Bu makale, “Baklagillerin patojenlere ve zararlılara karşı direncini artırma” araştırma konusunun bir parçasıdır; tüm 5 makaleyi görüntüleyin.
Bitki nekrozu hastalığına neden olan Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary mantarı, farklı konukçu bitkileri enfekte etmek için çok katmanlı bir strateji kullanır. Bu çalışma, Pseudomonas sclerotiorum'un neden olduğu beyaz küfe karşı Phaseolus vulgaris L.'nin moleküler, fizyolojik ve biyokimyasal tepkilerini artırmak için alternatif bir yönetim stratejisi olarak, diğer temel amino asitlerin sentezini uyaran protein olmayan bir amino asit olan diamin L-ornitinin kullanımını önermektedir. İn vitro deneyler, L-ornitinin S. pyrenoidosa'nın misel büyümesini doza bağlı olarak önemli ölçüde inhibe ettiğini göstermiştir. Dahası, sera koşullarında beyaz küfün şiddetini önemli ölçüde azaltabilmiştir. Ayrıca, L-ornitin, işlem görmüş bitkilerin büyümesini uyararak, test edilen L-ornitin konsantrasyonlarının işlem görmüş bitkiler için fitotoksik olmadığını göstermiştir. Ek olarak, L-ornitin, enzimatik olmayan antioksidanların (toplam çözünür fenolikler ve flavonoidler) ve enzimatik antioksidanların (katalaz (CAT), peroksidaz (POX) ve polifenol oksidaz (PPO)) ekspresyonunu artırdı ve üç antioksidanla ilgili genin (PvCAT1, PvSOD ve PvGR) ekspresyonunu yükseltti. Ayrıca, in silico analiz, S. sclerotiorum genomunda, fonksiyonel analiz, korunmuş alanlar ve topoloji açısından Aspergillus fijiensis (AfOAH) ve Penicillium sp. (PlOAH) oksaloasetat asetilhidrolaz (SsOAH) proteinlerine oldukça benzeyen, varsayımsal bir oksaloasetat asetilhidrolaz (SsOAH) proteininin varlığını ortaya koydu. İlginç bir şekilde, patates dekstroz suyu (PDB) ortamına L-ornitin eklenmesi, S. sclerotiorum miselyumlarında SsOAH geninin ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı. Benzer şekilde, dışarıdan uygulanan L-ornitin, işlem görmüş bitkilerden toplanan mantar miselyumlarında SsOAH geninin ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı. Son olarak, L-ornitin uygulaması hem PDB ortamında hem de enfekte yapraklarda oksalik asit salgısını önemli ölçüde azalttı. Sonuç olarak, L-ornitin, redoks durumunu korumada ve enfekte bitkilerin savunma tepkisini artırmada önemli bir rol oynamaktadır. Bu çalışmanın sonuçları, beyaz küfü kontrol etmek ve fasulye üretimi ve diğer ürünler üzerindeki etkisini azaltmak için yenilikçi, çevre dostu yöntemler geliştirmeye yardımcı olabilir.
Nekrotrofik mantar Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary'nin neden olduğu beyaz küf, küresel fasulye (Phaseolus vulgaris L.) üretimi için ciddi bir tehdit oluşturan, verimi düşüren yıkıcı bir hastalıktır (Bolton vd., 2006). Sclerotinia sclerotiorum, 600'den fazla bitki türünü kapsayan geniş bir konakçı yelpazesine sahip olması ve konakçı dokularını spesifik olmayan bir şekilde hızla parçalayabilmesi nedeniyle, kontrol edilmesi en zor toprak kaynaklı mantar bitki patojenlerinden biridir (Liang ve Rollins, 2018). Olumsuz koşullar altında, yaşam döngüsünün kritik bir evresinden geçer ve uzun süreler boyunca toprakta 'sklerot' adı verilen siyah, sert, tohum benzeri yapılar veya enfekte bitkilerin miselyumunda veya gövde özünde beyaz, kabarık büyümeler olarak uykuda kalır (Schwartz vd., 2005). S. sclerotiorum, sklerot oluşturma yeteneğine sahiptir; bu da enfekte olmuş tarlalarda uzun süre hayatta kalmasını ve hastalık sırasında varlığını sürdürmesini sağlar (Schwartz vd., 2005). Sklerotlar besin açısından zengindir, toprakta uzun süre kalabilir ve sonraki enfeksiyonlar için birincil inokulum görevi görür (Schwartz vd., 2005). Uygun koşullar altında, sklerotlar çimlenir ve havada taşınabilen sporlar üretir; bu sporlar çiçekler, gövdeler veya baklalar dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere bitkinin toprak üstü tüm kısımlarını enfekte edebilir (Schwartz vd., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum, konuk bitkilerini enfekte etmek için çok katmanlı bir strateji kullanır; bu strateji, sklerotların çimlenmesinden semptom gelişimine kadar bir dizi koordineli olayı içerir. Başlangıçta, S. sclerotiorum, apotesyum adı verilen mantar benzeri yapılardan havada asılı sporlar (askosporlar) üretir; bunlar havaya karışır ve enfekte bitki kalıntıları üzerinde hareketsiz sklerotlara dönüşür (Bolton vd., 2006). Mantar daha sonra, bitki hücre duvarı pH'ını kontrol etmek, enzimatik bozunmayı ve doku istilasını teşvik etmek (Hegedus ve Rimmer, 2005) ve konuk bitkinin oksidatif patlamasını baskılamak için bir virülans faktörü olan oksalik asit salgılar. Bu asitleştirme süreci, bitki hücre duvarını zayıflatır ve mantar hücre duvarı bozucu enzimlerinin (CWDE'ler) normal ve verimli çalışması için uygun bir ortam sağlar; bu da patojenin fiziksel bariyeri aşmasına ve konuk dokularına nüfuz etmesine olanak tanır (Marciano vd., 1983). S. sclerotiorum, dokuya nüfuz ettikten sonra, poligalakturonaz ve selülaz gibi bir dizi hücre duvarı dehidrojenaz enzimi (CWDE) salgılar; bu enzimler, enfekte dokularda yayılmasını kolaylaştırır ve doku nekrozuna neden olur. Lezyonların ve hif tabakalarının ilerlemesi, beyaz küfün karakteristik semptomlarına yol açar (Hegedus ve Rimmer, 2005). Bu arada, konuk bitkiler, patojenle ilişkili moleküler kalıpları (PAMP'ler) kalıp tanıma reseptörleri (PRR'ler) aracılığıyla tanır ve bu da nihayetinde savunma tepkilerini harekete geçiren bir dizi sinyal olayını tetikler.
On yıllarca süren hastalık kontrol çabalarına rağmen, patojenin direnci, hayatta kalma yeteneği ve uyum sağlama becerisi nedeniyle fasulyede, diğer ticari ürünlerde olduğu gibi, yeterli dirençli genetik materyal eksikliği devam etmektedir. Bu nedenle hastalık yönetimi son derece zorludur ve kültürel uygulamalar, biyolojik kontrol ve kimyasal fungisitlerin bir kombinasyonunu içeren entegre, çok yönlü bir strateji gerektirir (O'Sullivan vd., 2021). Beyaz küfün kimyasal kontrolü en etkili yöntemdir çünkü fungisitler doğru ve doğru zamanda uygulandığında hastalığın yayılmasını etkili bir şekilde kontrol edebilir, enfeksiyonun şiddetini azaltabilir ve verim kayıplarını en aza indirebilir. Bununla birlikte, fungisitlerin aşırı kullanımı ve aşırı bağımlılığı, S. sclerotiorum'un dirençli suşlarının ortaya çıkmasına ve hedef olmayan organizmaları, toprak sağlığını ve su kalitesini olumsuz etkilemesine yol açabilir (Le Cointe vd., 2016; Ceresini vd., 2024). Bu nedenle, çevre dostu alternatifler bulmak en önemli öncelik haline gelmiştir.
