Farklı bitki savunma teorileri, bitki özelleşmiş metabolizmasının kalıplarını açıklamak için önemli teorik rehberlik sağlamaktadır, ancak temel tahminlerinin test edilmesi gerekmektedir. Burada, bireysel bitkilerden popülasyonlara ve yakından ilişkili türlere kadar tütün zayıflatılmış suşlarının metabolomunu sistematik olarak incelemek için tarafsız tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) analizini kullandık ve optimal savunma (OD) ve hareketli hedef (MT) teorilerinin temel tahminlerini test etmek için bilgi çerçevesinde bileşik spektrumlarına dayalı çok sayıda kütle spektrometrik özellik teorisini işledik. Bitki metabolomiğinin bilgi bileşeni OD teorisiyle tutarlıdır, ancak otçulların neden olduğu metabolomik dinamikler hakkındaki MT teorisinin ana tahminine aykırıdır. Mikro ölçekten makro evrimsel ölçeğe kadar, jasmonat sinyali OD'nin ana belirleyicisi olarak tanımlanırken, etilen sinyali MS/MS moleküler ağı tarafından açıklanan otçula özgü yanıtın ince ayarını sağlamıştır.
Çeşitli yapılara sahip özel metabolitler, bitkilerin çevreye adaptasyonunda, özellikle düşmanlara karşı savunmada ana katılımcılardır (1). Bitkilerde bulunan özel metabolizmanın şaşırtıcı çeşitliliği, ekolojik fonksiyonlarının birçok yönü üzerine on yıllarca süren derinlemesine araştırmaları teşvik etmiş ve bitki-böcek etkileşimlerinin evrimsel ve ekolojik gelişimini oluşturan uzun bir bitki savunma teorileri listesi oluşturmuştur. Ampirik araştırmalar önemli bir rehberlik sağlamaktadır (2). Bununla birlikte, bu bitki savunma teorileri, temel tahminlerin aynı analiz düzeyinde olduğu (3) ve teorik gelişimin bir sonraki döngüsünü ilerletmek için deneysel olarak test edildiği (4) varsayımsal tümdengelimli akıl yürütmenin normatif yolunu izlememiştir. Teknik sınırlamalar, veri toplamayı belirli metabolik kategorilerle sınırlandırmakta ve uzmanlaşmış metabolitlerin kapsamlı analizini dışlayarak, teorik gelişim için gerekli olan kategoriler arası karşılaştırmaları engellemektedir (5). Kapsamlı metabolomik verilerin ve farklı bitki grupları arasında metabolik alanın işleme iş akışını karşılaştırmak için ortak bir ölçütün eksikliği, alanın bilimsel olgunlaşmasını engellemektedir.
Tandem kütle spektrometrisi (MS/MS) metabolomik alanındaki son gelişmeler, belirli bir sistem kladının türleri içindeki ve arasındaki metabolik değişiklikleri kapsamlı bir şekilde karakterize edebilir ve bu karmaşık karışımlar arasındaki yapısal benzerliği hesaplamak için hesaplama yöntemleriyle birleştirilebilir. Kimya bilgisi gereklidir (5). Analiz ve hesaplamadaki gelişmiş teknolojilerin birleşimi, metabolik çeşitliliğin ekolojik ve evrimsel teorileri tarafından yapılan birçok tahminin uzun vadeli test edilmesi için gerekli bir çerçeve sağlar. Shannon (6), 1948'deki çığır açan makalesinde ilk kez bilgi teorisini tanıtmış ve orijinal uygulamasının dışında birçok alanda kullanılan bilginin matematiksel analizinin temelini atmıştır. Genomikte, bilgi teorisi, dizi koruyucu bilgiyi nicelleştirmek için başarıyla uygulanmıştır (7). Transkriptomik araştırmalarında, bilgi teorisi transkriptomdaki genel değişiklikleri analiz eder (8). Önceki araştırmalarımızda, bitkilerde doku düzeyindeki metabolik uzmanlığı tanımlamak için bilgi teorisinin istatistiksel çerçevesini metabolomiklere uyguladık (9). Burada, MS/MS tabanlı iş akışını, ortak para birimindeki metabolik çeşitlilikle karakterize edilen bilgi teorisinin istatistiksel çerçevesiyle birleştirerek, otçulların tetiklediği metabolomun bitki savunma teorisinin temel tahminlerini karşılaştırıyoruz.
Bitki savunmasının teorik çerçeveleri genellikle birbirini kapsar ve iki kategoriye ayrılabilir: bitkiye özgü metabolitlerin dağılımını savunma fonksiyonlarına göre açıklamaya çalışanlar, örneğin optimal savunma (OD) (10), hareketli hedef (MT) (11) ve görünüm (12) teorisi; diğerleri ise kaynak mevcudiyetindeki değişikliklerin bitki büyümesini ve karbon gibi özelleşmiş metabolitlerin birikimini nasıl etkilediğine dair mekanik açıklamalar arar: besin dengesi hipotezi (13), büyüme hızı hipotezi (14) ve büyüme ve farklılaşma dengesi hipotezi (15). İki teori kümesi farklı analiz seviyelerindedir (4). Bununla birlikte, fonksiyonel seviyede savunma fonksiyonlarını içeren iki teori, bitki yapısal ve uyarılabilir savunmaları hakkındaki tartışmaya hakimdir: OD teorisi, bitkilerin pahalı kimyasal savunmalarına yalnızca ihtiyaç duyulduğunda, örneğin bir ot hayvanı saldırdığında yatırım yaptığını varsayar; bu nedenle, gelecekteki saldırı olasılığına göre, savunma fonksiyonuna sahip bileşik atanır (10); MT hipotezi, yönlü metabolit değişiminin bir ekseninin olmadığını, ancak metabolitin rastgele değiştiğini ve böylece saldıran otçulların metabolik "hareket hedefinin" engellenmesi olasılığını yarattığını öne sürmektedir. Başka bir deyişle, bu iki teori, otçulların saldırısından sonra meydana gelen metabolik yeniden yapılanma hakkında zıt tahminlerde bulunur: savunma fonksiyonuna sahip metabolitlerin tek yönlü birikimi (OD) ile yönlendirilmemiş metabolik değişiklikler (MT) arasındaki ilişki (11).
OD ve MT hipotezleri, yalnızca metabolomda meydana gelen değişiklikleri değil, aynı zamanda bu metabolitlerin birikiminin ekolojik ve evrimsel sonuçlarını da içerir; örneğin, belirli bir ekolojik ortamda bu metabolik değişikliklerin adaptif maliyetleri ve faydaları (16). Her iki hipotez de, maliyetli olup olmamasına bakılmaksızın, özelleşmiş metabolitlerin savunma işlevini kabul etse de, OD ve MT hipotezlerini ayıran temel öngörü, meydana gelen metabolik değişikliklerin yönündedir. OD teorisinin öngörüsü bugüne kadar en fazla deneysel ilgiyi görmüştür. Bu testler, seralarda ve doğal koşullarda belirli bileşiklerin farklı dokularının doğrudan veya dolaylı savunma işlevlerinin yanı sıra bitki gelişim aşamasındaki değişikliklerin incelenmesini içerir (17-19). Bununla birlikte, şimdiye kadar, herhangi bir organizmanın metabolik çeşitliliğinin küresel kapsamlı analizi için bir iş akışı ve istatistiksel çerçeve eksikliği nedeniyle, iki teori arasındaki temel fark öngörüsü (yani, metabolik değişikliklerin yönü) test edilmeyi beklemektedir. Burada, böyle bir analiz sunuyoruz.
Bitkiye özgü metabolitlerin en önemli özelliklerinden biri, tek bitkilerden, popülasyonlardan benzer türlere kadar tüm seviyelerde aşırı yapısal çeşitlilikleridir (20). Popülasyon ölçeğinde uzmanlaşmış metabolitlerde birçok nicel değişiklik gözlemlenebilirken, tür düzeyinde genellikle güçlü nitel farklılıklar korunmaktadır (20). Bu nedenle, bitki metabolik çeşitliliği, farklı nişlere, özellikle de özel böcekler ve yaygın otçullar tarafından farklı istila olasılıklarına sahip nişlere uyum yeteneğini yansıtan fonksiyonel çeşitliliğin ana yönüdür (21). Fraenkel'in (22) bitkiye özgü metabolitlerin var olma nedenleri hakkındaki çığır açan makalesinden bu yana, çeşitli böceklerle etkileşimler önemli seçilim baskıları olarak kabul edilmiş ve bu etkileşimlerin evrim sırasında bitkileri şekillendirdiğine inanılmaktadır. Metabolik yol (23). Uzmanlaşmış metabolitlerin çeşitliliğindeki türler arası farklılıklar, iki türün genellikle birbirleriyle negatif korelasyon gösterdiği için, otçul stratejilerine karşı yapısal ve uyarılabilir bitki savunmasıyla ilişkili fizyolojik dengeyi de yansıtabilir (24). Her zaman iyi bir savunmayı sürdürmenin faydalı olabileceği düşünülse de, savunmayla ilişkili zamanında meydana gelen metabolik değişiklikler, bitkilerin değerli kaynakları diğer fizyolojik yatırımlara ayırmasına (19, 24) ve simbiyoz ihtiyacından kaçınmasına olanak tanıyarak açık faydalar sağlar. Yan hasar (25). Ayrıca, böcek otçullarının neden olduğu bu özelleşmiş metabolitlerin yeniden düzenlenmesi, popülasyonda yıkıcı bir dağılıma yol açabilir (26) ve popülasyonda korunabilen jasmonik asit (JA) sinyalindeki önemli doğal değişikliklerin doğrudan okumalarını yansıtabilir. Yüksek ve düşük JA sinyalleri, otçullara karşı savunma ile belirli türlerle rekabet arasındaki dengeyi temsil eder (27). Ek olarak, özelleşmiş metabolit biyosentez yolları evrim sırasında hızlı bir kayıp ve dönüşüme uğrayarak, yakından ilişkili türler arasında düzensiz bir metabolik dağılıma neden olur (28). Bu polimorfizmler, değişen otçul modellerine yanıt olarak hızla oluşturulabilir (29), bu da otçul topluluklarının dalgalanmasının metabolik heterojenliği yönlendiren önemli bir faktör olduğu anlamına gelir.
Burada özellikle şu sorunları çözdük: (I) Otçul böcek bitki metabolomunu nasıl yeniden yapılandırır? (II) Uzun vadeli savunma teorisinin tahminlerini test etmek için ölçülebilen metabolik esnekliğin ana bilgi bileşenleri nelerdir? (III) Bitki metabolomunun saldırgana özgü bir şekilde yeniden programlanıp programlanmadığı, eğer öyleyse, bitki hormonunun belirli bir metabolik tepkiyi şekillendirmede ne gibi bir rol oynadığı ve hangi metabolitlerin savunmanın tür özgüllüğüne katkıda bulunduğu? (IV) Birçok savunma teorisinin yaptığı tahminler tüm biyolojik doku seviyelerine genişletilebildiğinden, ortaya çıkan metabolik tepkinin tür içi karşılaştırmadan türler arası karşılaştırmaya ne kadar tutarlı olduğunu sorduk. Bu amaçla, zengin özelleşmiş metabolizmaya sahip ekolojik bir model bitki olan ve iki yerli otçulun larvalarına karşı etkili olan tütün nikotininin yaprak metabolomunu sistematik olarak inceledik: Lepidoptera Datura (Ms) (Çok agresif, esas olarak Solanaceae familyasında yetişen ve diğer cins ve ailelerden gelen bitkileri yiyen bir tür "cins" olan pamuk yaprak kurdu (Sl)). MS/MS metabolomik spektrumunu ayrıştırdık ve OD ve MT teorilerini karşılaştırmak için bilgi teorisi istatistiksel tanımlayıcılarını çıkardık. Anahtar metabolitlerin kimliğini ortaya çıkarmak için özgüllük haritaları oluşturduk. Analiz, bitki hormonu sinyallemesi ve OD indüksiyonu arasındaki kovaryansı daha ayrıntılı olarak analiz etmek için N. nasi'nin yerli popülasyonuna ve yakından ilişkili tütün türlerine genişletildi.
