceğini ve IPA'nın HSC fenotipini inaktivasyona doğru kaydıran daha düşük bir enerji profili oluşturabileceğini göstermektedir (Ek Şekil 4D).
IPA'nın mitokondriyal dinamikler üzerindeki etkisi, mitokondriyal morfoloji ve ağ bağlantılarının üç boyutlu nicel analizi ve MTR boyaması kullanılarak araştırıldı (Şekil 4 ve Ek Şekil 5). Şekil 4, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, TGF-β1 tedavisinin ortalama yüzey alanını, dal sayısını, toplam dal uzunluğunu ve dal birleşme sayısını azalttığını (Şekil 4A ve B) ve mitokondrilerin küreselden ara morfolojiye oranını değiştirdiğini göstermektedir (Şekil 4C). Sadece IPA tedavisi, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında ortalama mitokondriyal hacmi azalttı ve mitokondrilerin küreselden ara morfolojiye oranını değiştirdi (Şekil 4A). Buna karşılık, küresellik, ortalama dal uzunluğu ve mitokondriyal membran potansiyeline bağlı MTR ile değerlendirilen mitokondriyal aktivite (Şekil 4A ve E) değişmeden kaldı ve bu parametreler gruplar arasında farklılık göstermedi. Bu sonuçlar bir arada değerlendirildiğinde, TGF-β1 ve IPA tedavisinin canlı LX-2 hücrelerinde mitokondri şeklini, boyutunu ve ağ karmaşıklığını modüle ettiğini göstermektedir.
IPA, LX-2 hücrelerinde mitokondriyal dinamikleri ve mitokondriyal DNA bolluğunu değiştirir. A. Serumsuz ortamda 24 saat boyunca TGF-β1 (5 ng/ml) ve 1 mM IPA ile inkübe edilen canlı LX-2 hücrelerinin temsili konfokal görüntüleri; Mitotracker™ Red CMXRos ile boyanmış mitokondriyal ağları ve DAPI ile maviye boyanmış çekirdekleri göstermektedir. Tüm veriler, grup başına en az 15 görüntü içermektedir. Her örnek tipi için 10 Z-yığın görüntüsü elde ettik. Her Z ekseni dizisi, her biri 9,86 μm kalınlığında 30 dilim içermektedir. Ölçek çubuğu: 10 μm. B. Görüntüye adaptif eşikleme uygulanarak tanımlanan temsili nesneler (yalnızca mitokondri). Her gruptaki tüm hücreler için mitokondriyal morfolojik ağ bağlantılarının nicel analizi ve karşılaştırması yapılmıştır. C. Mitokondriyal şekil oranlarının sıklığı. 0'a yakın değerler küresel şekilleri, 1'e yakın değerler ise filamentli şekilleri gösterir. D Mitokondriyal DNA (mtDNA) içeriği, Materyaller ve Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi belirlenmiştir. E Mitotracker™ Red CMXRos analizi, Materyaller ve Yöntemler bölümünde açıklandığı gibi akış sitometrisi (30.000 olay) ile gerçekleştirilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur, n = 3 bağımsız deney. İstatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve Bonferroni post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Daha sonra, mitokondri sayısının bir göstergesi olarak LX-2 hücrelerindeki mtDNA içeriğini analiz ettik. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, TGF-β1 ile tedavi edilen grupta mtDNA içeriği artmıştı (Şekil 4D). TGF-β1 ile tedavi edilen grupla karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavisi grubunda mtDNA içeriği azalmıştı (Şekil 4D), bu da IPA'nın mtDNA içeriğini ve muhtemelen mitokondri sayısını ve ayrıca mitokondriyal solunumu azaltabileceğini düşündürmektedir (Şekil 3C). Dahası, IPA kombinasyon tedavisinde mtDNA içeriğini azaltmış gibi görünse de, MTR aracılı mitokondriyal aktiviteyi etkilememiştir (Şekil 4A-C).