Putresin, spermidin, spermin ve kadaverin gibi poliaminler (PA'lar), toprak kaynaklı bitki patojenlerine karşı umut vadeden alternatifler olarak hizmet edebilir ve böylece tehlikeli kimyasal fungisitlerin kullanımını tamamen veya kısmen azaltabilir (Nehela vd., 2024; Yi vd., 2024). Yüksek bitkilerde PA'lar, hücre bölünmesi, farklılaşma ve abiyotik ve biyotik streslere yanıt dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok fizyolojik süreçte rol oynar (Killiny ve Nehela, 2020). Antioksidan görevi görebilirler, reaktif oksijen türlerini (ROS) temizlemeye yardımcı olabilirler, redoks homeostazını koruyabilirler (Nehela ve Killiny, 2023), savunmayla ilgili genleri uyarabilirler (Romero vd., 2018), çeşitli metabolik yolları düzenleyebilirler (Nehela ve Killiny, 2023), endojen fitohormonları modüle edebilirler (Nehela ve Killiny, 2019), sistemik kazanılmış direnç (SAR) oluşturabilirler ve bitki-patojen etkileşimlerini düzenleyebilirler (Nehela ve Killiny, 2020; Asija vd., 2022; Czerwoniec, 2022). PA'ların bitki savunmasındaki spesifik mekanizmalarının ve rollerinin bitki türüne, patojenlere ve çevresel koşullara bağlı olarak değiştiğini belirtmekte fayda var. Bitkilerde en bol bulunan PA, temel poliamin L-ornitinden biyosentezlenir (Killiny ve Nehela, 2020).
L-ornitin, bitki büyümesi ve gelişmesinde çok yönlü roller oynar. Örneğin, önceki çalışmalar pirinçte (Oryza sativa) ornitinin azot geri dönüşümü (Liu vd., 2018), pirinç verimi, kalitesi ve aroması (Lu vd., 2020) ve su stresi tepkisi (Yang vd., 2000) ile ilişkili olabileceğini göstermiştir. Ayrıca, L-ornitinin dışarıdan uygulanması, şeker pancarında (Beta vulgaris) kuraklık toleransını önemli ölçüde artırmış (Hussein vd., 2019) ve soğan (Allium Cepa) (Çavuşoğlu ve Çavuşoğlu, 2021) ve kaju (Anacardium occidentale) bitkilerinde tuz stresini hafifletmiştir (da Rocha vd., 2012). L-ornitinin abiyotik stres savunmasındaki potansiyel rolü, işlenmiş bitkilerde prolin birikimine katılımından kaynaklanabilir. Örneğin, ornitin delta aminotransferaz (delta-OAT) ve prolin dehidrojenaz (ProDH1 ve ProDH2) genleri gibi prolin metabolizmasıyla ilgili genlerin, daha önce Nicotiana benthamiana ve Arabidopsis thaliana'nın konak olmayan Pseudomonas syringae suşlarına karşı savunmasında rol oynadığı bildirilmiştir (Senthil-Kumar ve Mysore, 2012). Öte yandan, mantar ornitin dekarboksilazı (ODC) patojen büyümesi için gereklidir (Singh vd., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici'nin ODC'sini konak kaynaklı gen susturma (HIGS) yoluyla hedeflemek, domates bitkilerinin Fusarium solgunluğuna karşı direncini önemli ölçüde artırmıştır (Singh vd., 2020). Bununla birlikte, fitopatojenler gibi biyotik streslere karşı eksojen ornitin uygulamasının potansiyel rolü yeterince incelenmemiştir. Daha da önemlisi, ornitinin hastalık direncine etkileri ve bununla ilişkili biyokimyasal ve fizyolojik olaylar büyük ölçüde henüz araştırılmamıştır.
Baklagillerde S. sclerotiorum enfeksiyonunun karmaşıklığını anlamak, etkili kontrol stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir. Bu çalışmada, diamin L-ornitinin, baklagil bitkilerinin Sclerotinia sclerotiorum enfeksiyonuna karşı savunma mekanizmalarını ve direncini artırmada kilit bir faktör olarak potansiyel rolünü belirlemeyi amaçladık. L-ornitinin, enfekte bitkilerin savunma tepkilerini artırmanın yanı sıra, redoks durumunu korumada da önemli bir rol oynadığını varsayıyoruz. L-ornitinin potansiyel etkilerinin, enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidan savunma mekanizmalarının düzenlenmesi ve mantar patojenitesi/virülans faktörleri ve ilişkili proteinlerle etkileşime girmesiyle ilgili olduğunu öne sürüyoruz. L-ornitinin bu çift işlevselliği, beyaz küfün etkisini azaltmak ve yaygın baklagil bitkilerinin bu güçlü mantar patojenine karşı direncini artırmak için sürdürülebilir bir strateji için umut vadeden bir aday haline getiriyor. Bu çalışmanın sonuçları, beyaz küfü kontrol etmek ve baklagil üretimindeki etkisini azaltmak için yenilikçi, çevre dostu yöntemlerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Bu çalışmada, deneysel materyal olarak, hastalığa duyarlı ticari bir fasulye çeşidi olan Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) kullanılmıştır. Sağlıklı tohumlar, Mısır Tarım Araştırma Merkezi (ARC), Tarla Bitkileri Araştırma Enstitüsü (FCRI), Baklagiller Araştırma Bölümü tarafından temin edilmiştir. Beş tohum, sera koşullarında (25 ± 2 °C, bağıl nem %75 ± 1, 8 saat ışık/16 saat karanlık) S. sclerotiorum ile enfekte olmuş toprakla doldurulmuş plastik saksılara (iç çap 35 cm, derinlik 50 cm) ekilmiştir. Ekimden 7-10 gün sonra (DPS), her saksıda yalnızca iki adet düzgün büyüme gösteren ve üç adet tam gelişmiş yaprağı olan fideler kalacak şekilde seyreltme yapılmıştır. Tüm saksı bitkileri iki haftada bir sulanmış ve verilen çeşit için önerilen oranda aylık olarak gübrelenmiştir.
500 mg/L konsantrasyonunda L-ornitindiamin (aynı zamanda (+)-(S)-2,5-diaminopentanoik asit olarak da bilinir; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) hazırlamak için, önce 50 mg steril damıtılmış suda 100 mL'de çözüldü. Stok çözelti daha sonra seyreltildi ve sonraki deneylerde kullanıldı. Kısaca, altı seri L-ornitin konsantrasyonu (12,5, 25, 50, 75, 100 ve 125 mg/L) in vitro olarak test edildi. Ek olarak, negatif kontrol (Mock) olarak steril damıtılmış su ve pozitif kontrol olarak ticari fungisit "Rizolex-T" %50 ıslatılabilir toz (toklofos-metil %20 + tiram %30; KZ-Kafr El Zayat Pestisit ve Kimyasal Şirketi, Kafr El Zayat, Gharbia Valiliği, Mısır) kullanıldı. Ticari fungisit "Rizolex-T", beş farklı konsantrasyonda (2, 4, 6, 8 ve 10 mg/L) in vitro olarak test edildi.