Otçul tütünün yaprak metabolomunun plastisitesi ve yapısı hakkında genel bir harita elde etmek için, bitki özütlerinden yüksek çözünürlüklü veri bağımsız MS/MS spektrumlarını kapsamlı bir şekilde toplamak ve ayrıştırmak için daha önce geliştirilmiş bir analiz ve hesaplama iş akışını kullandık (9). Bu farklılaştırılmamış yöntem (MS/MS olarak adlandırılır), burada açıklanan tüm bileşik düzeyindeki analizler için kullanılabilen, tekrarlamayan bileşik spektrumları oluşturabilir. Bu ayrıştırılmış bitki metabolitleri, yüzlerce ila binlerce metabolitten oluşan çeşitli tiplerdedir (burada yaklaşık 500-1000-s/MS/MS). Burada, bilgi teorisi çerçevesinde metabolik plastisiteyi ele alıyoruz ve metabolik frekans dağılımının Shannon entropisine dayanarak metabolomun çeşitliliğini ve profesyonelliğini nicelendiriyoruz. Daha önce uygulanan formülü (8) kullanarak, metabolom çeşitliliğini (Hj göstergesi), metabolik profil uzmanlaşmasını (δj göstergesi) ve tek bir metabolitin metabolik özgüllüğünü (Si göstergesi) nicelendirmek için kullanılabilecek bir dizi gösterge hesapladık. Ek olarak, otçulların metabolom uyarılabilirliğini ölçmek için Göreceli Mesafe Plastisite İndeksi (RDPI) uyguladık (Şekil 1A) (30). Bu istatistiksel çerçevede, MS/MS spektrumunu temel bilgi birimi olarak ele alıyoruz ve MS/MS'nin göreceli bolluğunu bir frekans dağılım haritasına işliyoruz ve ardından Shannon entropisini kullanarak metabolom çeşitliliğini tahmin ediyoruz. Metabolom uzmanlaşması, tek bir MS/MS spektrumunun ortalama özgüllüğü ile ölçülür. Bu nedenle, otçul indüksiyonundan sonra bazı MS/MS sınıflarının bolluğundaki artış, spektral uyarılabilirliğe, RDPI'ye ve uzmanlaşmaya, yani δj indeksindeki artışa dönüştürülür, çünkü daha özelleşmiş metabolitler üretilir ve yüksek bir Si indeksi üretilir. Hj çeşitlilik indeksinin düşmesi, ya üretilen MS/MS sayısının azaldığını ya da profil frekans dağılımının daha az tekdüze bir yönde değiştiğini, genel belirsizliğini ise azalttığını yansıtır. Si indeksi hesaplaması sayesinde, hangi MS/MS'lerin belirli otçullar tarafından uyarıldığını ve hangi MS/MS'lerin uyarılmaya yanıt vermediğini vurgulamak mümkün olup, bu da MT ve OD tahminini ayırt etmek için önemli bir göstergedir.
(A) Otçul (H1 ila Hx) MS/MS verileri için kullanılan istatistiksel tanımlayıcılar: indüklenebilirlik (RDPI), çeşitlilik (Hj indeksi), uzmanlaşma (δj indeksi) ve metabolit özgüllüğü (Si indeksi). Uzmanlaşma derecesindeki (δj) artış, ortalama olarak daha fazla otçul özgül metabolitin üretileceğini gösterirken, çeşitlilikteki (Hj) azalma, metabolit üretiminde azalmayı veya dağılım haritasında metabolitlerin düzensiz dağılımını gösterir. Si değeri, metabolitin belirli bir koşula (burada otçul) özgül olup olmadığını veya tersine aynı seviyede korunup korunmadığını değerlendirir. (B) Bilgi teorisi ekseni kullanılarak savunma teorisi tahmininin kavramsal diyagramı. OD teorisi, otçul saldırısının savunma metabolitlerini artıracağını ve böylece δj'yi artıracağını öngörür. Aynı zamanda, profil metabolik bilginin azalan belirsizliğine doğru yeniden düzenlendiği için Hj azalır. MT teorisi, otçulların saldırısının metabolomda yönsüz değişikliklere neden olacağını, böylece metabolik bilgi belirsizliğinin artmasının bir göstergesi olarak Hj'yi artıracağını ve Si'nin rastgele dağılımına yol açacağını öngörmektedir. Ayrıca, daha yüksek savunma değerlerine sahip bazı metabolitlerin özellikle artacağı (yüksek Si değeri), diğerlerinin ise rastgele tepkiler göstereceği (düşük Si değeri) karma bir model, en iyi MT'yi de önerdik.
Bilgi teorisi tanımlayıcılarını kullanarak, uyarılmamış bir yapısal durumda otçul kaynaklı özel metabolit değişikliklerinin (i) daha yüksek savunma değerine sahip belirli özel metabolit gruplarının metabolomik özgüllüğünü (δj indeksi) artıran metabolik özgüllükte (Si indeksi) bir artışa ve (ii) metabolik frekans dağılımının daha fazla leptin vücut dağılımına doğru değişmesi nedeniyle metabolom çeşitliliğinde (Hj indeksi) bir azalmaya yol açacağını öngören OD teorisini yorumluyoruz. Tek bir metabolit düzeyinde, metabolitin savunma değerine göre Si değerini artıracağı sıralı bir Si dağılımı beklenir (Şekil 1B). Bu doğrultuda, uyarılmanın (i) δj indeksinde bir azalmaya yol açan metabolitlerde yönsüz değişikliklere ve (ii) genelleştirilmiş çeşitlilik biçiminde Shannon entropisi ile ölçülebilen metabolik belirsizlik veya rastgelelikteki artış nedeniyle Hj indeksinde bir artışa yol açacağını öngören MT teorisini açıklıyoruz. Metabolik bileşime gelince, MT teorisi Si'nin rastgele dağılımını öngörecektir. Belirli metabolitlerin belirli koşullar altında, diğerlerinin ise belirli koşullar altında olmadığını ve savunma değerlerinin çevreye bağlı olduğunu dikkate alarak, δj ve Hj'nin Si boyunca her yönde ikiye dağıldığı karma bir savunma modeli de önerdik; bu modelde, yalnızca daha yüksek savunma değerlerine sahip belirli metabolit grupları Si'yi özellikle artıracak, diğerleri ise rastgele bir dağılıma sahip olacaktır (Şekil 1B).
Bilgi teorisi tanımlayıcısının ekseninde yeniden tanımlanan savunma teorisi tahminini test etmek için, Nepenthes pallens yaprakları üzerinde uzman (Ms) veya genelci (Sl) otçul larvalar yetiştirdik (Şekil 2A). MS/MS analizi kullanarak, tırtıl beslenmesinden sonra toplanan yaprak dokusunun metanol özütlerinden 599 tekrarlanmayan MS/MS spektrumu (veri dosyası S1) elde ettik. MS/MS yapılandırma dosyalarındaki bilgi içeriğinin yeniden yapılandırılmasını görselleştirmek için RDPI, Hj ve δj indekslerini kullanmak ilginç desenler ortaya koymaktadır (Şekil 2B). Genel eğilim, bilgi tanımlayıcısının tanımladığı gibi, tırtıllar yaprak yemeye devam ettikçe, tüm metabolik yeniden yapılanmanın derecesinin zamanla artmasıdır: Otçul yedikten 72 saat sonra, RDPI önemli ölçüde artmaktadır. Hasar görmemiş kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, Hj önemli ölçüde azalmıştır; bu durum, δj indeksi ile ölçülen metabolik profilin uzmanlaşma derecesindeki artıştan kaynaklanmaktadır. Bu belirgin eğilim, OD teorisinin tahminleriyle tutarlıdır, ancak metabolit seviyelerindeki rastgele (yönlendirilmemiş) değişikliklerin savunma amaçlı bir kamuflaj olarak kullanıldığına inanan MT teorisinin ana tahminleriyle tutarsızdır (Şekil 1B). Bu iki otçulun ağız salgısı (OS) uyarıcı içeriği ve beslenme davranışları farklı olmasına rağmen, doğrudan beslenmeleri, 24 saatlik ve 72 saatlik hasat dönemlerinde Hj ve δj yönlerinde benzer değişikliklere neden olmuştur. Tek fark, RDPI'nin 72. saatinde meydana gelmiştir. Ms beslenmesinin neden olduğuyla karşılaştırıldığında, Sl beslenmesinin neden olduğu genel metabolizma daha yüksek olmuştur.
(A) Deneysel tasarım: Yaygın domuz (S1) veya uzman (Ms) otçullar, ibrik bitkilerinin tuzdan arındırılmış yapraklarıyla beslenirken, simüle edilmiş otçulluk için Ms'nin OS'si (W + OSMs), standartlaştırılmış yaprak pozisyonlarının delinmesiyle oluşan yarayı işlemek için kullanılır. S1 (W + OSSl) larvaları veya su (W + W). Kontrol (C) hasar görmemiş bir yapraktır. (B) Özel metabolit haritası için hesaplanan uyarılabilirlik (kontrol grafiğiyle karşılaştırıldığında RDPI), çeşitlilik (Hj indeksi) ve uzmanlaşma (δj indeksi) indeksi (599 MS/MS; veri dosyası S1). Yıldız işaretleri, doğrudan otçul beslenmesi ile kontrol grubu arasındaki anlamlı farklılıkları gösterir (eşleştirilmiş t-testi ile Student's t-testi, *P<0,05 ve ***P<0,001). ns, önemli değil. (C) Simüle edilmiş otçulluk tedavisi sonrasında ana (mavi kutu, amino asit, organik asit ve şeker; veri dosyası S2) ve özel metabolit spektrumunun (kırmızı kutu 443 MS/MS; veri dosyası S1) zaman çözünürlüğü indeksi. Renk bandı %95 güven aralığını ifade eder. Yıldız işareti, tedavi ile kontrol arasındaki anlamlı farkı gösterir [kuadratik varyans analizi (ANOVA), ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'nin dürüstçe anlamlı farkı (HSD), *P<0,05, **P<0,01 ve *** P <0,001]. (D) Dağılım grafiklerinin ve özel metabolit profillerinin özelleştirilmesi (farklı tedavilerle tekrarlanan örnekler).