LX-2 hücrelerinde fibrozis, apoptoz, hayatta kalma ve mitokondriyal dinamiklerle ilişkili genlerin mRNA düzeyleri ile IPA arasındaki ilişkiyi araştırdık (Şekil 5A–D). Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, TGF-β1 ile tedavi edilen grupta kolajen tip I α2 zinciri (COL1A2), α-düz kas aktini (αSMA), matriks metalloproteinaz 2 (MMP2), doku metalloproteinaz inhibitörü 1 (TIMP1) ve dinamik 1 benzeri gen (DRP1) gibi genlerin ekspresyonunda artış gözlendi; bu da fibrozis ve aktivasyonda artışı göstermektedir. Ayrıca, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, TGF-β1 tedavisi nükleer pregnan X reseptörü (PXR), kaspaz 8 (CASP8), MAPKAPK3, B hücresi inhibitörü α, nükleer faktör κ geni hafif peptidi güçlendiricisi (NFκB1A) ve nükleer faktör κB kinaz alt birimi β inhibitörü (IKBKB) mRNA seviyelerini düşürmüştür (Şekil 5A–D). TGF-β1 tedavisiyle karşılaştırıldığında, TGF-β1 ve IPA ile kombinasyon tedavisi COL1A2 ve MMP2 ekspresyonunu azaltırken, PXR, TIMP1, B hücresi lenfoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β ve IKBKB mRNA seviyelerini artırmıştır. IPA tedavisi, kontrol grubuna kıyasla MMP2, Bcl-2 ile ilişkili protein X (BAX), AKT1, optik atrofi proteini 1 (OPA1) ve mitokondriyal füzyon proteini 2 (MFN2) ekspresyonunu önemli ölçüde azaltırken, CASP8, NFκB1A, NFκB1B ve IKBKB ekspresyonunu artırdı. Bununla birlikte, kaspaz-3 (CASP3), apoptotik peptidaz aktive edici faktör 1 (APAF1), mitokondriyal füzyon proteini 1 (MFN1) ve bölünme proteini 1 (FIS1) ekspresyonunda herhangi bir fark bulunmadı. Toplu olarak, bu sonuçlar IPA tedavisinin fibrozis, apoptoz, hayatta kalma ve mitokondriyal dinamiklerle ilişkili genlerin ekspresyonunu modüle ettiğini göstermektedir. Verilerimiz, IPA tedavisinin LX-2 hücrelerinde fibrozisi azalttığını; aynı zamanda fenotipi inaktivasyona doğru kaydırarak hayatta kalmayı uyardığını göstermektedir.
IPA, LX-2 hücrelerinde fibroblast, apoptotik, canlılık ve mitokondriyal dinamik genlerinin ekspresyonunu modüle eder. Histogramlar, LX-2 hücreleri serumsuz ortamda 24 saat boyunca TGF-β1 ve IPA ile indüklendikten sonra, endojen kontrole (RPLP0 veya PPIA) göre mRNA ekspresyonunu göstermektedir. A fibroblastları, B apoptotik hücreleri, C hayatta kalan hücreleri ve D mitokondriyal dinamik gen ekspresyonunu göstermektedir. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulmuştur, n = 3 bağımsız deney. İstatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve Bonferroni post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Daha sonra, hücre boyutundaki (FSC-H) ve sitoplazmik karmaşıklıktaki (SSC-H) değişiklikler akış sitometrisi ile değerlendirildi (Şekil 6A,B) ve IPA tedavisi sonrası hücre morfolojisindeki değişiklikler transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve faz kontrast mikroskobu ile değerlendirildi (Ek Şekil 6A-B). Beklendiği gibi, TGF-β1 ile tedavi edilen gruptaki hücreler kontrol grubuna kıyasla boyut olarak arttı (Şekil 6A,B), bu da hematopoetik kök hücre (HSC) aktivasyonunu gösteren pürüzlü endoplazmik retikulum (ER*) ve fagolizozomların (P) klasik genişlemesini gösterdi (Ek Şekil 6A). Bununla birlikte, TGF-β1 ile tedavi edilen grupla karşılaştırıldığında, TGF-β1 ve IPA kombinasyon tedavisi grubunda hücre boyutu, sitoplazmik karmaşıklık (Şekil 6A,B) ve ER* içeriği azaldı (Ek Şekil 6A). Ayrıca, IPA tedavisi, kontrol grubuna kıyasla hücre boyutunu, sitoplazmik karmaşıklığı (Şekil 6A,B), P ve ER* içeriğini (Ek Şekil 6A) azalttı. Ek olarak, IPA tedavisi uygulandıktan 24 saat sonra apoptotik hücre içeriği kontrol grubuna kıyasla arttı (beyaz oklar, Ek Şekil 6B). Toplu olarak, bu sonuçlar 1 mM IPA'nın HSC apoptozunu uyarabileceğini ve TGF-β1 tarafından indüklenen hücre morfolojik parametrelerindeki değişiklikleri tersine çevirerek hücre boyutunu ve karmaşıklığını düzenleyebileceğini, bunun da HSC inaktivasyonu ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.