Tipik beyaz küf belirtileri gösteren (enfeksiyon oranı: %10-30) fasulye sapı ve kabuk örnekleri ticari çiftliklerden toplandı. Enfekte bitki materyallerinin çoğu tür/çeşit (duyarlı ticari çeşit Giza 3) olarak tanımlanmış olsa da, özellikle yerel pazarlardan elde edilenler olmak üzere diğerleri bilinmeyen türdeydi. Toplanan enfekte materyaller önce 3 dakika boyunca %0,5 sodyum hipoklorit çözeltisi ile yüzey dezenfeksiyonuna tabi tutuldu, ardından steril damıtılmış su ile birkaç kez durulandı ve fazla suyu uzaklaştırmak için steril filtre kağıdı ile kurutuldu. Enfekte organlar daha sonra orta dokudan (sağlıklı ve enfekte dokular arasında) küçük parçalara ayrıldı, patates dekstroz agar (PDA) ortamında kültüre edildi ve sklerot oluşumunu uyarmak için 5 gün boyunca 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüsü ile 25 ± 2 °C'de inkübe edildi. Karışık veya kontamine kültürlerden mantar izolatlarını saflaştırmak için misel ucu yöntemi de kullanıldı. Saflaştırılmış mantar izolatı ilk olarak kültürel morfolojik özelliklerine göre tanımlandı ve daha sonra mikroskobik özelliklerine dayanarak S. sclerotiorum olduğu doğrulandı. Son olarak, tüm saflaştırılmış izolatlar, Koch'un postülatlarını karşılamak için duyarlı Giza 3 fasulye çeşidi üzerinde patojenite açısından test edildi.
Ek olarak, en istilacı S. sclerotiorum izolatı (izolat #3), White vd., 1990; Baturo-Ciesniewska vd., 2017 tarafından açıklandığı gibi, iç transkripsiyonel aralık (ITS) dizilemesi temelinde daha da doğrulandı. Kısaca, izolatlar patates dekstroz suyu (PDB) içinde kültüre edildi ve 25 ± 2 °C'de 5-7 gün inkübe edildi. Daha sonra mantar miseli toplandı, tülbentten süzüldü, steril su ile iki kez yıkandı ve steril filtre kağıdı ile kurutuldu. Genomik DNA, Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah vd., 2022, 2024) kullanılarak izole edildi. Daha sonra ITS rDNA bölgesi, spesifik primer çifti ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; beklenen boyut: 540 bp) kullanılarak çoğaltıldı (Baturo-Ciesniewska vd., 2017). Saflaştırılmış PCR ürünleri dizileme için gönderildi (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA dizileri, Sanger dizileme yöntemi kullanılarak çift yönlü olarak dizilendi. Birleştirilen sorgu dizileri daha sonra BLASTn yazılımı kullanılarak GenBank ve Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'ndeki (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) en son verilerle karşılaştırıldı. Sorgu dizisi, Moleküler Evrimsel Genetik Analiz Paketi'ndeki (MEGA-11; sürüm 11) ClustalW kullanılarak NCBI GenBank'taki en son verilerden elde edilen 20 diğer S. sclerotiorum suşu/izolatı ile karşılaştırıldı (Ek Tablo S1) (Kumar vd., 2024). Evrimsel analiz, maksimum olasılık yöntemi ve genel zaman tersine çevrilebilir nükleotid ikame modeli (Nei ve Kumar, 2000) kullanılarak gerçekleştirildi. En yüksek log-olasılığa sahip ağaç gösterilmiştir. Sezgisel arama için başlangıç ​​ağacı, komşu birleştirme (NJ) ağacı (Kumar vd., 2024) ve maksimum parsimoni (MP) ağacı arasında daha yüksek log-olasılığa sahip ağaç seçilerek belirlenir. NJ ağacı, genel zaman tersine çevrilebilir model (Nei ve Kumar, 2000) kullanılarak hesaplanan ikili mesafe matrisi kullanılarak oluşturulmuştur.
L-ornitin ve bakterisit "Rizolex-T"nin antibakteriyel aktivitesi, agar difüzyon yöntemiyle in vitro olarak belirlendi. Yöntem: Uygun miktarda L-ornitin stok çözeltisi (500 mg/L) alın ve 10 ml PDA besin ortamı ile iyice karıştırarak sırasıyla 12,5, 25, 50, 75, 100 ve 125 mg/L nihai konsantrasyonlarda çözeltiler hazırlayın. Beş farklı konsantrasyonda fungisit "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 ve 10 mg/L) ve steril damıtılmış su kontrol olarak kullanıldı. Besiyeri katılaştıktan sonra, 4 mm çapında taze hazırlanmış bir Sclerotinia sclerotiorum misel tıkacı Petri kabının ortasına aktarıldı ve miselyum tüm kontrol Petri kabını kaplayana kadar 25±2°C'de kültüre edildi, ardından mantar büyümesi kaydedildi. Denklem 1'i kullanarak S. sclerotiorum'un radyal büyümesinin yüzde inhibisyonunu hesaplayın:
Deney iki kez tekrarlandı; her kontrol/deney grubu için altı biyolojik tekrar ve her biyolojik tekrar için beş saksı (saksı başına iki bitki) kullanıldı. Deneysel sonuçların doğruluğunu, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için her biyolojik tekrar iki kez analiz edildi (iki teknik tekrar). Ayrıca, yarı maksimum inhibitör konsantrasyonu (IC50) ve IC99'u hesaplamak için probit regresyon analizi kullanıldı (Prentice, 1976).
Sera koşullarında L-ornitinin potansiyelini değerlendirmek için iki ardışık saksı deneyi yapıldı. Kısaca, saksılar sterilize edilmiş kil-kum toprağı (3:1) ile dolduruldu ve taze hazırlanmış bir S. sclerotiorum kültürü ile aşılandı. İlk olarak, S. sclerotiorum'un en istilacı izolatı (izolat #3), bir sklerotiumun ikiye kesilmesi, yüzü aşağıya bakacak şekilde bir PDA üzerine yerleştirilmesi ve misel büyümesini uyarmak için 4 gün boyunca 25°C'de sürekli karanlıkta (24 saat) inkübe edilmesiyle kültüre alındı. Daha sonra ön kenardan 5 mm çapında dört agar tıkacı alındı ​​ve 100 g steril buğday ve pirinç kepeği karışımı (1:1, v/v) ile aşılandı ve tüm şişeler sklerot oluşumunu uyarmak için 5 gün boyunca 25 ± 2 °C'de 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüsü altında inkübe edildi. Toprak eklenmeden önce homojenliği sağlamak için tüm şişelerin içeriği iyice karıştırıldı. Daha sonra, patojen konsantrasyonunun sabit kalmasını sağlamak için her saksıya 100 g kolonize edici kepek karışımı eklendi. Aşılanmış saksılar, mantar gelişimini aktive etmek için sulandı ve 7 gün boyunca sera koşullarına yerleştirildi.
Her saksıya Giza 3 çeşidinden beşer adet tohum ekildi. L-ornitin ve fungisit Rizolex-T ile işlem görmüş saksılar için, sterilize edilmiş tohumlar önce iki bileşiğin sulu çözeltisinde iki saat bekletildi; son IC99 konsantrasyonları sırasıyla yaklaşık 250 mg/L ve 50 mg/L idi ve ekimden önce bir saat boyunca havada kurutuldu. Öte yandan, negatif kontrol olarak tohumlar steril damıtılmış suda bekletildi. 10 gün sonra, ilk sulamadan önce, fideler seyreltilerek her saksıda sadece iki sağlıklı fide bırakıldı. Ayrıca, S. sclerotiorum ile enfeksiyonu sağlamak için, aynı gelişim evresindeki (10 günlük) fasulye bitkisi gövdeleri, sterilize edilmiş bir neşter kullanılarak iki farklı yerden kesildi ve her yaraya yaklaşık 0,5 g kolonize edici kepek karışımı yerleştirildi; ardından tüm aşılanmış bitkilerde enfeksiyon ve hastalık gelişimini uyarmak için yüksek nem uygulandı. Kontrol bitkileri de benzer şekilde yaralandı ve yaraya eşit miktarda (0,5 g) steril, kolonize olmamış kepek karışımı yerleştirildi ve hastalık gelişimi için uygun ortamı simüle etmek ve tedavi grupları arasında tutarlılık sağlamak amacıyla yüksek nem altında tutuldu.
