Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü CSS için sınırlı desteğe sahiptir. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Yüksek yükleme içeriğine sahip insülin nanopartikülleri (NP'ler), farklı dozaj formlarında çeşitli uygulamalar bulmuştur. Bu çalışma, dondurarak kurutma ve püskürtmeli kurutma işlemlerinin, kriyoprotektan olarak mannitol içeren veya içermeyen insülin yüklü kitosan nanopartiküllerinin yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Ayrıca, bu nanopartiküllerin kalitesini yeniden çözerek değerlendirdik. Dehidrasyondan önce, kitosan/sodyum tripolifosfat/insülin çapraz bağlı nanopartiküllerin partikül boyutu 318 nm, PDI 0,18, kapsülleme verimliliği %99,4 ve yükleme %25,01 olarak optimize edildi. Yeniden çözündürme işleminden sonra, mannitol kullanılmadan dondurarak kurutma yöntemiyle üretilenler hariç, tüm nanopartiküller küresel partikül yapısını korudu. Mannitol içeren ve püskürtmeli kurutma ile dehidrate edilen nanopartiküllerle karşılaştırıldığında, mannitol içermeyen püskürtmeli kurutulmuş nanopartiküller de en küçük ortalama partikül boyutunu gösterdi. (376 nm) ve en yüksek yükleme içeriği (%25,02) ile benzer kapsülleme oranı (%98,7) ve PDI (0,20) değerlerine sahip olan nanopartiküller, kurutma veya dondurarak kurutma teknikleriyle elde edilmiştir. Mannitol kullanılmadan püskürtmeli kurutma ile elde edilen kurutulmuş nanopartiküller ayrıca insülinin en hızlı salınımını ve hücresel alımın en yüksek verimliliğini sağlamıştır. Bu çalışma, püskürtmeli kurutmanın, geleneksel dondurarak kurutma yöntemlerine kıyasla kriyoprotektanlara ihtiyaç duymadan insülin nanopartiküllerini susuzlaştırabileceğini ve böylece daha yüksek yükleme kapasitesi, daha düşük katkı maddesi gereksinimleri ve işletme maliyetlerinde önemli avantajlar sağladığını göstermektedir.
1922'deki keşfinden bu yana, insülin ve farmasötik preparatları, tip 1 diyabet (T1DM) ve tip 2 diyabet (T2DM) hastalarının hayatlarını kurtarmıştır. Bununla birlikte, yüksek moleküler ağırlıklı bir protein olması nedeniyle insülin kolayca kümelenir, proteolitik enzimler tarafından parçalanır ve ilk geçiş etkisiyle vücuttan atılır. Tip 1 diyabet teşhisi konan kişilerin ömür boyu insülin enjeksiyonuna ihtiyaçları vardır. Başlangıçta tip 2 diyabet teşhisi konan birçok hasta da uzun süreli insülin enjeksiyonuna ihtiyaç duyar. Günlük insülin enjeksiyonları, bu kişiler için ciddi bir günlük ağrı ve rahatsızlık kaynağıdır ve ruh sağlığı üzerinde olumsuz etkileri vardır. Sonuç olarak, oral insülin uygulaması gibi daha az rahatsızlığa neden olan diğer insülin uygulama yöntemleri, dünya çapında yaklaşık 5 milyar diyabetli insanın yaşam kalitesini geri kazandırma potansiyeline sahip oldukları için kapsamlı bir şekilde incelenmektedir.
Nanopartikül teknolojisi, oral insülinin alınması girişimlerinde önemli bir ilerleme sağlamıştır4,6,7. Bu teknoloji, insülini etkili bir şekilde kapsülleyerek ve bozulmaya karşı koruyarak, vücudun belirli bölgelerine hedeflenmiş bir şekilde iletilmesini sağlar. Bununla birlikte, nanopartikül formülasyonlarının kullanımı, esas olarak partikül süspansiyonlarının stabilite sorunlarından kaynaklanan çeşitli sınırlamalara sahiptir. Depolama sırasında bazı agregasyonlar meydana gelebilir ve bu da insülin yüklü nanopartiküllerin biyoyararlanımını azaltır8. Ayrıca, insülin nanopartiküllerinin (NP'ler) stabilitesini sağlamak için nanopartiküllerin ve insülinin polimer matrisinin kimyasal stabilitesi de dikkate alınmalıdır. Şu anda, dondurarak kurutma teknolojisi, depolama sırasında istenmeyen değişiklikleri önlerken stabil NP'ler oluşturmak için altın standarttır9.