IPA, LX-2 hücrelerinde hücre boyutunu ve sitoplazmik karmaşıklığı değiştirir. Akış sitometrisi analizinin temsili görüntüleri. Analizde LX-2 hücrelerine özgü bir gating stratejisi kullanıldı: hücre popülasyonunu tanımlamak için SSC-A/FSC-A, çiftleri belirlemek için FSC-H/FSC-A ve hücre boyutu ve karmaşıklık analizi için SSC-H/FSC-H. Hücreler, serumsuz ortamda 24 saat boyunca TGF-β1 (5 ng/ml) ve 1 mM IPA ile inkübe edildi. LX-2 hücreleri, hücre boyutu ve sitoplazmik karmaşıklık analizi için sol alt kadran (SSC-H-/FSC-H-), sol üst kadran (SSC-H+/FSC-H-), sağ alt kadran (SSC-H-/FSC-H+) ve sağ üst kadran (SSC-H+/FSC-H+) olarak dağıtıldı. B. Hücre morfolojisi, FSC-H (ileri saçılım, hücre boyutu) ve SSC-H (yan saçılım, sitoplazmik karmaşıklık) (30.000 olay) kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edildi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur, n = 3 bağımsız deney. İstatistiksel karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve Bonferroni post hoc testi kullanılarak yapılmıştır. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ve ****p < 0,0001
IPA gibi bağırsak metabolitleri, bağırsak mikrobiyotasında yeni hedeflerin keşfedilebileceğini öne sürerek, araştırmaların önemli bir konusu haline gelmiştir. Bu nedenle, insanlarda karaciğer fibrozisiyle ilişkilendirdiğimiz bir metabolit olan IPA'nın [15], hayvan modellerinde potansiyel bir anti-fibrotik bileşik olduğu gösterilmiş olması [13, 14] ilginçtir. Burada, tip 2 diyabeti (T2D) olmayan obez bireylerde serum IPA ile global karaciğer transkriptomikleri ve DNA metilasyonu arasında ilk kez bir ilişki gösteriyoruz; bu ilişki, apoptoz, mitofaji ve uzun ömürlülüğün yanı sıra karaciğer homeostazını düzenleyen olası bir aday gen olan AKT1'i vurgulamaktadır. Çalışmamızın bir diğer yeniliği ise, IPA tedavisinin LX-2 hücrelerinde apoptoz, hücre morfolojisi, mitokondriyal biyoeenerji ve dinamiklerle etkileşimini göstermemizdir; bu da HSC fenotipini inaktivasyona doğru kaydıran daha düşük bir enerji spektrumunu göstermekte ve IPA'yı karaciğer fibrozisini iyileştirmek için potansiyel bir aday haline getirmektedir.