Tedavi yöntemi: Fasulye fideleri, toprağa sulama yapılarak 500 ml L-ornitin (250 mg/l) veya fungisit Rizolex-T (50 mg/l) sulu çözeltisi ile sulandı ve bu işlem 10 gün arayla üç kez tekrarlandı. Plasebo uygulanan kontrol grupları ise 500 ml steril damıtılmış su ile sulandı. Tüm uygulamalar sera koşullarında (25 ± 2°C, %75 ± 1 bağıl nem ve 8 saat ışık/16 saat karanlık fotoperiyodu) gerçekleştirildi. Tüm saksılar iki haftada bir sulandı ve aylık olarak, belirli çeşit ve üretici talimatlarına göre yapraktan püskürtme yöntemiyle 3-4 g/l konsantrasyonunda dengeli bir NPK gübresi (20-20-20, %3,6 kükürt ve TE mikro elementleri içeren; Zain Seeds, Mısır) ile muamele edildi. Aksi belirtilmedikçe, her bir biyolojik tekrardan, işlemden 72 saat sonra (hpt) tamamen gelişmiş olgun yapraklar (üstten 2. ve 3. yapraklar) toplandı, homojenize edildi, bir araya getirildi ve oksidatif stres göstergelerinin, lipid peroksidasyonunun, enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanların ve gen ekspresyonunun in situ histokimyasal lokalizasyonu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere daha ileri analizler için -80 °C'de saklandı.
Beyaz küf enfeksiyonunun şiddeti, Petzoldt ve Dickson ölçeğine (1996) dayalı ve Teran vd. (2006) tarafından modifiye edilmiş 1-9 ölçeği (Ek Tablo S2) kullanılarak, aşılamadan 21 gün sonra (dpi) haftalık olarak değerlendirildi. Kısaca, fasulye bitkilerinin gövdeleri ve dalları, internodlar ve düğümler boyunca lezyonların ilerlemesini takip etmek için aşılama noktasından başlayarak incelendi. Lezyonun aşılama noktasından gövde veya dal boyunca en uzak noktaya olan mesafesi ölçüldü ve lezyonun konumuna göre 1-9 arasında bir puan atandı; burada (1) aşılama noktasına yakın görünür enfeksiyon olmadığını ve (2-9) lezyon boyutunda kademeli bir artışı ve düğümler/internodlar boyunca ilerlemeyi gösteriyordu (Ek Tablo S2). Beyaz küf enfeksiyonunun şiddeti daha sonra formül 2 kullanılarak yüzdeye dönüştürüldü:
Ek olarak, hastalık ilerleme eğrisi altındaki alan (AUDPC), yakın zamanda fasulye beyaz çürüklüğü için uyarlanan (Chauhan vd., 2020) denklem 3 kullanılarak (Shaner ve Finney, 1977) formülü kullanılarak hesaplandı:
Yi = ti zamanındaki hastalık şiddeti, Yi+1 = bir sonraki ti+1 zamanındaki hastalık şiddeti, ti = ilk ölçüm zamanı (gün olarak), ti+1 = bir sonraki ölçüm zamanı (gün olarak), n = toplam zaman noktası veya gözlem noktası sayısıdır. Fasulye bitkisinin büyüme parametreleri, bitki boyu (cm), bitki başına dal sayısı ve bitki başına yaprak sayısı dahil olmak üzere, tüm biyolojik tekrarlarda 21 gün boyunca haftalık olarak kaydedildi.
Her biyolojik tekrarda, yaprak örnekleri (üstten ikinci ve üçüncü tam gelişmiş yapraklar) tedaviden 45 gün sonra (son tedaviden 15 gün sonra) toplandı. Her biyolojik tekrar beş saksıdan (saksı başına iki bitki) oluşuyordu. Fotosentetik pigmentlerin (klorofil a, klorofil b ve karotenoidler) ekstraksiyonu için ezilmiş dokunun yaklaşık 500 mg'ı, karanlıkta 4 °C'de %80 aseton kullanılarak kullanıldı. 24 saat sonra, örnekler santrifüjlendi ve süpernatant, klorofil a, klorofil b ve karotenoid içeriklerinin kolorimetrik olarak belirlenmesi için UV-160A spektrofotometre (Shimadzu Corporation, Japonya) kullanılarak (Lichtenthaler, 1987) yöntemine göre üç farklı dalga boyunda (A470, A646 ve A663 nm) absorbans ölçülerek toplandı. Son olarak, fotosentetik pigmentlerin içeriği, Lichtenthaler (1987) tarafından açıklanan aşağıdaki 4-6 numaralı formüller kullanılarak hesaplandı.
Tedaviden 72 saat sonra (hpt), hidrojen peroksit (H2O2) ve süperoksit anyonunun (O2•−) in situ histokimyasal lokalizasyonu için her biyolojik tekrardan yapraklar (üstten ikinci ve üçüncü tam gelişmiş yapraklar) toplandı. Her biyolojik tekrar beş saksıdan (saksı başına iki bitki) oluşuyordu. Yöntemin doğruluğunu, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için her biyolojik tekrar ikişer kez (iki teknik tekrar) analiz edildi. H2O2 ve O2•−, Romero-Puertas vd. (2004) ve Adam vd. (1989) tarafından tanımlanan yöntemlere küçük değişiklikler yapılarak sırasıyla %0,1 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) veya nitroblue tetrazolyum (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) kullanılarak belirlendi. H2O2'nin in situ histokimyasal lokalizasyonu için, kapakçıklar 10 mM Tris tamponunda (pH 7,8) %0,1 DAB ile vakum infiltrasyonuna tabi tutuldu ve ardından oda sıcaklığında 60 dakika boyunca ışık altında inkübe edildi. Kapakçıklar, 4:1 (v/v) etanol:kloroformda %0,15 (v/v) TCA (Al-Gomhoria İlaç ve Tıbbi Malzemeler, Kahire, Mısır) ile ağartıldı ve daha sonra koyulaşana kadar ışığa maruz bırakıldı. Benzer şekilde, kapakçıklar O2•−'nin in situ histokimyasal lokalizasyonu için %0,1 w/v HBT içeren 10 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7,8) ile vakum infiltrasyonuna tabi tutuldu. Kapakçıklar oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ışık altında inkübe edildi, ardından yukarıdaki gibi ağartıldı ve daha sonra koyu mavi/mor lekeler görünene kadar aydınlatıldı. Oluşan kahverengi (H2O2 göstergesi olarak) veya mavi-mor (O2•− göstergesi olarak) rengin yoğunluğu, ImageJ görüntü işleme paketinin Fiji sürümü kullanılarak değerlendirildi (http://fiji.sc; erişim tarihi 7 Mart 2024).
Malondialdehit (MDA; lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olarak), Du ve Bramlage'ın (1992) yöntemine küçük değişiklikler yapılarak belirlendi. Her biyolojik tekrardan (üstten ikinci ve üçüncü tam gelişmiş yapraklar) yapraklar, işlemden 72 saat sonra (hpt) toplandı. Her biyolojik tekrar beş saksıdan (saksı başına iki bitki) oluşuyordu. Yöntemin doğruluğunu, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için her biyolojik tekrar ikişer kez (iki teknik tekrar) analiz edildi. Kısaca, 0,5 g öğütülmüş yaprak dokusu, %0,01 bütillenmiş hidroksitoluen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) içeren %20 trikloroasetik asit (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, ABD) ile MDA ekstraksiyonu için kullanıldı. Daha sonra süpernatanttaki MDA içeriği, UV-160A spektrofotometre (Shimadzu Corporation, Japonya) kullanılarak 532 ve 600 nm'de absorbans ölçülerek kolorimetrik olarak belirlendi ve nmol g−1 FW olarak ifade edildi.
Enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanların değerlendirilmesi için, her bir biyolojik tekrardan, işlemden 72 saat sonra (hpt) yapraklar (üstten ikinci ve üçüncü tam gelişmiş yapraklar) toplandı. Her biyolojik tekrar beş saksıdan (saksı başına iki bitki) oluşuyordu. Her biyolojik örnek ikişer kez analiz edildi (iki teknik örnek). İki yaprak sıvı azotla öğütüldü ve enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanların, toplam amino asitlerin, prolin içeriğinin, gen ekspresyonunun ve oksalat miktarının belirlenmesi için doğrudan kullanıldı.
Toplam çözünür fenolikler, Kahkonen ve ark. (1999) tarafından tanımlanan yöntemin küçük modifikasyonlarıyla Folin-Ciocalteu reaktifi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak belirlendi. Kısaca, yaklaşık 0,1 g homojenize edilmiş yaprak dokusu, karanlıkta 24 saat boyunca 20 ml %80 metanol ile ekstrakte edildi ve santrifüj işleminden sonra süpernatant toplandı. Numune ekstraktının 0,1 ml'si, 0,5 ml Folin-Ciocalteu reaktifi (%10) ile karıştırıldı, 30 saniye çalkalandı ve 5 dakika karanlıkta bekletildi. Daha sonra her tüpe 0,5 ml %20 sodyum karbonat çözeltisi (Na2CO3; Al-Gomhoria İlaç ve Tıbbi Malzeme Şirketi, Kahire, Mısır) eklendi, iyice karıştırıldı ve oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımının absorbansı UV-160A spektrofotometre (Shimadzu Corporation, Japonya) kullanılarak 765 nm'de ölçüldü. Numune ekstraktlarındaki toplam çözünür fenol konsantrasyonu, gallik asit kalibrasyon eğrisi (Fisher Scientific, Hampton, NH, ABD) kullanılarak belirlendi ve taze ağırlığın gramı başına miligram gallik asit eşdeğeri (mg GAE g-1 taze ağırlık) olarak ifade edildi.
Toplam çözünür flavonoid içeriği, Djeridane ve ark. (2006) yöntemine göre, küçük değişikliklerle belirlendi. Kısaca, yukarıdaki metanol ekstraktının 0,3 ml'si, %5'lik alüminyum klorür çözeltisinin (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ABD) 0,3 ml'si ile karıştırıldı, kuvvetlice karıştırıldı ve ardından oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra %10'luk potasyum asetat çözeltisinin (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kahire, Mısır) 0,3 ml'si eklendi, iyice karıştırıldı ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımının absorbansı, UV-160A spektrofotometre (Shimadzu Corporation, Japonya) kullanılarak 430 nm'de ölçüldü. Numune ekstraktlarındaki toplam çözünür flavonoid konsantrasyonu, bir rutin kalibrasyon eğrisi (TCI America, Portland, OR, ABD) kullanılarak belirlendi ve daha sonra taze ağırlığın gramı başına miligram rutin eşdeğeri (mg RE g-1 taze ağırlık) olarak ifade edildi.
Fasulye yapraklarının toplam serbest amino asit içeriği, Yokoyama ve Hiramatsu (2003) tarafından önerilen ve Sun vd. (2006) tarafından modifiye edilen yönteme dayalı olarak, modifiye edilmiş bir ninhidrin reaktifi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABD) kullanılarak belirlendi. Kısaca, 0,1 g öğütülmüş doku pH 5,4 tamponu ile ekstrakte edildi ve süpernatantın 200 μL'si 200 μL ninhidrin (%2) ve 200 μL piridin (%10; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, ABD) ile reaksiyona sokuldu, 30 dakika boyunca kaynar su banyosunda inkübe edildi, daha sonra soğutuldu ve UV-160A spektrofotometre (Shimadzu Corporation, Japonya) kullanılarak 580 nm'de ölçüldü. Öte yandan, prolin Bates yöntemiyle belirlendi (Bates vd., 1973). Prolin, %3 sülfosalisilik asit (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABD) ile ekstrakte edildi ve santrifüj işleminden sonra, süpernatantın 0,5 ml'si 1 ml buzlu asetik asit (Fisher Scientific, Hampton, NH, ABD) ve ninhidrin reaktifi ile karıştırıldı, 90°C'de 45 dakika inkübe edildi, soğutuldu ve yukarıda belirtilen aynı spektrofotometre kullanılarak 520 nm'de ölçüldü. Yaprak ekstraktlarındaki toplam serbest amino asitler ve prolin, sırasıyla glisin ve prolin kalibrasyon eğrileri (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABD) kullanılarak belirlendi ve mg/g taze ağırlık olarak ifade edildi.
Antioksidan enzimlerin enzimatik aktivitesini belirlemek için, yaklaşık 500 mg homojenize doku, 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ve %7,5 polivinilpirolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) içeren 3 ml 50 mM Tris tamponu (pH 7,8) ile ekstrakte edildi, soğutma altında (4 °C) 20 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüjlendi ve süpernatant (ham enzim ekstraktı) toplandı (El-Nagar vd., 2023; Osman vd., 2023). Katalaz (CAT) daha sonra 2 ml 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) ve 100 μl 269 mM H2O2 çözeltisi ile reaksiyona sokularak, Aebi'nin (1984) yöntemine göre (El-Nagar vd., 2023; Osman vd., 2023) enzimatik aktivitesi belirlendi. Guaiakol bağımlı peroksidaz (POX) enzimatik aktivitesi ise Harrach vd. (2009) yöntemi kullanılarak belirlendi. (2008) küçük değişikliklerle (El-Nagar vd., 2023; Osman vd., 2023) ve polifenol oksidazın (PPO) enzimatik aktivitesi, 2,2 ml 100 mM sodyum fosfat tamponu (pH 6,0), 100 μl guaiakol (TCI Chemicals, Portland, OR, ABD) ve 100 μl 12 mM H2O2 ile reaksiyon sonrasında belirlendi. Yöntem, (El-Nagar vd., 2023; Osman vd., 2023)'ten biraz değiştirildi. Deney, 0,1 M fosfat tamponunda (pH 6,0) taze hazırlanmış 3 ml katekol çözeltisi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABD) (0,01 M) ile reaksiyon sonrasında gerçekleştirildi. CAT aktivitesi, 240 nm'de (A240) H2O2'nin bozunmasının izlenmesiyle, POX aktivitesi 436 nm'de (A436) absorbans artışının izlenmesiyle ve PPO aktivitesi ise 495 nm'de (A495) absorbans dalgalanmalarının her 30 saniyede bir kaydedilmesiyle 3 dakika boyunca UV-160A spektrofotometre (Shimadzu, Japonya) kullanılarak ölçülmüştür.
Gerçek zamanlı RT-PCR, son işlemden 72 saat sonra fasulye yapraklarında (üstten ikinci ve üçüncü tam gelişmiş yapraklar) peroksizomal katalaz (PvCAT1; GenBank Erişim No. KF033307.1), süperoksit dismutaz (PvSOD; GenBank Erişim No. XM_068639556.1) ve glutatyon redüktaz (PvGR; GenBank Erişim No. KY195009.1) dahil olmak üzere üç antioksidan ile ilgili genin transkript seviyelerini tespit etmek için kullanıldı. Kısaca, RNA, üreticinin protokolüne göre Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Çin) kullanılarak izole edildi. Daha sonra, cDNA, üreticinin talimatlarına göre TOP script™ cDNA Synthesis Kit kullanılarak sentezlendi. Yukarıdaki üç genin primer dizileri Ek Tablo S3'te listelenmiştir. PvActin-3 (GenBank erişim numarası: XM_068616709.1) referans gen olarak kullanıldı ve göreceli gen ekspresyonu 2-ΔΔCT yöntemi kullanılarak hesaplandı (Livak ve Schmittgen, 2001). Aktin stabilitesinin biyotik stres (yaygın baklagiller ile antraknoz mantarı Colletotrichum lindemuthianum arasındaki uyumsuz etkileşim) ve abiyotik stres (kuraklık, tuzluluk, düşük sıcaklık) altında olduğu gösterildi (Borges vd., 2012).