Otçul kaynaklı metabolom düzeyindeki yeniden yapılanmanın, bireysel metabolitlerin düzeyindeki değişikliklere yansıyıp yansımadığını araştırmak için, öncelikle otçul direnci kanıtlanmış Nepenthes pallens yapraklarında daha önce incelenen metabolitlere odaklandık. Fenolik amidler, böceklerin otçulluk süreci sırasında biriken ve böcek performansını düşürdüğü bilinen hidroksisinnamamid-poliamin konjugatlarıdır (32). İlgili MS/MS'nin öncüllerini aradık ve kümülatif kinetik eğrilerini çizdik (Şekil S1). Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, klorojenik asit (CGA) ve rutin gibi otçullara karşı savunmada doğrudan yer almayan fenol türevleri, otçulluktan sonra aşağı regüle edilir. Buna karşılık, otçullar fenol amidleri oldukça güçlü hale getirebilir. İki otsubun sürekli beslenmesi, fenolamidlerin neredeyse aynı uyarım spektrumuna neden oldu ve bu model, fenolamidlerin de novo sentezi için özellikle belirgindi. Aynı fenomen, çok sayıda asiklik diterpen üreten ve etkili otçul karşıtı işlevlere sahip olan 17-hidroksigeranil nonanediol diterpen glikozitleri (17-HGL-DTG'ler) yolunu araştırırken de gözlemlenecektir (33), bunlardan Ms Feeding with Sl benzer bir ifade profili tetiklemiştir (Şekil S1)).
Doğrudan otçul besleme deneylerinin olası dezavantajı, otçulların yaprak tüketim hızı ve beslenme zamanındaki farklılıktır; bu da yaralar ve otçullar tarafından oluşturulan otçula özgü etkilerin ortadan kaldırılmasını zorlaştırır. Uyarılan yaprak metabolik tepkisinin otçul tür özgüllüğünü daha iyi çözmek için, taze toplanan OS'yi (OSM ve OSS1) tutarlı yaprak pozisyonlarının standart delme W'sine hemen uygulayarak Ms ve Sl larvalarının beslenmesini simüle ettik. Bu prosedüre W + OS işlemi denir ve doku kaybının hızı veya miktarındaki farklılıkların karıştırıcı etkilerine neden olmadan, otçul tarafından ortaya çıkarılan tepkinin başlangıcını tam olarak zamanlayarak indüksiyonu standartlaştırır (Şekil 2A) (34). MS/MS analiz ve hesaplama hattını kullanarak, daha önce doğrudan besleme deneylerinden derlenen spektrumlarla örtüşen 443 MS/MS spektrumu (veri dosyası S1) elde ettik. Bu MS/MS veri setinin bilgi teorisi analizi, otçulları simüle ederek yaprağa özgü metabolomların yeniden programlanmasının OS'ye özgü uyarılar gösterdiğini ortaya koymuştur (Şekil 2C). Özellikle, OSS1 tedavisiyle karşılaştırıldığında, OSM 4 saatte metabolom uzmanlaşmasında bir artışa neden olmuştur. Doğrudan otçul besleme deney veri setiyle karşılaştırıldığında, Hj ve δj koordinatları kullanılarak iki boyutlu uzayda görselleştirilen metabolik kinetik ve simüle edilmiş otçul tedavisine yanıt olarak metabolom uzmanlaşmasının yönlülüğünün zaman içinde tutarlı bir şekilde arttığına dikkat çekmek önemlidir (Şekil 2D). Aynı zamanda, bu hedeflenen metabolom uzmanlığındaki artışın, simüle edilmiş otçullara yanıt olarak merkezi karbon metabolizmasının yeniden yapılandırılmasından kaynaklanıp kaynaklanmadığını araştırmak için amino asitlerin, organik asitlerin ve şekerlerin içeriğini ölçtük (veri dosyası S2) (Şekil S2). Bu modeli daha iyi açıklamak için, daha önce tartışılan fenolamid ve 17-HGL-DTG yollarının metabolik birikim kinetiğini de izledik. OS'ye özgü otçulların indüksiyonu, fenolamid metabolizması içinde farklı bir yeniden düzenleme modeline dönüştürülür (Şekil S3). Kumarin ve kafeoil kısımları içeren fenolik amidler, OSS1 tarafından öncelikli olarak indüklenirken, OSM'ler ferulil konjugatlarının spesifik bir indüksiyonunu tetikler. 17-HGL-DTG yolu için, aşağı akış malonilasyon ve dimalonilasyon ürünleri tarafından farklı OS indüksiyonu tespit edildi (Şekil S3).
Daha sonra, otçullarda rozet bitkisinin yapraklarını tedavi etmek için OSM'lerin kullanımını simüle eden zaman serisi mikroarray veri setini kullanarak OS kaynaklı transkriptom plastisitesini inceledik. Örnekleme kinetiği temelde bu metabolomik çalışmada kullanılan kinetikle örtüşmektedir (35). Metabolik plastisitenin zaman içinde özellikle arttığı metabolom yeniden yapılandırmasıyla karşılaştırıldığında, transkriptom indüklenebilirliği (RDPI) ve uzmanlaşmasının (δj) 1 saatte olduğu Ms tarafından indüklenen yapraklarda geçici transkripsiyon patlamaları gözlemliyoruz ve bu zaman noktasında çeşitlilik (Hj) önemli ölçüde artarken, BMP1 ifadesi önemli ölçüde azaldı ve ardından transkriptom uzmanlaşmasının gevşemesi gerçekleşti (Şekil S4). Metabolik gen aileleri (P450, glikoziltransferaz ve BAHD açiltransferaz gibi), yukarıda bahsedilen erken yüksek uzmanlaşma modelini izleyerek, birincil metabolizmadan türetilen yapısal birimlerden özel metabolitlerin bir araya getirilmesi sürecine katılır. Örnek olay incelemesi olarak fenilalanin yolu analiz edildi. Analiz, fenolamid metabolizmasındaki temel genlerin, otçullarda, otçullara maruz kalmayan bitkilere kıyasla, yüksek oranda OS tarafından indüklendiğini ve ifade kalıplarında yakından hizalandığını doğruladı. Bu yolun yukarı akışındaki transkripsiyon faktörü MYB8 ve yapısal genler PAL1, PAL2, C4H ve 4CL, transkripsiyonun erken başlatılmasını gösterdi. Fenolamidin son montajında ​​rol oynayan AT1, DH29 ve CV86 gibi açiltransferazlar, uzun süreli bir yukarı düzenleme modeli sergiledi (Şekil S4). Yukarıdaki gözlemler, transkriptom uzmanlaşmasının erken başlatılmasının ve metabolomik uzmanlaşmasının daha sonraki artışının, güçlü bir savunma tepkisini başlatan senkronize düzenleyici sistemden kaynaklanabilecek, eşlenik bir mod olduğunu göstermektedir.
Bitki hormonu sinyallemesindeki yeniden yapılandırma, otçul bilgileri entegre ederek bitkilerin fizyolojisini yeniden programlayan bir düzenleyici katman görevi görür. Otçul simülasyonundan sonra, temel bitki hormonu kategorilerinin kümülatif dinamiklerini ölçtük ve aralarındaki zamansal eş ifadeyi görselleştirdik [Pearson korelasyon katsayısı (PCC) > 0,4] (Şekil 3A). Beklendiği gibi, biyosentezle ilgili bitki hormonları, bitki hormonu eş ifade ağı içinde bağlantılıdır. Ek olarak, farklı uygulamalarla indüklenen bitki hormonlarını vurgulamak için metabolik özgüllük (Si indeksi) bu ağa eşlenmiştir. Otçullara özgü yanıtın iki ana alanı belirlenmiştir: biri, JA (biyolojik olarak aktif formu JA-Ile) ve diğer JA türevlerinin en yüksek Si skorunu gösterdiği JA kümesidir; diğeri ise etilendir (ET). Gibberellin, otçul özgüllüğünde yalnızca orta düzeyde bir artış gösterirken, sitokinin, oksin ve absisik asit gibi diğer bitki hormonları otçullar için düşük indüksiyon özgüllüğüne sahipti. Yalnızca W + W kullanımına kıyasla, OS uygulaması (W + OS) yoluyla JA türevlerinin tepe değerinin yükseltilmesi, temelde JA'ların güçlü ve spesifik bir göstergesine dönüştürülebilir. Beklenmedik bir şekilde, farklı uyarıcı içeriğine sahip OSM ve OSS1'in benzer JA ve JA-Ile birikimine neden olduğu bilinmektedir. OSS1'in aksine, OSM, OSM'ler tarafından spesifik ve güçlü bir şekilde indüklenirken, OSS1 bazal yaraların yanıtını yükseltmez (Şekil 3B).
(A) Otçul kaynaklı bitki hormonu birikim kinetiği simülasyonunun PCC hesaplamasına dayalı eş ifade ağı analizi. Düğüm, tek bir bitki hormonunu temsil eder ve düğümün boyutu, uygulamalar arasındaki bitki hormonuna özgü Si indeksini temsil eder. (B) Farklı renklerle gösterilen farklı uygulamaların neden olduğu yapraklardaki JA, JA-Ile ve ET birikimi: kayısı, W + OSM; mavi, W + OSSl; siyah, W + W; gri, C (kontrol). Yıldız işaretleri, uygulama ve kontrol arasındaki anlamlı farklılıkları gösterir (iki yönlü ANOVA ve ardından Tukey HSD post hoc çoklu karşılaştırma, *** P <0,001). (C)697 MS/MS (veri dosyası S1) JA biyosentezinde ve bozulmuş algılama spektrumunda (irAOC ve irCOI1) ve (D)585 MS/MS (veri dosyası S1) bozulmuş ET sinyali ile ETR1'de bilgi teorisi analizi. İki simüle edilmiş otçul muamelesi bitki hatlarını ve boş taşıyıcı (EV) kontrol bitkilerini tetikledi. Yıldız işaretleri, W+OS muamelesi ile hasarsız kontrol arasındaki önemli farklılıkları gösterir (iki yönlü ANOVA'yı takiben Tukey HSD post hoc çoklu karşılaştırma, *P<0,05, **P<0,01 ve ***P<0,001). (E) Uzmanlaşmaya karşı dağınık muhalefetin dağılım grafikleri. Renkler farklı genetik olarak değiştirilmiş suşları temsil eder; semboller farklı muamele yöntemlerini temsil eder: üçgen, W + OSS1; dikdörtgen, W + OSM; daire C
Daha sonra, JA ve ET biyosentezinin (irAOC ve irACO) ve algılanmasının (irCOI1 ve sETR1) temel adımlarında zayıflatılmış genetik olarak modifiye edilmiş bir Nepenthes suşu (irCOI1 ve sETR1) kullanarak, bu iki bitki hormonunun otçullar üzerindeki metabolizmasını ve yeniden programlamanın göreceli katkısını analiz ettik. Önceki deneylerle tutarlı olarak, boş taşıyıcı (EV) bitkilerde otçul-OS indüksiyonunu (Şekil 3, C ila D) ve OSM'nin neden olduğu Hj indeksinde genel bir azalmayı, δj indeksinin ise arttığını doğruladık. Tepki, OSS1 tarafından tetiklenen tepkiden daha belirgindir. Hj ve δj'yi koordinat olarak kullanan iki çizgili bir grafik, spesifik düzensizliği göstermektedir (Şekil 3E). En belirgin eğilim, JA sinyali bulunmayan suşlarda, otçulların neden olduğu metabolom çeşitliliği ve uzmanlaşma değişikliklerinin neredeyse tamamen ortadan kalkmasıdır (Şekil 3C). Buna karşılık, sETR1 bitkilerindeki sessiz ET algısı, otçul metabolizmasındaki değişiklikler üzerindeki genel etkisi JA sinyallemesinden çok daha düşük olmasına rağmen, OSM ve OSS1 uyarımları arasındaki Hj ve δj indekslerindeki farkı azaltır (Şekil 3D ve Şekil S5). Bu, JA sinyal iletiminin temel işlevine ek olarak, ET sinyal iletiminin aynı zamanda otçulların türe özgü metabolik tepkisinin ince ayarını da sağladığını göstermektedir. Bu ince ayar işleviyle tutarlı olarak, sETR1 bitkilerinde genel metabolom uyarılabilirliğinde bir değişiklik olmamıştır. Öte yandan, sETR1 bitkileriyle karşılaştırıldığında, irACO bitkileri otçulların neden olduğu metabolik değişikliklerin genel genliklerinde benzer sonuçlar vermiştir, ancak OSM ve OSS1 uyarımları arasında önemli ölçüde farklı Hj ve δj puanları göstermiştir (Şekil S5).