Dolaşımdaki serum IPA ile ilişkili karaciğer genlerinde zenginleştirilmiş en önemli kanonik yolların apoptoz, mitofaji ve uzun ömürlülük olduğunu bulduk. Mitokondriyal kalite kontrol (MQC) sisteminin bozulması, mitokondriyal disfonksiyona, mitofajiye ve apoptoza yol açarak MASLD'nin oluşumunu teşvik edebilir[33, 34]. Bu nedenle, IPA'nın karaciğerde apoptoz, mitofaji ve uzun ömürlülük yoluyla hücre dinamiklerini ve mitokondriyal bütünlüğü korumada rol oynayabileceğini tahmin edebiliriz. Verilerimiz, üç deneyde de ortak olan iki gen olduğunu gösterdi: YKT6 ve AKT1. YKT6'nın hücre zarı füzyonu sürecinde yer alan bir SNARE proteini olduğunu belirtmekte fayda var. Otofagozom üzerinde STX17 ve SNAP29 ile bir başlatma kompleksi oluşturarak otofaji ve mitofajide rol oynar ve böylece otofagozomların ve lizozomların füzyonunu teşvik eder[35]. Ayrıca, YKT6 fonksiyonunun kaybı mitofajinin bozulmasına neden olur[36], YKT6'nın yukarı regülasyonu ise hepatoselüler karsinomun (HCC) ilerlemesiyle ilişkilidir ve hücre sağkalımının arttığını gösterir[37]. Öte yandan, AKT1 en önemli etkileşimli gendir ve PI3K/AKT sinyal yolu, hücre döngüsü, hücre göçü, proliferasyon, fokal adezyon, mitokondriyal fonksiyon ve kollajen salgılanması dahil olmak üzere karaciğer hastalıklarında önemli bir rol oynar[38–40]. Aktif PI3K/AKT sinyal yolu, hücre dışı matris (ECM) üretiminden sorumlu hücreler olan hematopoetik kök hücreleri (HSC) aktive edebilir ve düzensizliği karaciğer fibrozunun oluşumuna ve ilerlemesine katkıda bulunabilir[40]. Ek olarak, AKT, p53'e bağlı hücre apoptozunu inhibe eden temel hücre sağkalım faktörlerinden biridir ve AKT aktivasyonu karaciğer hücresi apoptozunun inhibisyonu ile ilişkili olabilir[41, 42]. Elde edilen sonuçlar, IPA'nın hepatositlerin apoptoza girme veya hayatta kalma kararını etkileyerek karaciğer mitokondrisiyle ilişkili apoptozda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bu etkiler, karaciğer homeostazı için kritik öneme sahip olan AKT ve/veya YKT6 aday genleri tarafından düzenlenebilir.
Sonuçlarımız, 1 mM IPA'nın TGF-β1 tedavisine bağlı olmaksızın LX-2 hücrelerinde apoptozu indüklediğini ve mitokondriyal solunumu azalttığını gösterdi. Apoptozun fibrozis çözünürlüğü ve hematopoetik kök hücre (HSC) aktivasyonu için önemli bir yol olduğu ve karaciğer fibrozisinin geri dönüşümlü fizyolojik yanıtında da önemli bir olay olduğu dikkate değerdir [4, 43]. Dahası, kombine tedaviden sonra LX-2 hücrelerinde BHI'nin geri kazanılması, IPA'nın mitokondriyal biyoeenerjinin düzenlenmesindeki potansiyel rolüne dair yeni bilgiler sağladı. Dinlenme ve inaktif koşullar altında, hematopoetik hücreler normalde ATP üretmek için mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu kullanır ve düşük metabolik aktiviteye sahiptir. Öte yandan, HSC aktivasyonu, glikolitik duruma girmenin enerji taleplerini telafi etmek için mitokondriyal solunumu ve biyosentezi artırır [44]. IPA'nın metabolik potansiyeli ve ECAR'ı etkilememesi, glikolitik yolun daha az öncelikli olduğunu düşündürmektedir. Benzer şekilde, başka bir çalışma, 1 mM IPA'nın kardiyomiyositlerde, insan hepatosit hücre hattında (Huh7) ve insan göbek kordonu damar endotel hücrelerinde (HUVEC) mitokondriyal solunum zinciri aktivitesini modüle edebildiğini göstermiştir; Bununla birlikte, kardiyomiyositlerde glikoliz üzerinde IPA'nın hiçbir etkisi bulunmamıştır, bu da IPA'nın diğer hücre tiplerinin biyoeenerjisini etkileyebileceğini düşündürmektedir [45]. Bu nedenle, 1 mM IPA'nın, mtDNA miktarını değiştirmeden fibrojenez gen ekspresyonunu, hücre morfolojisini ve mitokondriyal biyoeenerjiyi önemli ölçüde azaltabildiği için hafif bir kimyasal ayırıcı olarak hareket edebileceğini tahmin ediyoruz [46]. Mitokondriyal ayırıcılar, kültür kaynaklı fibrozisi ve HSC aktivasyonunu inhibe edebilir [47] ve ayırıcı proteinler (UCP) veya adenin nükleotid translokaz (ANT) gibi belirli proteinler tarafından düzenlenen veya indüklenen mitokondriyal ATP üretimini azaltabilir. Hücre