Başlangıçta, protein-protein BLAST aracı (BLASTp 2.15.0+) (Altschul ve ark., 1997, 2005) kullanarak S. sclerotiorum'daki oksaloasetat asetilhidrolaz (OAH) proteinlerinin genom çapında in silico analizini gerçekleştirdik. Kısaca, S. sclerotiorum'daki homolog proteini (taksit: 5180) eşleştirmek için sorgu dizileri olarak Aspergillus fijiensis CBS 313.89'dan (AfOAH; taksit: 1191702; GenBank erişim numarası XP_040799428.1; 342 amino asit) ve Penicillium lagena'dan (PlOAH; taksit: 94218; GenBank erişim numarası XP_056833920.1; 316 amino asit) OAH'ı kullandık. BLASTp, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) web sitesinde (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) bulunan GenBank'taki en güncel S. sclerotiorum genom verilerine karşı gerçekleştirildi.
Ek olarak, S. sclerotiorum'dan tahmin edilen OAH geni (SsOAH) ve A. fijiensis CBS 313.89'dan AfOAH ve P. lagena'dan PlOAH'ın evrimsel analizi ve filogenetik ağacı, MEGA11'de (Tamura vd., 2021) maksimum olasılık yöntemi ve JTT matris tabanlı model (Jones vd., 1992) kullanılarak çıkarılmıştır. Filogenetik ağaç, S. sclerotiorum'dan tahmin edilen tüm OAH genlerinin (SsOAH) ve sorgu dizisinin protein dizilerinin çoklu hizalama analizi ile Kısıtlamaya Dayalı Hizalama Aracı (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ve Agarwala, 2007) kullanılarak birleştirilmiştir. Ek olarak, S. sclerotiorum'dan elde edilen SsOAH'ın en iyi eşleşen amino asit dizileri, ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) kullanılarak sorgu dizileri (AfOAH ve PlOAH) ile hizalandı (Larkin ve ark., 2007) ve hizalamadaki korunmuş bölgeler ESPript aracı (sürüm 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) kullanılarak görselleştirildi.
Ayrıca, S. sclerotiorum SsOAH'nin tahmini fonksiyonel temsilci alanları ve korunmuş bölgeleri, InterPro aracı (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) kullanılarak etkileşimli olarak farklı ailelere sınıflandırıldı (Blum ve ark., 2021). Son olarak, tahmini S. sclerotiorum SsOAH'nin üç boyutlu (3D) yapı modellemesi, Protein Homoloji/Analoji Tanıma Motoru (Phyre2 sunucu sürümü 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley ve ark., 2015) kullanılarak gerçekleştirildi ve SWISS-MODEL sunucusu (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini ve ark., 2014) kullanılarak doğrulandı. Tahmin edilen üç boyutlu yapılar (PDB formatı), UCSF-Chimera paketi (sürüm 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen ve ark., 2004) kullanılarak etkileşimli olarak görselleştirildi.
Kantitatif gerçek zamanlı floresan PCR, Sclerotinia sclerotiorum miselyumlarında oksaloasetat asetilhidrolazın (SsOAH; GenBank erişim numarası: XM_001590428.1) transkripsiyon seviyesini belirlemek için kullanıldı. Kısaca, S. sclerotiorum, PDB içeren bir şişeye aşılandı ve miselyum büyümesini uyarmak için 25 ± 2 °C'de 24 saat boyunca 150 rpm'de çalkalamalı inkübatöre (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ABD) ve sürekli karanlıkta (24 saat) yerleştirildi. Daha sonra, hücreler son IC50 konsantrasyonlarında (sırasıyla yaklaşık 40 ve 3,2 mg/L) L-ornitin ve fungisit Rizolex-T ile muamele edildi ve ardından aynı koşullar altında 24 saat daha kültüre edildi. İnkübasyondan sonra, kültürler 5 dakika boyunca 2500 rpm'de santrifüjlendi ve süpernatant (mantar miseli) gen ekspresyon analizi için toplandı. Benzer şekilde, enfekte dokuların yüzeyinde beyaz küf ve pamuksu misel oluşturan enfekte bitkilerden enfeksiyondan sonra 0, 24, 48, 72, 96 ve 120 saatte mantar miseli toplandı. Mantar miselinden RNA ekstrakte edildi ve daha sonra yukarıda açıklandığı gibi cDNA sentezlendi. SsOAH için primer dizileri Ek Tablo S3'te listelenmiştir. SsAktin (GenBank erişim numarası: XM_001589919.1) ev içi gen olarak kullanıldı ve göreceli gen ekspresyonu 2-ΔΔCT yöntemi kullanılarak hesaplandı (Livak ve Schmittgen, 2001).
Patates dekstroz suyu (PDB) ve Sclerotinia sclerotiorum mantar patojenini içeren bitki örneklerinde oksalik asit, Xu ve Zhang'ın (2000) yöntemine göre, küçük değişikliklerle belirlendi. Kısaca, S. sclerotiorum izolatları PDB içeren şişelere aşılandı ve daha sonra misel büyümesini uyarmak için 25 ± 2 °C'de 150 rpm'de 3-5 gün boyunca sürekli karanlıkta (24 saat) çalkalamalı inkübatörde (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ABD) kültüre edildi. İnkübasyondan sonra, mantar kültürü önce Whatman #1 filtre kağıdından süzüldü ve daha sonra kalan miselyumu uzaklaştırmak için 5 dakika boyunca 2500 rpm'de santrifüjlendi. Süpernatant toplandı ve oksalatın daha sonraki kantitatif tayini için 4°C'de saklandı. Bitki örneklerinin hazırlanması için, yaklaşık 0,1 g bitki dokusu parçası, damıtılmış su ile üç kez (her seferinde 2 ml) ekstrakte edildi. Daha sonra örnekler 5 dakika boyunca 2500 rpm'de santrifüjlendi, üst sıvı Whatman No. 1 filtre kağıdından kuru olarak süzüldü ve daha sonraki analizler için toplandı.
Oksalik asidin kantitatif analizi için, reaksiyon karışımı cam tıpalı bir tüpte aşağıdaki sırayla hazırlandı: 0,2 ml örnek (veya PDB kültür filtratı veya oksalik asit standart çözeltisi), 0,11 ml bromofenol mavisi (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ABD), 0,198 ml 1 M sülfürik asit (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kahire, Mısır) ve 0,176 ml 100 mM potasyum dikromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ABD). Daha sonra çözelti damıtılmış su ile 4,8 ml'ye kadar seyreltildi, kuvvetlice karıştırıldı ve hemen 60 °C'lik bir su banyosuna yerleştirildi. 10 dakika sonra, reaksiyon 0,5 ml sodyum hidroksit çözeltisi (NaOH; 0,75 M) eklenerek durduruldu. Reaksiyon karışımının absorbansı (A600), UV-160 spektrofotometre (Shimadzu Corporation, Japonya) kullanılarak 600 nm'de ölçüldü. Kültür filtratlarının ve bitki örneklerinin kantifikasyonu için sırasıyla PDB ve damıtılmış su kontrol olarak kullanıldı. Kültür filtratlarındaki oksalik asit konsantrasyonları, mililitre PDB ortamı başına mikrogram oksalik asit (μg.mL−1) ve yaprak özütlerindeki oksalik asit konsantrasyonları ise gram taze ağırlık başına mikrogram oksalik asit (μg.g−1 FW) olarak, bir oksalik asit kalibrasyon eğrisi (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ABD) kullanılarak belirlendi.