Otçulların türe özgü tepkilerine önemli katkıları olan özelleşmiş metabolitleri tanımlamak ve ET sinyalleri aracılığıyla üretimlerini hassas bir şekilde ayarlamak için, daha önce geliştirilen yapısal MS/MS yöntemini kullandık. Bu yöntem, MS/MS parçalarından [normalleştirilmiş nokta çarpımı (NDP)] metabolik aileyi yeniden çıkarmak için çift kümeleme yöntemine ve nötr kayıp (NL) tabanlı benzerlik puanına dayanmaktadır. ET transgenik hatlarının analiziyle oluşturulan MS/MS veri seti, 585 MS/MS üretti (veri dosyası S1) ve bunlar yedi ana MS/MS modülüne (M) kümelenerek çözümlendi (Şekil 4A). Bu modüllerin bazıları, daha önce karakterize edilmiş özel metabolitlerle yoğun bir şekilde doludur: örneğin, M1, M2, M3, M4 ve M7 çeşitli fenol türevleri (M1), flavonoid glikozitler (M2), açil şekerler (M3 ve M4) ve 17-HGL-DTG (M7) açısından zengindir. Ek olarak, her modüldeki tek bir metabolitin metabolik özgüllük bilgisi (Si indeksi) hesaplanır ve Si dağılımı sezgisel olarak görülebilir. Kısaca, yüksek otçulluk ve genotip özgüllüğü sergileyen MS/MS spektrumları yüksek Si değerleriyle karakterize edilir ve basıklık istatistikleri sağ kuyruk köşesindeki kürk dağılımını gösterir. Bu tür bir düşük kolloid dağılımı M1'de tespit edildi ve burada fenol amid en yüksek Si fraksiyonunu gösterdi (Şekil 4B). Daha önce bahsedilen M7'deki otçullukla indüklenebilir 17-HGL-DTG, orta düzeyde bir Si puanı göstererek, iki OS tipi arasında orta derecede farklı düzenleme olduğunu gösterdi. Buna karşılık, rutin, CGA ve açil şekerler gibi çoğu yapısal olarak üretilen özelleşmiş metabolitler en düşük Si puanları arasındadır. Özel metabolitler arasındaki yapısal karmaşıklığı ve Si dağılımını daha iyi incelemek için, her modül için bir moleküler ağ oluşturuldu (Şekil 4B). OD teorisinin önemli bir öngörüsü (Şekil 1B'de özetlenmiştir), otçulluktan sonra özel metabolitlerin yeniden düzenlenmesinin, özellikle özgüllüklerini artırarak (rastgele dağılımın aksine) yüksek savunma değerine sahip metabolitlerde tek yönlü değişikliklere yol açması gerektiğidir. MT teorisi tarafından öngörülen savunma metaboliti. M1'de biriken fenol türevlerinin çoğu, böcek performansının düşüşüyle ​​fonksiyonel olarak ilişkilidir (32). 24 saat sonra, indüklenen yapraklar ile EV kontrol bitkilerinin bileşen yaprakları arasındaki M1 metabolitlerindeki Si değerlerini karşılaştırdığımızda, otçul böceklerden sonra birçok metabolitin metabolik özgüllüğünün önemli bir artış eğilimi gösterdiğini gözlemledik (Şekil 4C). Si değerindeki spesifik artış sadece savunma fenolamidlerinde tespit edildi, ancak bu modülde birlikte bulunan diğer fenollerde ve bilinmeyen metabolitlerde Si değerinde bir artış tespit edilmedi. Bu, OD teorisiyle ilgili özel bir modeldir. Otçulların neden olduğu metabolik değişikliklerin ana öngörüleri tutarlıdır. Fenolamid spektrumunun bu özelliğinin OS'ye özgü ET tarafından tetiklenip tetiklenmediğini test etmek için, EV ve sETR1 genotiplerinde OSM ve OSS1 arasında diferansiyel ifade değerine neden olan metabolit Si indeksini çizdik (Şekil 4D). sETR1'de, fenamid kaynaklı OSM ve OSS1 arasındaki fark büyük ölçüde azaldı. Ayrıca, JA ile düzenlenen metabolik uzmanlaşmayla ilgili ana MS/MS modüllerini çıkarmak için yetersiz JA'ya sahip suşlarda toplanan MS/MS verilerine ikili kümeleme yöntemi uygulandı (Şekil S6).
(A) Paylaşılan fragman (NDP benzerliği) ve paylaşılan nötr kayıp (NL benzerliği) temelinde 585 MS/MS'nin kümeleme sonuçları, modülün (M) bilinen bileşik ailesiyle tutarlı olduğunu veya bilinmeyen veya zayıf metabolize edilmiş metabolit bileşimine sahip olduğunu göstermektedir. Her modülün yanında, metabolit (MS/MS) özgül (Si) dağılımı gösterilmektedir. (B) Modüler moleküler ağ: Düğümler MS/MS'yi, kenarlar ise NDP (kırmızı) ve NL (mavi) MS/MS puanlarını (kesme noktası, > 0,6) temsil eder. Modüle göre renklendirilmiş dereceli metabolit özgüllük indeksi (Si) (solda) ve moleküler ağa eşlenmiştir (sağda). (C) EV bitkisinin konstitütif (kontrol) ve indüklenmiş durumdaki (simüle edilmiş otçul) 24 saatlik M1 modülü: moleküler ağ diyagramı (Si değeri düğüm boyutudur, savunma fenolamidi mavi renkle vurgulanmıştır). (D) Bozulmuş EV ve ET algısı olan spektrum çizgisi sETR1'in M1 moleküler ağ diyagramı: yeşil daire düğümü ile temsil edilen fenolik bileşik ve Düğüm boyutu olarak W + OSM ve W + OSS1 tedavileri arasındaki anlamlı fark (P değeri). CP, N-kafeoil-tirozin; CS, N-kafeoil-spermidin; FP, N-ferulik asit ester-ürik asit; FS, N-ferulil-spermidin; CoP, N', N “-Kumarolil-tirozin; DCS, N', N”-dikafeoil-spermidin; CFS, N', N”-kafeoil, feruloil-spermidin; Lycium barbarum in wolfberry Son; Nick. O-AS, O-açil şeker.
Analizi, tek bir zayıflatılmış Nepenthes genotipinden doğal popülasyonlara kadar genişlettik; burada otçul JA seviyelerinde ve spesifik metabolit seviyelerinde daha önce doğal popülasyonlarda güçlü tür içi değişiklikler tanımlanmıştır (26). Bu veri setini 43 germplazmayı kapsayacak şekilde kullandık. Bu germplazmalar, N. pallens'ten 123 bitki türünden oluşmaktadır. Bu bitkiler, Utah, Nevada, Arizona ve Kaliforniya'daki farklı doğal habitatlardan toplanan tohumlardan alınmıştır (Şekil S7). Metabolom çeşitliliğini (burada popülasyon seviyesi β çeşitliliği olarak adlandırılır) ve OSM'nin neden olduğu uzmanlaşmayı hesapladık. Önceki çalışmalarla tutarlı olarak, Hj ve δj eksenleri boyunca geniş bir metabolik değişiklik yelpazesi gözlemledik; bu da germplazmaların otçullara karşı metabolik tepkilerinin esnekliğinde önemli farklılıklar olduğunu göstermektedir (Şekil S7). Bu organizasyon, otçulların neden olduğu JA değişikliklerinin dinamik aralığı hakkındaki önceki gözlemleri hatırlatmaktadır ve tek bir popülasyonda çok yüksek bir değer korumuştur (26, 36). JA ve JA-Ile'yi kullanarak Hj ve δj arasındaki genel düzey korelasyonunu test ettiğimizde, JA ile metabolom β çeşitliliği ve uzmanlaşma indeksi arasında anlamlı bir pozitif korelasyon olduğunu bulduk (Şekil S7). Bu, popülasyon düzeyinde tespit edilen otçul kaynaklı JA indüksiyonundaki heterojenliğin, böcek otçullarından kaynaklanan seçilimden kaynaklanan temel metabolik polimorfizmlerden kaynaklanabileceğini düşündürmektedir.
Önceki çalışmalar, tütün türlerinin, uyarılmış ve yapısal metabolik savunmalara olan bağımlılık ve tür bakımından büyük ölçüde farklılık gösterdiğini ortaya koymuştur. Otçullara karşı sinyal iletimi ve savunma yeteneklerindeki bu değişikliklerin, böcek popülasyon baskısı, bitki yaşam döngüsü ve belirli bir türün yetiştiği nişteki savunma üretim maliyetleri tarafından düzenlendiğine inanılmaktadır. Kuzey Amerika ve Güney Amerika'ya özgü altı Nicotiana türünün otçullar tarafından uyarılmış yaprak metabolom yeniden şekillenmesinin tutarlılığını inceledik. Bu türler, Nepenthes Kuzey Amerika ile yakından ilişkilidir; bunlar Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineer tütün, tütün (Nicotiana spegazzinii) ve tütün yaprağı tütünü (Nicotiana obtusifolia)'dır (Şekil 5A) (37). İyi tanımlanmış N. please türü de dahil olmak üzere bu türlerin altısı petunya kladının yıllık bitkileridir ve obtusifolia N. kardeş klad Trigonophyllae'nin çok yıllık bitkileridir (38). Daha sonra, böcek beslenmesinin tür düzeyindeki metabolik yeniden düzenlenmesini incelemek için bu yedi tür üzerinde W + W, W + OSM ve W + OSS1 indüksiyonu gerçekleştirildi.
(A) Maksimum olasılığa dayalı bir bootstrap filogenetik ağacı [nükleer glutamin sentezi için (38)] ve yedi yakın akraba Nicotiana türünün coğrafi dağılımı (farklı renkler) (37). (B) Yedi Nicotiana türünün metabolik profilleri için özelleşmiş çeşitliliğin saçılım grafiği (939 MS/MS; veri dosyası S1). Tür düzeyinde, metabolom çeşitliliği, uzmanlaşma derecesiyle negatif korelasyon göstermektedir. Metabolik çeşitlilik ve uzmanlaşma ile JA birikimi arasındaki tür düzeyindeki korelasyon analizi Şekil 2. S9'da gösterilmiştir. Renk, farklı tipler; üçgen, W + OSS1; dikdörtgen, W + OSM; (C) Nicotiana JA ve JA-Ile dinamikleri, OS uyarım genliğine göre sıralanmıştır (iki yönlü ANOVA ve Tukey HSD çoklu karşılaştırma sonrası, * P <0,05, ** P <0,01 ve * ** W + OS ve W + W karşılaştırması için, P <0,001). (D) Otçul ve metil JA (MeJA) simülasyonundan sonra her türün çeşitliliğinin ve (E) uzmanlaşmasının kutu grafiği. Yıldız işareti, W + OS ile W + W veya lanolin artı W (Lan + W) veya Lan artı MeJA (Lan + MeJa) ve Lan kontrolü arasındaki anlamlı farkı gösterir (iki yönlü varyans analizi, ardından Tukey'nin HSD post hoc çoklu karşılaştırması, *P<0,05, **P<0,01 ve ***P<0,001).