Ancak, dondurarak kurutma işlemi, nanopartiküllerin küresel yapısının buz kristallerinin mekanik stresinden etkilenmesini önlemek için kriyokoruyucu maddelerin eklenmesini gerektirir. Bu durum, kriyokoruyucu maddenin ağırlık oranının büyük bir kısmını oluşturması nedeniyle, liyofilizasyondan sonra insülin nanopartiküllerinin yüklenmesini önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, üretilen insülin nanopartikülleri, insülinin terapötik aralığına ulaşmak için büyük miktarlarda kuru nanopartikül gerekliliği nedeniyle, oral tabletler ve oral filmler gibi kuru toz formülasyonlarının üretimi için genellikle uygun bulunmaz.
Sprey kurutma, ilaç endüstrisinde sıvı fazlardan kuru tozlar üretmek için bilinen ve ucuz bir endüstriyel ölçekli işlemdir10,11. Parçacık oluşum süreci üzerindeki kontrol, çeşitli biyoaktif bileşiklerin uygun şekilde kapsüllenmesine olanak tanır12, 13. Ayrıca, oral uygulama için kapsüllenmiş proteinlerin hazırlanmasında etkili bir teknik haline gelmiştir. Sprey kurutma sırasında su çok hızlı buharlaşır, bu da parçacık çekirdeğinin sıcaklığını düşük tutmaya yardımcı olur11,14 ve ısıya duyarlı bileşenlerin kapsüllenmesinde uygulanmasını sağlar. Sprey kurutmadan önce, kaplama malzemesi, kapsüllenmiş bileşenleri içeren çözelti ile iyice homojenleştirilmelidir11,14. Dondurarak kurutmanın aksine, sprey kurutmada kapsüllemeden önce homojenleştirme, dehidrasyon sırasında kapsülleme verimliliğini artırır. Sprey kurutma kapsülleme işlemi kriyoprotektan gerektirmediğinden, sprey kurutma yüksek yükleme içeriğine sahip kurutulmuş NP'ler üretmek için kullanılabilir.
Bu çalışmada, iyon jel yöntemi kullanılarak kitosan ve sodyum tripolifosfatın çapraz bağlanmasıyla insülin yüklü nanopartiküllerin üretimi rapor edilmektedir. İyon jelasyonu, belirli koşullar altında iki veya daha fazla iyonik tür arasındaki elektrostatik etkileşimler yoluyla nanopartiküllerin üretilmesine olanak sağlayan bir hazırlama yöntemidir. Optimize edilmiş kitosan/sodyum tripolifosfat/insülin çapraz bağlı nanopartiküllerin dehidratasyonu için hem dondurarak kurutma hem de püskürtmeli kurutma teknikleri kullanılmıştır. Dehidratasyondan sonra, morfolojileri SEM ile analiz edilmiştir. Rekombinasyon yetenekleri, boyut dağılımları, yüzey yükleri, PDI, kapsülleme verimliliği ve yükleme içerikleri ölçülerek değerlendirilmiştir. Farklı dehidratasyon yöntemleriyle üretilen yeniden çözünmüş nanopartiküllerin kalitesi de insülin koruma, salınım davranışı ve hücresel alım etkinliği karşılaştırılarak değerlendirilmiştir.