Çalışma boyunca, aksi belirtilmedikçe, tüm deneyler, her tedavi için altı biyolojik tekrar ve her biyolojik tekrar için beş saksı (saksı başına iki bitki) ile tamamen rastgele bir tasarım (CRD) kullanılarak tasarlandı. Biyolojik tekrarlar ikişerli olarak analiz edildi (iki teknik tekrar). Teknik tekrarlar, aynı deneyin tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için kullanıldı, ancak hatalı tekrarlardan kaçınmak için istatistiksel analizde kullanılmadı. Veriler, varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey-Kramer dürüstçe anlamlı fark (HSD) testi (p ≤ 0,05) kullanılarak istatistiksel olarak analiz edildi. İn vitro deneyler için, IC50 ve IC99 değerleri probit modeli kullanılarak hesaplandı ve %95 güven aralıkları hesaplandı.
Mısır'ın El Ghabiya Valiliği'ndeki farklı soya fasulyesi tarlalarından toplam dört izolat toplandı. PDA ortamında, tüm izolatlar hızla pamuksu beyaza (Şekil 1A) ve daha sonra sklerotium aşamasında bej veya kahverengiye dönüşen krem ​​beyazı miselyum üretti. Sklerotiumlar genellikle yoğun, siyah, küresel veya düzensiz şekilli, 5,2 ila 7,7 mm uzunluğunda ve 3,4 ila 5,3 mm çapındadır (Şekil 1B). Dört izolat, 25 ± 2 °C'de 10-12 günlük inkübasyondan sonra kültür ortamının kenarında marjinal bir sklerotium deseni geliştirmesine rağmen (Şekil 1A), plaka başına sklerotium sayısı aralarında önemli ölçüde farklıydı (P < 0,001), izolat 3 en yüksek sklerotium sayısına sahipti (plaka başına 32,33 ± 1,53 sklerotium; Şekil 1C). Benzer şekilde, 3 numaralı izolat, PDB'de diğer izolatlara göre daha fazla oksalik asit üretti (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Şekil 1D). 3 numaralı izolat, fitopatojenik mantar Sclerotinia sclerotiorum'un tipik morfolojik ve mikroskobik özelliklerini gösterdi. Örneğin, PDA üzerinde, 3 numaralı izolatın kolonileri hızla büyüdü, krem ​​beyazı (Şekil 1A), ters bej veya açık somon sarı-kahverengi renkteydi ve 9 cm çapındaki bir plakanın yüzeyini tamamen kaplamak için 25 ± 2°C'de 6-7 gün gerektirdi. Yukarıdaki morfolojik ve mikroskobik özelliklere dayanarak, 3 numaralı izolat Sclerotinia sclerotiorum olarak tanımlandı.
Şekil 1. Yaygın baklagil bitkilerinden izole edilen S. sclerotiorum izolatlarının özellikleri ve patojenitesi. (A) Dört S. sclerotiorum izolatının PDA ortamında misel büyümesi, (B) dört S. sclerotiorum izolatının sklerotları, (C) sklerot sayısı (plaka başına), (D) PDB ortamında oksalik asit salgısı (μg.mL−1) ve (E) sera koşullarında duyarlı ticari baklagil çeşidi Giza 3'te dört S. sclerotiorum izolatının hastalık şiddeti (%). Değerler, beş biyolojik tekrarın ortalama ± standart sapmasını temsil eder (n = 5). Farklı harfler, uygulamalar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir (p < 0,05). (F–H) Tipik beyaz küf belirtileri, sırasıyla, 3 numaralı izolat ile aşılamadan 10 gün sonra (dpi) toprak üstü gövdelerde ve kapsüllerde ortaya çıktı. (I) S. sclerotiorum izolatı #3'ün iç transkripsiyonlu ara bölge (ITS) bölgesinin evrimsel analizi, maksimum olasılık yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi ve Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) veritabanından (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) elde edilen 20 referans izolat/suş ile karşılaştırıldı. Kümeleme çizgilerinin üzerindeki sayılar bölge kapsamını (%) ve kümeleme çizgilerinin altındaki sayılar dal uzunluğunu göstermektedir.
Ayrıca, patojeniteyi doğrulamak için, elde edilen dört S. sclerotiorum izolatı, Koch'un postulatlarıyla tutarlı olarak, sera koşullarında duyarlı ticari fasulye çeşidi Giza 3'e aşılandı (Şekil 1E). Elde edilen tüm mantar izolatları patojenik olup yeşil fasulyeyi (cv. Giza 3) enfekte ederek, özellikle gövdelerde (Şekil 1G) ve baklalarda (Şekil 1H) olmak üzere, aşılamadan 10 gün sonra (dpi) tüm toprak üstü kısımlarda tipik beyaz küf belirtilerine neden olabilse de (Şekil 1F), izolat 3 iki bağımsız deneyde en agresif izolat oldu. İzolat 3, fasulye bitkilerinde en yüksek hastalık şiddetine (%) sahipti (sırasıyla enfeksiyondan 7, 14 ve 21 gün sonra 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 ve 76,7 ± 3,1; Şekil 1F).
En istilacı S. sclerotiorum izolatı #3'ün tanımlanması, iç transkripsiyonel aralık (ITS) dizilemesi temelinde daha da doğrulandı (Şekil 1I). İzolat #3 ile 20 referans izolat/suş arasındaki filogenetik analiz, aralarında yüksek benzerlik (>%99) gösterdi. S. sclerotiorum izolatı #3'ün (533 bp), kuru bezelye tohumlarından izole edilen Amerikan S. sclerotiorum izolatı LPM36 (GenBank erişim numarası MK896659.1; 540 bp) ve menekşe (Matthiola incana) gövde çürümesine neden olan Çin S. sclerotiorum izolatı YKY211 (GenBank erişim numarası OR206374.1; 548 bp) ile yüksek benzerlik gösterdiğini belirtmekte fayda var; bunların tümü dendrogramın üst kısmında ayrı ayrı gruplandırılmıştır (Şekil 1I). Yeni sekans NCBI veritabanına kaydedildi ve “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (GenBank erişim numarası PV202792) olarak adlandırıldı. İzolat 3'ün en invaziv izolat olduğu görülebilir; bu nedenle, sonraki tüm deneylerde bu izolat çalışma için seçildi.
Diamin L-ornitinin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya) farklı konsantrasyonlardaki (12,5, 25, 50, 75, 100 ve 125 mg/L) S. sclerotiorum izolatı 3'e karşı antibakteriyel aktivitesi in vitro olarak araştırılmıştır. L-ornitinin antibakteriyel bir etki gösterdiği ve S. sclerotiorum hiflerinin radyal büyümesini doz bağımlı bir şekilde kademeli olarak inhibe ettiği dikkat çekicidir (Şekil 2A, B). Test edilen en yüksek konsantrasyonda (125 mg/L), L-ornitin en yüksek misel büyüme inhibisyon oranını (%99,62 ± 0,27; Şekil 2B) göstermiştir; bu oran, test edilen en yüksek konsantrasyonda (10 mg/L) ticari fungisit Rizolex-T'nin inhibisyon oranına (%99,45 ± 0,39; Şekil 2C) eşdeğerdir ve benzer etkinliğe işaret etmektedir.
Şekil 2. L-ornitinin Sclerotinia sclerotiorum'a karşı in vitro antibakteriyel aktivitesi. (A) Farklı L-ornitinin konsantrasyonlarının S. sclerotiorum'a karşı antibakteriyel aktivitesinin ticari fungisit Rizolex-T (10 mg/L) ile karşılaştırılması. (B, C) Sırasıyla farklı L-ornitin konsantrasyonları (12,5, 25, 50, 75, 100 ve 125 mg/L) veya Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ve 10 mg/L) ile muameleden sonra S. sclerotiorum misel büyümesinin inhibisyon oranı (%). Değerler beş biyolojik tekrarın ortalama ± standart sapmasını temsil eder (n = 5). Farklı harfler, tedaviler arasındaki istatistiksel farklılıkları gösterir (p < 0,05). (D, E) Sırasıyla L-ornitin ve ticari fungisit Rizolex-T'nin probit model regresyon analizi. Probit model regresyon doğrusu düz mavi çizgi, güven aralığı (%95) ise kesikli kırmızı çizgi olarak gösterilmiştir.