Çift kümeleme yöntemini kullanarak, 939 MS/MS'den 9 modül belirledik (veri dosyası S1). Farklı işlemlerle yeniden yapılandırılan MS/MS'lerin bileşimi, türler arasında farklı modüller arasında büyük ölçüde değişmektedir (Şekil S8). Hj'yi (burada tür düzeyinde γ-çeşitliliği olarak adlandırılır) ve δj'yi görselleştirmek, farklı türlerin metabolik alanda çok farklı gruplar halinde toplandığını ortaya koymaktadır; burada tür düzeyindeki bölünme genellikle uyarılmadan daha belirgindir. N. linear ve N. obliquus hariç, geniş bir dinamik indüksiyon etkisi aralığı sergilerler (Şekil 5B). Buna karşılık, N. purpurea ve N. obtusifolia gibi türler, işleme daha az belirgin bir metabolik yanıt verir, ancak metabolom daha çeşitlidir. İndüklenen metabolik yanıtın türe özgü dağılımı, uzmanlaşma ve gama çeşitliliği arasında önemli bir negatif korelasyonla sonuçlandı (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). OS kaynaklı JA seviyelerindeki değişiklikler, metabolom uzmanlaşmasıyla pozitif, her türün sergilediği metabolik gama çeşitliliğiyle ise negatif korelasyon göstermektedir (Şekil 5B ve Şekil S9). Şekil 5C'de "sinyal yanıtı" türleri olarak adlandırılan Nepenthes nematodları, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute ve Nepenthes attenuated gibi türlerin 30 dakika içinde önemli belirtiler gösterdiğini belirtmekte fayda var. Son zamanlarda OS'ye özgü JA ve JA-Ile salgınları gözlemlenirken, Nepenthes mills, Nepenthes powdery ve N. obtusifolia gibi "sinyale yanıt vermeyen" diğer bakteriler sadece OS özgüllüğü göstermeden JA-Ile Edge indüksiyonu göstermektedir (Şekil 5C). Metabolik düzeyde, yukarıda belirtildiği gibi, attenuated Nepenthes için sinyal yanıtı veren maddeler OS özgüllüğü göstermiş ve δj'yi önemli ölçüde artırırken Hj'yi azaltmıştır. Bu OS'ye özgü ön hazırlık etkisi, sinyale tepki vermeyen türler olarak sınıflandırılan türlerde tespit edilmemiştir (Şekil 5, D ve E). OS'ye özgü metabolitler, sinyale tepki veren türler arasında daha sık paylaşılır ve bu sinyal kümeleri, daha zayıf sinyal tepkilerine sahip türlerle kümelenirken, daha zayıf sinyal tepkilerine sahip türler daha az karşılıklı bağımlılık gösterir (Şekil S8). Bu sonuç, OS'ye özgü JA'ların indüksiyonunun ve OS'ye özgü aşağı akış metabolomunun yeniden yapılandırılmasının tür düzeyinde birbirine bağlı olduğunu göstermektedir.
Daha sonra, bu bağlanma modlarının, bitkilerin sitoplazmasında bulunan eksojen JA tarafından uygulanan JA'nın mevcudiyetiyle sınırlı olup olmadığını araştırmak için bitkilere metil JA (MeJA) içeren bir lanolin macunu uyguladık. Hızlı deesterifikasyon JA'dır. Sürekli JA tedarikinin neden olduğu sinyale duyarlı türlerden sinyale duyarsız türlere doğru kademeli değişimin aynı eğilimini bulduk (Şekil 5, D ve E). Kısacası, MeJA uygulaması, lineer nematodlar N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens ve N. mikimotoi'nin metabolomlarını güçlü bir şekilde yeniden programlayarak δj'de önemli bir artışa ve Hj'de bir azalmaya neden oldu. N. purpurea sadece δj'de bir artış gösterdi, ancak Hj'de bir artış göstermedi. Daha önce son derece düşük seviyelerde JA biriktirdiği gösterilen N. obtusifolia da metabolom yeniden yapılandırması açısından MeJA uygulamasına zayıf yanıt verdi. Bu sonuçlar, JA üretiminin veya sinyal iletiminin, sinyale duyarsız türlerde fizyolojik olarak kısıtlandığını göstermektedir. Bu hipotezi test etmek için, W + W, W + OSM'ler ve W + OSS1 Transkriptomu (39) tarafından indüklenen dört türü (N. pallens, N. mills, N. pink ve N. microphylla) inceledik. Metabolom yeniden şekillendirme modeline uygun olarak, türler transkriptom uzayında iyi bir şekilde ayrılmıştır; bunlar arasında N. attenuated en yüksek OS kaynaklı RDPI'yi gösterirken, N. gracilis en düşük değere sahipti (Şekil 6A). Bununla birlikte, N. oblonga tarafından indüklenen transkriptom çeşitliliğinin, daha önce yedi türde gösterilen N. oblonga'nın en yüksek metabolomik çeşitliliğinin aksine, dört tür arasında en düşük olduğu bulunmuştur. Önceki çalışmalar, JA sinyalleri de dahil olmak üzere erken savunma sinyalleriyle ilgili bir dizi genin, Nicotiana türlerinde otçul ile ilgili uyarıcılar tarafından indüklenen erken savunma tepkilerinin özgüllüğünü açıkladığını göstermiştir (39). Bu dört tür arasındaki JA sinyal yollarının karşılaştırılması ilginç bir örüntü ortaya çıkardı (Şekil 6B). AOC, OPR3, ACX ve COI1 gibi bu yoldaki genlerin çoğu, bu dört türde nispeten yüksek indüksiyon seviyeleri gösterdi. Bununla birlikte, JA'yı biyolojik olarak aktif formu olan JA-Ile birikmiş transkriptlerine dönüştüren kilit bir gen olan JAR4'ün transkripsiyon seviyesi, özellikle N. mills, Nepenthes pieris ve N. microphylla'da çok düşüktür. Ayrıca, N. bifidum'da sadece başka bir gen olan AOS'nin transkripti tespit edilmedi. Gen ekspresyonundaki bu değişiklikler, sinyal anergik türlerde düşük JA üretiminin neden olduğu aşırı fenotiplerden ve N. gracilis'in indüksiyonundan sorumlu olabilir.
(A) Otçulluk indüksiyonundan 30 dakika sonra örneklenen, birbirine yakın dört tütün türünün erken transkripsiyonel yanıtlarının yeniden programlanmasının bilgi teorisi analizi. RDPI, otçul OS tarafından indüklenen yaprakların yara kontrolüyle karşılaştırılmasıyla hesaplanır. Renkler farklı türleri, semboller ise farklı tedavi yöntemlerini göstermektedir. (B) Dört tür arasında JA sinyal yollarındaki gen ekspresyonunun analizi. Basitleştirilmiş JA yolu kutu grafiğinin yanında gösterilmiştir. Farklı renkler farklı işleme yöntemlerini göstermektedir. Yıldız işareti, W + OS tedavisi ile W + W kontrolü arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir (ikili farklılıklar için Student's t-testi için, *P<0,05, **P<0,01 ve ***P<0,001). OPDA, 12-okso-fitodienoik asit; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-siklopentan-1-oktanoik asit.
Son bölümde, farklı bitki türlerinin metabolomunun böcek türüne özgü yeniden şekillenmesinin otçullara karşı nasıl direnç gösterebileceğini inceledik. Önceki araştırmalar Nicotiana cinsini vurgulamıştı. Ms ve larvalara karşı dirençleri büyük ölçüde farklılık gösteriyor (40). Burada, bu model ile metabolik esneklikleri arasındaki bağlantıyı inceledik. Yukarıdaki dört tütün türünü kullanarak ve otçulların neden olduğu metabolom çeşitliliği ve uzmanlaşması ile bitkilerin Ms ve Sl'ye karşı direnci arasındaki korelasyonu test ederek, genelci Sl'ye karşı direnç, çeşitlilik ve uzmanlaşmanın hepsinin pozitif korelasyon gösterdiğini, uzman dişilere karşı direnç ile uzmanlaşma arasındaki korelasyonun zayıf olduğunu ve çeşitlilik ile korelasyonun anlamlı olmadığını bulduk (Şekil S10). S1 direncine gelince, daha önce hem JA sinyal iletim seviyeleri hem de metabolom esnekliği sergilediği gösterilen zayıflatılmış N. chinensis ve N. gracilis, otçul indüksiyonuna büyük ölçüde farklı tepkiler verdi ve ayrıca benzer yüksek direnç gösterdi.
Son altmış yılda, bitki savunma teorisi, araştırmacıların bitki özelleşmiş metabolitlerinin evrimi ve işlevleri hakkında önemli sayıda tahminde bulunduğu teorik bir çerçeve sağlamıştır. Bu teorilerin çoğu, güçlü çıkarımların normal prosedürünü izlemez (41). Aynı analiz düzeyinde temel tahminler (3) önerirler. Temel tahminlerin test edilmesi, belirli teorilerin analiz edilmesine olanak sağladığında, bu alanın ilerlemesini sağlayacaktır. Desteklenecek, diğerleri reddedilecektir (42). Bunun yerine, yeni teori farklı analiz düzeylerinde tahminlerde bulunur ve yeni bir tanımlayıcı değerlendirme katmanı ekler (42). Bununla birlikte, fonksiyonel düzeyde önerilen iki teori, MT ve OD, otçulların neden olduğu özelleşmiş metabolik değişikliklerin önemli tahminleri olarak kolayca açıklanabilir: OD teorisi, özelleşmiş metabolik "alan"daki değişikliklerin oldukça yönlü olduğuna inanır. MT teorisi ise bu değişikliklerin yönsüz ve metabolik alanda rastgele yerleşmiş olacağına ve yüksek savunma değeri taşıyan metabolitlere sahip olma eğiliminde olduğuna inanır. Önceki OD ve MT tahminleri, dar bir önsel "savunma" bileşik kümesi kullanılarak test edilmiştir. Bu metabolit merkezli testler, otçulluk sırasında metabolom yeniden yapılandırmasının kapsamını ve yörüngesini analiz etme yeteneğini engeller ve bitki metabolomundaki değişiklikleri bir bütün olarak nicelleştirmek için temel tahminleri gerektiren tutarlı bir istatistiksel çerçeve içinde test yapılmasına izin vermez. Burada, hesaplamalı MS'ye dayalı metabolomikteki yenilikçi teknolojiyi kullandık ve küresel metabolomik düzeyinde önerilen iki arasındaki ayrımı test etmek için bilgi teorisi tanımlayıcılarının genel para biriminde dekonvolüsyon MS analizi gerçekleştirdik. Bu teorinin temel tahmini. Bilgi teorisi birçok alanda, özellikle biyoçeşitlilik ve besin akışı araştırmaları bağlamında uygulanmıştır (43). Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, bu, bitkilerin metabolik bilgi alanını tanımlamak ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak geçici metabolik değişikliklerle ilgili ekolojik sorunları çözmek için kullanılan ilk uygulamadır. Özellikle bu yöntemin yeteneği, otçulların farklı türlerden evrimleşerek farklı evrim seviyelerinde türler arası makroevrimsel kalıplara nasıl evrildiğini incelemek için bitki türleri içindeki ve arasındaki kalıpları karşılaştırma yeteneğinde yatmaktadır. Metabolizma.