tipine bağlı olarak, bu fenomen hücreleri apoptozdan koruyabilir ve/veya apoptozu teşvik edebilir [46]. Bununla birlikte, hematopoetik kök hücre inaktivasyonunda IPA'nın mitokondriyal ayırıcı rolünü aydınlatmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Daha sonra, mitokondriyal solunumdaki değişikliklerin canlı LX-2 hücrelerinde mitokondriyal morfolojiye yansıyıp yansımadığını araştırdık. İlginç bir şekilde, TGF-β1 tedavisi, mitokondriyal oranı küreselden ara şekle değiştirir; mitokondriyal dallanma azalır ve mitokondriyal bölünmede kilit bir faktör olan DRP1'in ekspresyonu artar [48]. Dahası, mitokondriyal parçalanma genel ağ karmaşıklığı ile ilişkilidir ve füzyondan bölünmeye geçiş, hematopoetik kök hücre (HSC) aktivasyonu için kritiktir, oysa mitokondriyal bölünmenin inhibisyonu HSC apoptozuna yol açar [49]. Bu nedenle, sonuçlarımız, TGF-β1 tedavisinin, aktif hematopoetik kök hücrelerle (HSC) ilişkili mitokondriyal bölünmede daha yaygın olan, dallanmanın azalmasıyla birlikte mitokondriyal ağ karmaşıklığında bir azalmaya neden olabileceğini göstermektedir. Ayrıca, verilerimiz IPA'nın mitokondrilerin oranını küresel şekilden ara şekle değiştirebileceğini ve böylece OPA1 ve MFN2 ekspresyonunu azaltabileceğini gösterdi. Çalışmalar, OPA1'in aşağı regülasyonunun mitokondriyal membran potansiyelinde azalmaya ve hücre apoptozunu tetiklemeye neden olabileceğini göstermiştir[50]. MFN2'nin mitokondriyal füzyon ve apoptozu düzenlediği bilinmektedir[51]. Elde edilen sonuçlar, TGF-β1 ve/veya IPA tarafından LX-2 hücrelerinin indüksiyonunun, mitokondriyal şekil ve boyutun yanı sıra aktivasyon durumu ve ağ karmaşıklığını da modüle ettiğini düşündürmektedir.
Sonuçlarımız, TGFβ-1 ve IPA'nın kombinasyon tedavisinin, apoptozdan kaçınan hücrelerde fibroz, apoptoz ve hayatta kalma ile ilgili genlerin mRNA ekspresyonunu düzenleyerek mtDNA ve hücre morfolojik parametrelerini azaltabileceğini göstermektedir. Gerçekten de, IPA, AKT1 ve COL1A2 ve MMP2 gibi önemli fibroz genlerinin mRNA ekspresyon seviyesini düşürürken, apoptoz ile ilişkili olan CASP8'in ekspresyon seviyesini artırmıştır. Sonuçlarımız, IPA tedavisinden sonra BAX ekspresyonunun azaldığını ve TIMP1 ailesi alt birimleri, BCL-2 ve NF-κB'nin mRNA ekspresyonunun arttığını göstermiştir; bu da IPA'nın apoptozdan kaçınan hematopoetik kök hücrelerde (HSC'ler) hayatta kalma sinyallerini uyarabileceğini düşündürmektedir. Bu moleküller, aktif hematopoetik kök hücrelerde pro-sağkalım sinyalleri olarak işlev görebilir ve bu durum, anti-apoptotik proteinlerin (Bcl-2 gibi) artmış ekspresyonu, pro-apoptotik BAX'ın azalmış ekspresyonu ve TIMP ile NF-κB arasında karmaşık bir etkileşimle ilişkili olabilir [5, 7]. IPA, etkilerini PXR aracılığıyla gösterir ve TGF-β1 ve IPA ile kombinasyon tedavisinin PXR mRNA ekspresyon seviyelerini artırdığını, bunun da HSC aktivasyonunun baskılanmasını gösterdiğini bulduk. Aktif PXR sinyallemesinin hem in vivo hem de in vitro olarak HSC aktivasyonunu inhibe ettiği bilinmektedir [52, 53]. Sonuçlarımız, IPA'nın apoptozu teşvik ederek, fibrozisi ve mitokondriyal metabolizmayı azaltarak ve sağkalım sinyallerini artırarak aktif HSC'lerin temizlenmesine katılabileceğini göstermektedir; bunlar, aktif HSC fenotipini inaktif bir fenotipe dönüştüren tipik süreçlerdir. IPA'nın apoptozdaki potansiyel mekanizması ve rolü için olası bir diğer açıklama, öncelikle mitofaji (içsel yol) ve dışsal TNF sinyal yolu (Tablo 1) aracılığıyla işlevsiz mitokondrileri temizlemesidir; bu yol doğrudan NF-κB hayatta kalma sinyal yoluna bağlıdır (Ek Şekil 7). İlginç bir şekilde, IPA ile ilişkili zenginleştirilmiş genler, apoptoz yolunda pro-apoptotik ve pro-hayatta kalma sinyallerini indükleyebilmektedir [54], bu da IPA'nın bu genlerle etkileşime girerek apoptoz yolunu veya hayatta kalmayı indükleyebileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, IPA'nın HSC aktivasyonu sırasında apoptozu veya hayatta kalmayı nasıl indüklediği ve mekanistik yolları hala belirsizdir.