Ek olarak, probit regresyon analizi yapıldı ve ilgili grafikler Tablo 1 ve Şekil 2D,E'de gösterilmiştir. Kısaca, L-ornitinin kabul edilebilir eğim değeri (y = 2,92x − 4,67) ve ilişkili anlamlı istatistikler (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 ve p < 0,0001; Şekil 2D), ticari fungisit Rizolex-T'ye (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 ve p < 0,0001) kıyasla S. sclerotiorum'a karşı artırılmış bir antifungal aktivite gösterdiğini belirtmektedir (Tablo 1).
Tablo 1. L-ornitin ve ticari fungisit "Rizolex-T"nin S. sclerotiorum'a karşı yarı maksimum inhibitör konsantrasyon (IC50) ve IC99 (mg/l) değerleri.
Genel olarak, L-ornitin (250 mg/L), tedavi edilmemiş S. sclerotiorum ile enfekte olmuş bitkilere (kontrol; Şekil 3A) kıyasla, tedavi edilmiş fasulye bitkilerinde beyaz küfün gelişimini ve şiddetini önemli ölçüde azalttı. Kısaca, tedavi edilmemiş enfekte kontrol bitkilerinin hastalık şiddeti kademeli olarak artarken (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 ve 92,33 ± 3,06%), L-ornitin, deney boyunca hastalık şiddetini (%) önemli ölçüde azalttı (sırasıyla 7, 14 ve 21. günlerde) (Şekil 3A). Benzer şekilde, S. sclerotiorum ile enfekte olmuş fasulye bitkileri 250 mg/L L-ornitin ile muamele edildiğinde, hastalık ilerleme eğrisi altındaki alan (AUDPC), işlenmemiş kontrol grubundaki 1274,33 ± 33,13 değerinden 281,03 ± 7,95'e düştü; bu değer, pozitif kontrol olan 50 mg/L Rizolex-T fungisitinin değerinden (183,61 ± 7,71; Şekil 3B) biraz daha düşüktü. İkinci deneyde de aynı eğilim gözlemlendi.
Şekil 3. Sera koşullarında Sclerotinia sclerotiorum'un neden olduğu fasulye beyaz küfünün gelişimine L-ornitinin dışarıdan uygulanmasının etkisi. (A) 250 mg/L L-ornitin ile muameleden sonra fasulye beyaz küfünün hastalık ilerleme eğrisi. (B) L-ornitin ile muameleden sonra fasulye beyaz küfünün hastalık ilerleme eğrisi altındaki alan (AUDPC). Değerler beş biyolojik tekrarın ortalama ± standart sapmasını temsil eder (n = 5). Farklı harfler, tedaviler arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir (p < 0,05).
250 mg/L L-ornitinin dışarıdan uygulanması, 42 gün sonra bitki boyunu (Şekil 4A), bitki başına dal sayısını (Şekil 4B) ve bitki başına yaprak sayısını (Şekil 4C) kademeli olarak artırdı. Ticari fungisit Rizolex-T (50 mg/L) incelenen tüm besin parametreleri üzerinde en büyük etkiye sahipken, 250 mg/L L-ornitinin dışarıdan uygulanması, işlenmemiş kontrollere kıyasla ikinci en büyük etkiye sahipti (Şekil 4A–C). Öte yandan, L-ornitin uygulaması fotosentetik pigmentler klorofil a (Şekil 4D) ve klorofil b (Şekil 4E) içeriği üzerinde önemli bir etki göstermedi, ancak toplam karotenoid içeriğini negatif kontrol (0,44 ± 0,02 mg/g taze ağırlık) ve pozitif kontrol (0,46 ± 0,02 mg/g taze ağırlık; Şekil 4F) ile karşılaştırıldığında hafifçe artırdı (0,56 ± 0,03 mg/g taze ağırlık). Genel olarak, bu sonuçlar L-ornitinin işlem görmüş baklagiller için fitotoksik olmadığını ve hatta büyümelerini uyarabileceğini göstermektedir.
Şekil 4. Sera koşullarında Sclerotinia sclerotiorum ile enfekte olmuş fasulye yapraklarının büyüme özellikleri ve fotosentetik pigmentleri üzerindeki ekzojen L-ornitin uygulamasının etkisi. (A) Bitki yüksekliği (cm), (B) Bitki başına dal sayısı, (C) Bitki başına yaprak sayısı, (D) Klorofil a içeriği (mg g-1 taze ağırlık), (E) Klorofil b içeriği (mg g-1 taze ağırlık), (F) Toplam karotenoid içeriği (mg g-1 taze ağırlık). Değerler, beş biyolojik tekrarın ortalama ± standart sapmasıdır (n = 5). Farklı harfler, uygulamalar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları göstermektedir (p < 0,05).
Reaktif oksijen türlerinin (ROS; hidrojen peroksit [H2O2] olarak ifade edilir) ve serbest radikallerin (süperoksit anyonları [O2•−] olarak ifade edilir) in situ histokimyasal lokalizasyonu, L-ornitinin (250 mg/L) eksojen uygulamasının, hem tedavi edilmemiş enfekte bitkilerin (sırasıyla 173,31 ± 12,06 ve 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) hem de 50 mg/L ticari fungisit Rizolex-T ile tedavi edilen bitkilerin (170,12 ± 9,50) birikimine kıyasla H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Şekil 5A) ve O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Şekil 5B) birikimini önemli ölçüde azalttığını ortaya koymuştur. 72 saatte sırasıyla 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 taze ağırlık ve 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 taze ağırlık olarak ölçülmüştür. Yüksek H2O2 ve O2•− seviyeleri hpt altında birikmiştir (Şekil 5A, B). Benzer şekilde, TCA bazlı malondialdehit (MDA) testi, S. sclerotiorum ile enfekte olmuş fasulye bitkilerinin yapraklarında daha yüksek MDA seviyeleri (113,48 ± 10,02 nmol.g taze ağırlık) biriktirdiğini göstermiştir (Şekil 5C). Bununla birlikte, L-ornitinin dışarıdan uygulanması, tedavi edilen bitkilerde MDA içeriğindeki azalmayla (33,08 ± 4,00 nmol.g taze ağırlık) kanıtlandığı gibi, lipid peroksidasyonunu önemli ölçüde azaltmıştır.
Şekil 5. Sera koşullarında S. sclerotiorum ile enfekte olmuş fasulye yapraklarında enfeksiyondan 72 saat sonra, dışarıdan uygulanan L-ornitinin oksidatif stresin ana belirteçleri ve enzimatik olmayan antioksidan savunma mekanizmaları üzerindeki etkisi. (A) 72 hpt'de hidrojen peroksit (H2O2; nmol g−1 FW), (B) 72 hpt'de süperoksit anyonu (O2•−; nmol g−1 FW), (C) 72 hpt'de malondialdehit (MDA; nmol g−1 FW), (D) 72 hpt'de toplam çözünür fenoller (mg GAE g−1 FW), (E) 72 hpt'de toplam çözünür flavonoidler (mg RE g−1 FW), (F) 72 hpt'de toplam serbest amino asitler (mg g−1 FW) ve (G) 72 hpt'de prolin içeriği (mg g−1 FW). Değerler, 5 biyolojik tekrarın (n = 5) ortalama ± standart sapmasını (ortalama ± SD) temsil eder. Farklı harfler, tedaviler arasındaki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları göstermektedir (p < 0,05).