Ana bileşen analizi (PCA), çok değişkenli bir veri setini boyut indirgeme alanına dönüştürerek verilerin ana eğiliminin açıklanmasını sağlar; bu nedenle genellikle dekonvolüsyon metabolomu gibi veri setlerini ayrıştırmak için keşifsel bir teknik olarak kullanılır. Bununla birlikte, boyut indirgeme veri setindeki bilgi içeriğinin bir kısmını kaybettirir ve PCA, ekolojik teori için özellikle önemli olan özellikler hakkında nicel bilgi sağlayamaz; örneğin: otçullar, uzmanlaşmış alanlarda (örneğin, zenginlik, dağılım ve bolluk) metabolit çeşitliliğini nasıl yeniden yapılandırır? Hangi metabolitler, belirli bir otçulun uyarılmış durumunun tahmincisidir? Özgüllük, çeşitlilik ve uyarılabilirlik perspektifinden bakıldığında, yaprağa özgü metabolit profilinin bilgi içeriği ayrıştırılır ve otçulların yeme eyleminin belirli bir metabolizmayı aktive edebileceği bulunur. Beklenmedik bir şekilde, uygulanan bilgi teorisi göstergelerinde açıklandığı gibi, iki otçulun (gece beslenen genelci Sl ve Solanaceae uzmanı Ms.) saldırılarından sonra ortaya çıkan metabolik durumun büyük ölçüde örtüştüğünü gözlemledik. Beslenme davranışları ve konsantrasyonları önemli ölçüde farklı olmasına rağmen. OS'de yağ asidi-amino asit konjugatı (FAC) başlatıcısı (31). Standartlaştırılmış delme yaralarını tedavi etmek için otçul OS kullanılarak, simüle edilmiş otçul tedavisi de benzer bir eğilim gösterdi. Bitkilerin otçul saldırılarına verdiği tepkiyi simüle etmek için kullanılan bu standartlaştırılmış prosedür, otçulların yeme davranışındaki değişikliklerden kaynaklanan ve farklı zamanlarda farklı derecelerde hasara yol açan karıştırıcı faktörleri ortadan kaldırır (34). OSM'nin ana nedeni olduğu bilinen FAC, OSS1'de JAS ve diğer bitki hormonu tepkilerini azaltırken, OSS1 yüzlerce kat azaltır (31). Bununla birlikte, OSS1, OSM'ye kıyasla benzer seviyelerde JA birikimine neden oldu. Daha önce, zayıflatılmış Nepenthes'teki JA tepkisinin OSM'ye karşı çok hassas olduğu ve FAC'nin suyla 1:1000 oranında seyreltilse bile aktivitesini koruyabildiği gösterilmiştir (44). Bu nedenle, OSM ile karşılaştırıldığında, OSS1'deki FAC çok düşük olmasına rağmen, yeterli JA salınımını tetiklemek için yeterlidir. Önceki çalışmalar, porin benzeri proteinlerin (45) ve oligosakkaritlerin (46) OSS1'de bitki savunma tepkilerini tetiklemek için moleküler ipuçları olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, OSS1'deki bu uyarıcıların mevcut çalışmada gözlemlenen JA birikiminden sorumlu olup olmadığı hala belirsizdir.
Farklı otçulların veya ekzojen JA veya SA'nın (salisilik asit) uygulanmasının neden olduğu farklı metabolik parmak izlerini tanımlayan az sayıda çalışma olmasına rağmen (47), hiç kimse bitki-çim ağındaki otçul türüne özgü bozulmayı ve bunun spesifik metabolizma üzerindeki etkilerini sistematik olarak incelememiştir. Bu analiz, JA'lar dışındaki diğer bitki hormonlarıyla olan iç hormon ağı bağlantısının, otçulların neden olduğu metabolik yeniden yapılanmanın özgüllüğünü şekillendirdiğini daha da doğruladı. Özellikle, OSM'nin neden olduğu ET'nin OSS1'in neden olduğu ET'den önemli ölçüde daha büyük olduğunu tespit ettik. Bu durum, bir ET patlamasını tetiklemek için gerekli ve yeterli bir koşul olan OSM'deki daha fazla FAC içeriğiyle tutarlıdır (48). Bitkiler ve otçullar arasındaki etkileşim bağlamında, ET'nin bitkiye özgü metabolit dinamikleri üzerindeki sinyal işlevi hala düzensizdir ve yalnızca tek bir bileşik grubunu hedef alır. Ek olarak, çoğu çalışma, ET'nin düzenlenmesini incelemek için ET veya öncüllerinin veya çeşitli inhibitörlerinin ekzojen uygulamasını kullanmıştır; bu ekzojen kimyasal uygulamalar birçok spesifik olmayan yan etkiye neden olacaktır. Bildiğimiz kadarıyla, bu çalışma, bitki metabolom dinamiklerini koordine etmek için bozulmuş transgenik bitkilerin üretilmesi ve algılanmasında ET'nin rolünün ilk büyük ölçekli sistematik incelemesini temsil etmektedir. Otçul spesifik ET indüksiyonu, nihayetinde metabolom yanıtını modüle edebilir. En önemlisi, otçul spesifik de novo fenolamid birikimini ortaya çıkaran ET biyosentezi (ACO) ve algılama (ETR1) genlerinin transgenik manipülasyonudur. Daha önce ET'nin putresin N-metiltransferazı düzenleyerek JA kaynaklı nikotin birikimini ince ayar yapabileceği gösterilmiştir (49). Bununla birlikte, mekanik bir bakış açısından, ET'nin fenamid indüksiyonunu nasıl ince ayar yaptığı açık değildir. ET'nin sinyal iletim fonksiyonuna ek olarak, metabolik akış, poliaminofenol amidlere yapılan yatırımı düzenlemek için S-adenozil-1-metionine de yönlendirilebilir. S-adenozil-1-metiyonin, ET ve poliamin biyosentez yolunun ortak ara maddesidir. ET sinyalinin fenolamid seviyesini nasıl düzenlediği mekanizması daha fazla araştırma gerektirmektedir.
Uzun bir süre boyunca, bilinmeyen yapıya sahip çok sayıda özel metabolit nedeniyle, belirli metabolik kategorilere gösterilen yoğun ilgi, biyolojik etkileşimlerden sonra metabolik çeşitliliğin zamansal değişimlerini kesin olarak değerlendirmeyi imkansız hale getirmiştir. Şu anda, bilgi teorisi analizine dayanarak, tarafsız metabolitlere dayalı MS/MS spektrum elde etmenin ana sonucu, otçulların yeme veya otçulları taklit etme davranışının, yaprak metabolomunun genel metabolik çeşitliliğini azaltırken, özelleşme derecesini artırmaya devam etmesidir. Otçulların neden olduğu metabolom özgüllüğündeki bu geçici artış, transkriptom özgüllüğünde sinerjik bir artışla ilişkilidir. Bu daha büyük metabolom özelleşmesine en çok katkıda bulunan özellik (daha yüksek Si değerine sahip olan), daha önce karakterize edilmiş otçul işlevine sahip özel metabolittir. Bu model, OD teorisinin tahminleriyle tutarlıdır, ancak metabolom yeniden programlamasının rastgeleliğiyle ilgili MT'nin tahminleriyle tutarlı değildir. Ancak bu veriler, karma modelin (en iyi MT; Şekil 1B) tahminiyle de tutarlıdır, çünkü bilinmeyen savunma fonksiyonlarına sahip diğer karakterize edilmemiş metabolitler hala rastgele bir Si dağılımını takip edebilir.
Bu araştırmanın yakaladığı dikkate değer bir örüntü, mikroevrim düzeyinden (tek bitki ve tütün popülasyonu) daha büyük evrimsel ölçeğe (yakından ilişkili tütün türleri) kadar, farklı evrimsel organizasyon seviyelerinin "en iyi savunma"da olduğudur. Otçulların yeteneklerinde önemli farklılıklar vardır. Moore vd. (20) ve Kessler ve Kalske (1), Whittaker (50) tarafından başlangıçta ayırt edilen üç fonksiyonel biyoçeşitlilik düzeyini, kimyasal çeşitliliğin kurucu ve indüklenmiş zamansal değişimlerine dönüştürmeyi bağımsız olarak önermişlerdir; bu yazarlar, büyük ölçekli metabolom veri toplama prosedürlerini özetlememiş ve bu verilerden metabolik çeşitliliğin nasıl hesaplanacağını da belirtmemişlerdir. Bu çalışmada, Whittaker'ın fonksiyonel sınıflandırmasına yapılan küçük ayarlamalar, α-metabolik çeşitliliği belirli bir bitkideki MS/MS spektrumlarının çeşitliliği, β-metabolik çeşitliliği bir popülasyon grubunun temel tür içi metabolizması ve γ-metabolik çeşitliliği ise benzer türlerin analizinin bir uzantısı olarak ele alacaktır.
JA sinyali, çok çeşitli otçul metabolik tepkiler için gereklidir. Bununla birlikte, JA biyosentezinin tür içi düzenlenmesinin metabolom çeşitliliğine katkısının titiz bir şekilde nicel olarak test edilmesinde bir eksiklik vardır ve JA sinyalinin daha yüksek bir makroevrimsel ölçekte stres kaynaklı metabolik çeşitlenmenin genel bir yeri olup olmadığı hala belirsizdir. Nepenthes otçullarının otçul doğasının metabolom uzmanlaşmasını tetiklediğini ve Nicotiana türlerinin popülasyonu içindeki ve yakından ilişkili Nicotiana türleri arasındaki metabolom uzmanlaşmasının varyasyonunun sistematik olarak JA sinyallemesiyle pozitif korelasyon gösterdiğini gözlemledik. Ek olarak, JA sinyali bozulduğunda, tek bir genotip otçul tarafından indüklenen metabolik özgüllük ortadan kalkacaktır (Şekil 3, C ve E). Doğal olarak zayıflamış Nepenthes popülasyonlarının metabolik spektrum değişiklikleri çoğunlukla nicel olduğundan, bu analizdeki metabolik β çeşitliliğindeki ve özgüllüğündeki değişiklikler büyük ölçüde metabolit açısından zengin bileşik kategorilerinin güçlü uyarılmasından kaynaklanabilir. Bu bileşik sınıfları metabolom profilinin bir bölümüne hakimdir ve JA sinyalleriyle pozitif bir korelasyona yol açar.