Karışım çözeltisinin pH'ı ve kitosan ile insülin oranı, iyonotropik jelleşme sürecini doğrudan etkiledikleri için, nihai nanopartiküllerin partikül boyutunu ve kapsülleme verimliliğini (EE) etkileyen iki önemli faktördür. Karışım çözeltisinin pH'ının partikül boyutu ve kapsülleme verimliliği ile yüksek oranda ilişkili olduğu gösterilmiştir (Şekil 1a). Şekil 1a'da gösterildiği gibi, pH 4,0'dan 6,0'a yükseldikçe, ortalama partikül boyutu (nm) azalmış ve EE önemli ölçüde artmıştır; pH 6,5'e yükseldiğinde ise ortalama partikül boyutu artmaya başlamış ve EE değişmeden kalmıştır. Kitosan/insülin oranı arttıkça, ortalama partikül boyutu da artmaktadır. Ayrıca, nanopartiküller kitosan/insülin kütle oranı 2,5:1'den (ağırlık/ağırlık) daha yüksek olduğunda EE'de herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 1b). Bu nedenle, bu çalışmadaki optimal hazırlama koşulları (pH 6,0, kitosan/insülin kütle oranı) Daha ileri çalışmalar için insülin yüklü nanopartiküllerin hazırlanmasında 2,5:1 oranında karışım kullanıldı. Bu hazırlama koşulu altında, insülin nanopartiküllerinin ortalama partikül boyutu 318 nm (Şekil 1c), PDI 0,18, gömme verimliliği %99,4, zeta potansiyeli 9,8 mV ve insülin yüklemesi %25,01 (m/m) olarak optimize edildi. İletim elektron mikroskobu (TEM) sonuçlarına göre, optimize edilmiş nanopartiküller kabaca küresel ve nispeten homojen boyutta ayrık yapıdaydı (Şekil 1d).
İnsülin nanopartiküllerinin parametre optimizasyonu: (a) pH'ın insülin nanopartiküllerinin ortalama çapı ve kapsülleme verimliliği (EE) üzerindeki etkisi (kitosan ve insülinin 5:1 kütle oranında hazırlanmıştır); (b) kitosan ve insülinin kütle oranının insülin NP'lerinin ortalama çapı ve kapsülleme verimliliği (EE) üzerindeki etkisi (pH 6'da hazırlanmıştır); (c) optimize edilmiş insülin nanopartiküllerinin partikül boyutu dağılımı; (d) optimize edilmiş insülin NP'lerinin TEM mikrografı.
Kitosan'ın pKa değeri 6,5 olan zayıf bir polielektrolit olduğu iyi bilinmektedir. Ana amino grubu hidrojen iyonları tarafından protonlandığı için asidik ortamlarda pozitif yüklüdür. Bu nedenle, negatif yüklü makromolekülleri kapsüllemek için sıklıkla taşıyıcı olarak kullanılır. Bu çalışmada, izoelektrik noktası 5,3 olan insülini kapsüllemek için kitosan kullanılmıştır. Kitosan kaplama malzemesi olarak kullanıldığından, oranının artmasıyla nanopartiküllerin dış katmanının kalınlığı da buna paralel olarak artar ve bu da daha büyük bir ortalama partikül boyutuna yol açar. Ayrıca, daha yüksek kitosan seviyeleri daha fazla insülini kapsülleyebilir. Bizim durumumuzda, kitosan ve insülin oranı 2,5:1'e ulaştığında kapsülleme verimliliği (EE) en yüksek seviyedeydi ve oran artmaya devam ettiğinde EE'de önemli bir değişiklik olmadı.
Kitosan ve insülin oranının yanı sıra, pH da nanopartiküllerin hazırlanmasında çok önemli bir rol oynamıştır. Gan ve ark. 17, pH'ın kitosan nanopartiküllerinin partikül boyutu üzerindeki etkisini incelemiştir. pH 6,0'a ulaşana kadar partikül boyutunda sürekli bir azalma ve pH > 6,0'da partikül boyutunda önemli bir artış gözlemlemişlerdir ki bu da bizim gözlemlerimizle tutarlıdır. Bu olgu, pH arttıkça insülin molekülünün negatif bir yüzey yükü kazanması ve böylece kitosan/sodyum tripolifosfat (TPP) kompleksi ile elektrostatik etkileşimleri desteklemesi, bunun sonucunda da küçük partikül boyutu ve yüksek EE oluşması nedeniyledir. Bununla birlikte, pH 6,5'e ayarlandığında, kitosan üzerindeki amino grupları deprotonize olur ve bu da kitosan katlanmasına neden olur. Dolayısıyla, yüksek pH, amino iyonlarının TPP ve insüline daha az maruz kalmasına, daha düşük çapraz bağlanmaya, daha büyük nihai ortalama partikül boyutuna ve daha düşük EE'ye yol açar.