IPA, bağırsak mikrobiyotası yoluyla diyet triptofandan oluşan mikrobiyal bir metabolittir. Çalışmalar, bağırsak ortamında anti-enflamatuar, antioksidan ve epigenetik düzenleyici özelliklere sahip olduğunu göstermiştir.[55] Çalışmalar, IPA'nın bağırsak bariyer fonksiyonunu modüle edebildiğini ve oksidatif stresi azaltabildiğini, bunun da yerel fizyolojik etkilerine katkıda bulunabileceğini göstermiştir.[56] Aslında, IPA dolaşım yoluyla hedef organlara taşınır ve IPA, triptofan, serotonin ve indol türevleriyle benzer bir ana metabolit yapısını paylaştığı için, rekabetçi metabolik kaderlere yol açan metabolik etkiler gösterir.[52] IPA, enzimler veya reseptörler üzerindeki bağlanma bölgeleri için triptofan türevi metabolitlerle rekabet edebilir ve potansiyel olarak normal metabolik yolları bozabilir. Bu, terapötik penceresini daha iyi anlamak için farmakokinetiği ve farmakodinamiği üzerine daha fazla çalışma yapılması ihtiyacını vurgulamaktadır.[57] Bunun hematopoetik kök hücrelerde (HSC'ler) de meydana gelip gelmeyeceği henüz bilinmemektedir.
Çalışmamızın bazı sınırlamaları olduğunu kabul ediyoruz. Özellikle IPA ile ilgili ilişkileri incelemek için, tip 2 diyabetes mellitus (T2DM) hastalarını çalışmadan çıkardık. Bunun, bulgularımızın tip 2 diyabetes mellitus ve ileri karaciğer hastalığı olan hastalara geniş kapsamlı uygulanabilirliğini sınırladığını kabul ediyoruz. İnsan serumundaki fizyolojik IPA konsantrasyonu 1–10 μM olmasına rağmen [11, 20], en yüksek toksik olmayan konsantrasyona [15] ve nekrotik hücre popülasyonunun yüzdesinde bir fark olmaksızın en yüksek apoptoz oranına dayanarak 1 mM IPA konsantrasyonu seçilmiştir. Bu çalışmada fizyolojik üstü IPA seviyeleri kullanılmış olsa da, şu anda IPA'nın etkili dozu konusunda bir fikir birliği bulunmamaktadır [52]. Sonuçlarımız anlamlı olsa da, IPA'nın daha geniş metabolik kaderi aktif bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. Dahası, serum IPA seviyeleri ile karaciğer transkriptlerinin DNA metilasyonu arasındaki ilişkiye dair bulgularımız sadece hematopoetik kök hücrelerden (HSC) değil, aynı zamanda karaciğer dokularından da elde edilmiştir. IPA'nın hematopoetik kök hücre (HSC) aktivasyonu ile ilişkili olduğunu gösteren transkriptom analizinden elde ettiğimiz önceki bulgularımıza dayanarak insan LX-2 hücrelerini kullanmayı tercih ettik [15] ve HSC'ler karaciğer fibrozunun ilerlemesinde rol oynayan başlıca hücrelerdir. Karaciğer birden fazla hücre tipinden oluştuğu için, IPA'nın rolünü ve diğer karaciğer hücre tipleriyle etkileşimini incelemek için kaspaz aktivasyonu ve DNA parçalanması ile birleştirilmiş hepatosit-HSC-immün hücre ortak kültür sistemi gibi diğer hücre modelleri ve protein seviyesi de dahil olmak üzere etki mekanizması dikkate alınmalıdır.