Tütünle yakından ilişkili türlerin biyokimyasal mekanizmaları çok farklı olduğundan, metabolitler niteliksel açıdan özel olarak tanımlanır, bu nedenle daha analitiktir. Bilgi teorisinin yakalanan metabolik profili işlemesi, otçul uyarımının metabolik gama çeşitliliği ve uzmanlaşma arasındaki dengeyi şiddetlendirdiğini ortaya koymaktadır. JA sinyali bu dengede merkezi bir rol oynamaktadır. Metabolom uzmanlaşmasındaki artış, ana OD tahminleriyle tutarlıdır ve JA sinyaliyle pozitif korelasyon gösterirken, JA sinyali metabolik gama çeşitliliğiyle negatif korelasyon göstermektedir. Bu modeller, bitkilerin OD kapasitesinin, ister mikroevrimsel ölçekte ister daha büyük evrimsel ölçekte olsun, esas olarak JA'nın plastisitesi tarafından belirlendiğini göstermektedir. JA biyosentezindeki kusurları ortadan kaldıran ekzojen JA uygulama deneyleri, yakından ilişkili tütün türlerinin, otçullar tarafından indüklenen JA ve metabolom plastisitesi modlarına benzer şekilde, sinyale duyarlı ve sinyale duyarsız türler olarak ayırt edilebileceğini daha da ortaya koymaktadır. Sinyale yanıt vermeyen türler, endojen JA üretememeleri nedeniyle yanıt veremezler ve bu nedenle fizyolojik sınırlamalara tabidirler. Bu durum, JA sinyal yolundaki bazı kilit genlerdeki (N. crescens'te AOS ve JAR4) mutasyonlardan kaynaklanabilir. Bu sonuç, türler arası makroevrimsel kalıpların esas olarak içsel hormon algılama ve yanıt verme yeteneğindeki değişikliklerden kaynaklanabileceğini vurgulamaktadır.
Bitkiler ve otçullar arasındaki etkileşime ek olarak, metabolik çeşitliliğin incelenmesi, çevreye biyolojik adaptasyon ve karmaşık fenotipik özelliklerin evrimi araştırmalarındaki tüm önemli teorik gelişmelerle ilişkilidir. Modern MS cihazlarıyla elde edilen veri miktarındaki artışla birlikte, metabolik çeşitlilik üzerine hipotez testleri artık bireysel/kategori metabolit farklılıklarını aşarak beklenmedik kalıpları ortaya çıkarmak için küresel analizler gerçekleştirebilmektedir. Büyük ölçekli analiz sürecinde, verileri keşfetmek için kullanılabilecek anlamlı haritalar tasarlama fikri önemli bir metafor oluşturmaktadır. Bu nedenle, tarafsız MS/MS metabolomik ve bilgi teorisinin mevcut birleşiminin önemli bir sonucu, farklı taksonomik ölçeklerde metabolik çeşitliliği incelemek için haritalar oluşturmak üzere kullanılabilecek basit bir ölçüt sağlamasıdır. Bu, yöntemin temel gereksinimidir. Mikro/makro evrim ve topluluk ekolojisi çalışmaları.
Makroevrimsel düzeyde, Ehrlich ve Raven'ın (51) bitki-böcek ortak evrim teorisinin özü, türler arası metabolik çeşitliliğin varyasyonunun bitki soylarının çeşitlenmesinin nedeni olduğunu öngörmektir. Bununla birlikte, bu çığır açan çalışmanın yayınlanmasından bu yana geçen elli yılda, bu hipotez nadiren test edilmiştir (52). Bu büyük ölçüde, uzun mesafeli bitki soyları boyunca karşılaştırılabilir metabolik özelliklerin filogenetik özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Nadirlik, hedef analiz yöntemlerini sabitlemek için kullanılabilir. Bilgi teorisi tarafından işlenen mevcut MS/MS iş akışı, bilinmeyen metabolitlerin MS/MS yapısal benzerliğini (önceden metabolit seçimi yapılmadan) nicelendirir ve bu MS/MS'leri bir MS/MS kümesine dönüştürür; böylece profesyonel metabolizmada bu makroevrimsel modeller sınıflandırma ölçeğinde karşılaştırılır. Basit istatistiksel göstergeler. Süreç, önceden tahmin yapılmadan çeşitlenme veya karakter evriminin oranını nicelendirmek için dizi hizalamasını kullanabilen filogenetik analize benzer.
Biyokimyasal düzeyde, Firn ve Jones'un (53) tarama hipotezi, metabolik çeşitliliğin, daha önce ilişkisiz veya ikame edilmiş metabolitlerin biyolojik aktivitelerini gerçekleştirmek için ham maddeler sağlamak üzere farklı seviyelerde korunduğunu göstermektedir. Bilgi teorisi yöntemleri, metabolit uzmanlaşması sırasında meydana gelen bu metabolit spesifik evrimsel geçişlerin, önerilen evrimsel tarama sürecinin bir parçası olarak nicelendirilebileceği bir çerçeve sağlar: belirli bir ortamın düşük özgüllükten yüksek özgüllüğe biyolojik olarak aktif adaptasyonu, inhibe edilmiş metabolitler.
Özetle, moleküler biyolojinin ilk günlerinde önemli bitki savunma teorileri geliştirildi ve tümdengelimli hipotez odaklı yöntemler, bilimsel ilerlemenin tek yolu olarak yaygın olarak kabul edildi. Bu büyük ölçüde tüm metabolomun ölçülmesindeki teknik sınırlamalardan kaynaklanmaktadır. Hipotez odaklı yöntemler, diğer nedensel mekanizmaları seçmede özellikle yararlı olsa da, biyokimyasal ağlar hakkındaki anlayışımızı ilerletme yetenekleri, günümüzün veri yoğun biliminde mevcut olan hesaplama yöntemlerinden daha sınırlıdır. Bu nedenle, tahmin edilemeyen teoriler, mevcut verilerin kapsamının çok ötesindedir, bu nedenle araştırma alanındaki ilerlemenin varsayımsal formül/test döngüsü ortadan kaldırılamaz (4). Burada tanıtılan metabolomik hesaplama iş akışının, metabolik çeşitliliğin son (nasıl) ve nihai (neden) sorunlarına olan ilgiyi yeniden canlandırabileceğini ve teorik olarak yönlendirilen veri biliminin yeni bir çağına katkıda bulunabileceğini öngörüyoruz. Bu çağ, önceki nesillere ilham veren önemli teorileri yeniden inceledi.
Doğrudan otçul beslenme, tek bir gül çiçeği bitkisinin tek bir soluk renkli sürahi bitkisi yaprağı üzerinde ikinci evre larva veya Sl larva yetiştirilerek gerçekleştirildi; her bitki için 10 bitki tekrarı yapıldı. Böcek larvaları kıskaçlarla sıkıştırıldı ve enfeksiyondan 24 ve 72 saat sonra kalan yaprak dokusu toplandı, hızla donduruldu ve metabolitler ekstrakte edildi.
Otçul muamelesini son derece senkronize bir şekilde simüle edin. Yöntem, kumaş çelenk büyüme aşamasında bitkinin üç tam gelişmiş yaprağının orta damarının her iki tarafındaki üç sıra dikeni delmek için kumaş desen tekerlekleri kullanmak ve hemen 1:5 oranında seyreltilmiş Ms uygulamaktır. Veya eldivenli parmaklar kullanılarak delik yarasına S1 OS yerleştirilir. Yukarıda açıklandığı gibi bir yaprak hasat edilir ve işlenir. Birincil metabolitleri ve bitki hormonlarını çıkarmak için daha önce açıklanan yöntem kullanılır (54).
Eksojen JA uygulamaları için, her türün altı gül çiçeği bitkisinin her birinin üç yaprak sapına, 150 μg MeJA içeren 20 μl lanolin macunu (Lan + MeJA) ve 20 μl lanolin artı yara tedavisi (Lan + W) uygulandı veya kontrol olarak 20 μl saf lanolin kullanıldı. Yapraklar, işlemden 72 saat sonra hasat edildi, sıvı nitrojen içinde hızla donduruldu ve kullanıma kadar -80°C'de saklandı.
Araştırma grubumuzda irAOC (36), irCOI1 (55), irACO ve sETR1 (48) olmak üzere dört JA ve ET transgenik hattı tanımlanmıştır. irAOC, JA ve JA-Ile seviyelerinde güçlü bir azalma gösterirken, irCOI1 JA'lara duyarlı değildi. EV ile karşılaştırıldığında, JA-Ile birikimi arttı. Benzer şekilde, irACO, ET üretimini azaltacak ve EV ile karşılaştırıldığında, ET'ye duyarsız olan sETR1, ET üretimini artıracaktır.
Fotoakustik lazer spektrometresi (Sensor Sense ETD-300 gerçek zamanlı ET sensörü) invaziv olmayan bir şekilde ET ölçümü yapmak için kullanıldı. Tedaviden hemen sonra, yaprakların yarısı kesilerek 4 ml'lik kapalı bir cam şişeye aktarıldı ve şişenin üst kısmındaki sıvının 5 saat içinde birikmesine izin verildi. Ölçüm sırasında, her şişe, daha önce Sensor Sense tarafından sağlanan bir katalizörden geçirilerek CO2 ve suyun uzaklaştırıldığı, saatte 2 litre saf hava akımıyla 8 dakika boyunca yıkandı.
Mikroarray verileri başlangıçta (35)'te yayınlanmış ve Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) Gen İfadesi Kapsamlı Veritabanı'nda (erişim numarası GSE30287) kaydedilmiştir. Bu çalışma için W + OSM'ler tedavisine neden olan yapraklara ve hasarsız kontrole karşılık gelen veriler çıkarılmıştır. Ham yoğunluk log2'dir. İstatistiksel analizden önce, temel çizgi R yazılım paketi kullanılarak 75. yüzdelik dilimine dönüştürülmüş ve normalize edilmiştir.
Nicotiana türlerinin orijinal RNA dizileme (RNA-seq) verileri, Zhou ve ark. (39) tarafından rapor edilen ve (56)'da açıklandığı gibi ilerleyen PRJNA301787 proje numaralı NCBI Kısa Okuma Arşivlerinden (SRA) alınmıştır. Bu çalışmada analiz için Nicotiana türlerine karşılık gelen W + W, W + OSM ve W + OSS1 tarafından işlenmiş ham veriler seçilmiş ve aşağıdaki şekilde işlenmiştir: İlk olarak, ham RNA-seq okumaları FASTQ formatına dönüştürülmüştür. HISAT2, FASTQ'yu SAM'e dönüştürür ve SAMtools, SAM dosyalarını sıralanmış BAM dosyalarına dönüştürür. Gen ekspresyonunu hesaplamak için StringTie kullanılır ve ekspresyon yöntemi, bin baz parçası başına milyon sıralanmış transkripsiyon parçası başına parça sayısıdır.
Analizde kullanılan Acclaim kromatografik kolon (150 mm x 2,1 mm; partikül boyutu 2,2 μm) ve 4 mm x 4 mm koruyucu kolon aynı malzemeden oluşmaktadır. Dionex UltiMate 3000 Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (UHPLC) sisteminde aşağıdaki ikili gradyan kullanılmaktadır: 0 ila 0,5 dakika, izokratik %90 A [saf su, %0,1 (v/v) asetonitril ve %0,05 formik asit], %10 B (asetonitril ve %0,05 formik asit); 0,5 ila 23,5 dakika, gradyan fazı sırasıyla %10 A ve %90 B'dir; 23,5 ila 25 dakika, izokratik %10 A ve %90 B. Akış hızı 400 μl/dak'dır. Tüm MS analizleri için, kolon elüentini pozitif iyonizasyon modunda çalışan bir elektrosprey kaynağı ile donatılmış bir dört kutuplu ve uçuş süresi (qTOF) analiz cihazına enjekte edin (kılcal voltaj, 4500 V; kılcal çıkış 130 V; Kurutma sıcaklığı 200°C; kurutma hava akışı 10 litre/dakika).
Genel olarak saptanabilir metabolik profil hakkında yapısal bilgi elde etmek için verilerle ilgisiz veya ayırt edilemez MS/MS fragman analizi (bundan sonra MS/MS olarak anılacaktır) gerçekleştirin. Ayrım gözetmeyen MS/MS yönteminin konsepti, kuadrupolün çok geniş bir kütle izolasyon penceresine sahip olmasına dayanmaktadır [bu nedenle, tüm kütle-yük oranı (m/z) sinyallerini fragman olarak kabul edin]. Bu nedenle, Impact II cihazı bir CE eğimi oluşturamadığı için, artırılmış çarpışma kaynaklı ayrışma çarpışma enerjisi (CE) değerleri kullanılarak birkaç bağımsız analiz gerçekleştirildi. Kısaca, önce numuneyi tek kütle spektrometresi modu (kaynak içi parçalanma ile oluşturulan düşük parçalanma koşulları) kullanarak UHPLC-elektrosprey iyonizasyon/qTOF-MS ile analiz edin, 5 Hz tekrarlama frekansında m/z 50 ila 1500 arasında tarama yapın. MS/MS analizi için çarpışma gazı olarak azot kullanın ve aşağıdaki dört farklı çarpışma kaynaklı ayrışma voltajında ​​bağımsız ölçümler gerçekleştirin: 20, 30, 40 ve 50 eV. Ölçüm süreci boyunca, kuadrupol, m/z 50 ila 1500 arasında en geniş kütle izolasyon penceresine sahiptir. Ön gövde m/z ve izolasyon genişliği deneyi 200 olarak ayarlandığında, kütle aralığı cihazın işletim yazılımı tarafından otomatik olarak etkinleştirilir ve 0 Da'dır. Tek kütle modunda olduğu gibi kütle parçacıklarını tarayın. Kütle kalibrasyonu için sodyum format (50 ml izopropanol, 200 μl formik asit ve 1 ml 1M NaOH sulu çözelti) kullanın. Bruker'ın yüksek hassasiyetli kalibrasyon algoritması kullanılarak, belirli bir zaman diliminde ortalama spektrum çalıştırıldıktan sonra veri dosyası kalibre edilir. Ham veri dosyalarını NetCDF formatına dönüştürmek için Data Analysis v4.0 yazılımının (Brook Dalton, Bremen, Almanya) dışa aktarma işlevini kullanın. MS/MS veri seti, erişim numarası MTBLS1471 ile açık metabolomik veri tabanı MetaboLights'a (www.ebi.ac.uk) kaydedilmiştir.
MS/MS birleştirme işlemi, düşük ve yüksek çarpışma enerjisi için MS1 ​​ve MS/MS kalite sinyalleri arasındaki korelasyon analizi ve yeni uygulanan kurallar aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Öncülden ürüne dağılımının korelasyon analizini gerçekleştirmek için R betiği, kuralları uygulamak için ise C# betiği (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) kullanılmaktadır.
Arka plan gürültüsünden kaynaklanan yanlış pozitif hataları ve yalnızca birkaç örnekte belirli m/z özelliklerinin tespit edilmesinden kaynaklanan yanlış korelasyonu azaltmak için, R paketi XCMS'nin (arka plan gürültüsü düzeltmesi için) "doldurulmuş tepe" fonksiyonunu kullanarak "NA" (tespit edilemeyen tepe) yoğunluğunu değiştiriyoruz. Doldurulmuş tepe fonksiyonu kullanıldığında, veri setinde korelasyon hesaplamasını etkileyecek birçok "0" yoğunluk değeri hala mevcuttur. Daha sonra, doldurulmuş tepe fonksiyonu kullanıldığında ve kullanılmadığında elde edilen veri işleme sonuçlarını karşılaştırıyoruz ve ortalama düzeltilmiş tahmini değere dayanarak arka plan gürültüsü değerini hesaplıyoruz ve ardından bu 0 yoğunluk değerlerini hesaplanan arka plan değeriyle değiştiriyoruz. Ayrıca, yalnızca yoğunluğu arka plan değerinin üç katını aşan özellikleri dikkate aldık ve bunları "gerçek tepeler" olarak kabul ettik. PCC hesaplamaları için, yalnızca en az sekiz gerçek tepeye sahip örnek öncül (MS1) ve parça veri setlerinin m/z sinyalleri dikkate alınır.
Eğer tüm örnekteki öncü kalite özelliğinin yoğunluğu, düşük veya yüksek çarpışma enerjisine maruz kalan aynı kalite özelliğinin azalmış yoğunluğuyla anlamlı bir şekilde ilişkiliyse ve bu özellik CAMERA tarafından izotop tepe noktası olarak etiketlenmemişse, daha ayrıntılı olarak tanımlanabilir. Ardından, 3 saniye (tepe noktası tutunması için tahmini tutunma süresi aralığı) içinde tüm olası öncü-ürün çiftleri hesaplanarak korelasyon analizi yapılır. Yalnızca m/z değeri öncü değerinden düşük olduğunda ve MS/MS parçalanması, türetildiği öncü ile aynı örnek konumunda veri setinde meydana geldiğinde, bir parça olarak kabul edilir.
Bu iki basit kurala dayanarak, tanımlanmış öncülün m/z değerinden daha büyük m/z değerlerine sahip belirtilen parçaları ve öncülün göründüğü örnek konumuna ve belirtilen parçaya göre dışlıyoruz. Ayrıca, MS1 modunda oluşturulan birçok kaynak içi parçanın ürettiği kalite özelliklerini aday öncüller olarak seçmek ve böylece gereksiz MS/MS bileşikleri oluşturmak da mümkündür. Bu veri fazlalığını azaltmak için, spektrumların NDP benzerliği 0,6'yı aşarsa ve CAMERA tarafından açıklanan "pcgroup" kromatogramına aitlerse, bunları birleştireceğiz. Son olarak, öncül ve parçalarla ilişkili dört CE sonucunun tamamını, farklı çarpışma enerjilerinde aynı m/z değerine sahip tüm aday pikler arasında en yüksek yoğunluklu piki seçerek nihai dekonvolüsyonlu bileşik spektruma birleştiriyoruz. Sonraki işlem adımları, bileşik spektrum kavramına dayanır ve parçalanma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için gereken farklı CE koşullarını dikkate alır, çünkü bazı parçalar yalnızca belirli bir çarpışma enerjisi altında tespit edilebilir.
RDPI (30), metabolik profilin uyarılabilirliğini hesaplamak için kullanıldı. Metabolik spektrum çeşitliliği (Hj indeksi), Martínez ve ark. (8) tarafından tanımlanan aşağıdaki denklem kullanılarak MS/MS frekans dağılımının Shannon entropisi kullanılarak MS/MS öncüllerinin bolluğundan türetilir. Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) burada Pij, j-inci örnekteki i-inci MS/MS'nin göreceli frekansına karşılık gelir (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolik özgüllük (Si indeksi), incelenen örnekler arasındaki frekansa göre belirli bir MS/MS'nin ifade özdeşliği olarak tanımlanır. MS/MS özgüllüğü Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi) olarak hesaplanır.
Her bir j örneğinin metabolom spesifik δj indeksini ve MS/MS özgüllüğünün ortalamasını ölçmek için aşağıdaki formülü kullanın: δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS spektrumları çiftler halinde hizalanır ve benzerlik iki puana göre hesaplanır. İlk olarak, standart NDP (kosinüs korelasyon yöntemi olarak da bilinir) kullanılarak, spektrumlar arasındaki segment benzerliğini puanlamak için aşağıdaki denklem kullanılır: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 burada S1 ve S2 sırasıyla spektrum 1 ve spektrum 2 için, ayrıca WS1, i ve WS2 için, i, iki spektrum arasındaki i-inci ortak tepe noktasının farkının 0,01 Da'dan az olduğu tepe yoğunluğuna dayalı ağırlığı temsil eder. Ağırlık, MassBank tarafından önerildiği gibi şu şekilde hesaplanır: W = [tepe yoğunluğu] m [kalite] n, m = 0,5, n = 2.
İkinci bir puanlama yöntemi uygulandı; bu yöntem, MS/MS'ler arasında paylaşılan NL'nin analizini içeriyordu. Bu amaçla, MS parçalanma sürecinde sıklıkla karşılaşılan 52 NL listesini ve daha önce zayıflatılmış Nepenthes türlerinin ikincil metabolitlerinin MS/MS spektrumu için açıklanmış olan daha spesifik NL'yi (veri dosyası S1) birlikte kullandık (9, 26). Her MS/MS için, bazı NL'lerin mevcut ve mevcut olmamasına karşılık gelen 1 ve 0'dan oluşan ikili bir vektör oluşturun. Öklid mesafesi benzerliğine dayanarak, her bir ikili NL vektör çifti için NL benzerlik puanı hesaplanır.
Çift kümeleme yapmak için, Ağırlıklı Gen Eş İfade Analizi (WGCNA) uzantısına dayanan R paketi DiffCoEx'i kullandık. MS/MS spektrumlarının NDP ve NL puanlama matrislerini kullanarak, karşılaştırmalı korelasyon matrisini hesaplamak için DiffCoEx'i kullandık. İkili kümeleme, “cutreeDynamic” parametresini method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T ve minClusterSize = 10 olarak ayarlayarak gerçekleştirilir. DiffCoEx'in R kaynak kodu, Tesson ve diğerleri (57) tarafından ek dosya 1'den indirildi; Gerekli R WGCNA yazılım paketi https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA adresinde bulunabilir.
MS/MS moleküler ağ analizini gerçekleştirmek için, NDP ve NL benzerlik türlerine dayalı olarak eşleştirilmiş spektral bağlantıyı hesapladık ve Cytoscape yazılımını kullanarak CyFilescape yFiles düzen algoritması uzantı uygulamasındaki organik düzeni kullanarak ağ topolojisini görselleştirdik.
Veriler üzerinde istatistiksel analiz yapmak için R sürüm 3.0.1 kullanılmıştır. İstatistiksel anlamlılık, iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin dürüstçe anlamlı fark (HSD) post-hoc testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Otçul muamele ile kontrol grubu arasındaki farkı analiz etmek için, aynı varyansa sahip iki örnek grubunun iki kuyruklu dağılımı Student's t testi kullanılarak analiz edilmiştir.
Bu makaleye ait ek materyaller için lütfen şu adresi ziyaret edin: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Bu, Creative Commons Atıf-Ticari Olmayan Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir; bu lisans, son kullanımın ticari kazanç amacı taşımaması ve orijinal çalışmanın doğru olması şartıyla, herhangi bir ortamda kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin verir. Referans.
Not: Sizden yalnızca e-posta adresinizi istiyoruz, böylece sayfaya tavsiye ettiğiniz kişi e-postayı görmek istediğini ve bunun spam olmadığını anlasın. E-posta adreslerinizi hiçbir şekilde kaydetmeyeceğiz.
Bu soru, ziyaretçi olup olmadığınızı test etmek ve otomatik spam gönderimini önlemek için kullanılır.
Bilgi teorisi, özel metabolomların karşılaştırılması ve test savunma teorilerinin tahmin edilmesi için evrensel bir ölçüt sağlar.
Bilgi teorisi, özel metabolomların karşılaştırılması ve test savunma teorilerinin tahmin edilmesi için evrensel bir ölçüt sağlar.
©2021 Amerikan Bilimi İlerletme Derneği. her hakkı saklıdır. AAAS, HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ve COUNTER'ın ortağıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.