Dondurularak kurutulmuş ve püskürtülerek kurutulmuş nanopartiküllerin morfolojik özelliklerinin analizi, daha iyi dehidrasyon ve toz oluşturma tekniklerinin seçimine rehberlik edebilir. Tercih edilen yöntem, ilaç stabilitesi, düzgün partikül şekli, yüksek ilaç yüklemesi ve orijinal çözeltide iyi çözünürlük sağlamalıdır. Bu çalışmada, iki tekniği daha iyi karşılaştırmak için, dehidrasyon sırasında %1 mannitol içeren veya içermeyen insülin nanopartikülleri kullanılmıştır. Mannitol, dondurarak kurutma ve püskürtülerek kurutma için çeşitli kuru toz formülasyonlarında hacim artırıcı veya kriyoprotektan olarak kullanılır. Şekil 2a'da gösterildiği gibi, mannitol içermeyen liyofilize insülin nanopartikülleri için, taramalı elektron mikroskobu (SEM) altında büyük, düzensiz ve pürüzlü yüzeylere sahip oldukça gözenekli bir toz yapısı gözlemlenmiştir. Dehidrasyondan sonra tozda az sayıda ayrık partikül tespit edilmiştir (Şekil 2e). Bu sonuçlar, kriyoprotektan olmadan dondurarak kurutma sırasında nanopartiküllerin çoğunun parçalandığını göstermiştir. %1 mannitol içeren dondurularak kurutulmuş ve püskürtülerek kurutulmuş insülin nanopartikülleri için, küresel nanopartiküller gözlemlenmiştir. Pürüzsüz yüzeylere sahip olanlar gözlemlendi (Şekil 2b,d,f,h). Mannitol olmadan sprey kurutma yöntemiyle elde edilen insülin nanopartikülleri küresel kaldı ancak yüzeylerinde kırışıklıklar oluştu (Şekil 2c). Küresel ve kırışık yüzeyler, aşağıda yer alan salınım davranışı ve hücresel alım testlerinde daha ayrıntılı olarak ele alınmaktadır. Kurutulmuş nanopartiküllerin görünümüne dayanarak, hem mannitol olmadan sprey kurutma yöntemiyle elde edilen nanopartiküller hem de mannitol ile dondurularak kurutulan ve sprey kurutma yöntemiyle elde edilen nanopartiküller ince nanopartikül tozları verdi (Şekil 2f,g,h). Parçacık yüzeyleri arasındaki yüzey alanı ne kadar büyükse, çözünürlük ve dolayısıyla salınım hızı da o kadar yüksek olur.
Farklı dehidrate insülin nanopartiküllerinin morfolojisi: (a) Mannitol içermeyen liyofilize insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüsü; (b) Mannitol içeren liyofilize insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüsü; (c) Mannitol içermeyen sprey kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüsü; (d) Mannitol ile sprey kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüsü; (e) Mannitol içermeyen liyofilize insülin nanopartikül tozunun görüntüsü; (f) Mannitol içeren liyofilize insülin nanopartiküllerinin görüntüsü; (g) Mannitol içermeyen sprey kurutulmuş insülin nanopartikül tozunun görüntüsü; (h) Mannitol içeren sprey kurutulmuş insülin nanopartikül tozunun görüntüsü.
Dondurarak kurutma sırasında mannitol, NP'leri amorf halde tutarak ve buz kristallerinin neden olduğu hasarı önleyerek kriyoprotektan görevi görür.19 Buna karşılık, püskürtmeli kurutma sırasında dondurma aşaması yoktur. Bu nedenle bu yöntemde mannitol gerekli değildir. Aslında, daha önce açıklandığı gibi, mannitol içermeyen püskürtmeli kurutulmuş NP'ler daha ince NP'ler vermiştir. Bununla birlikte, mannitol, NP'lere daha küresel bir yapı kazandırmak için püskürtmeli kurutma işleminde dolgu maddesi olarak işlev görebilir20 (Şekil 2d), bu da bu tür kapsüllenmiş NP'lerin düzgün salınım davranışını elde etmeye yardımcı olur. Ayrıca, hem dondurularak kurutulmuş hem de püskürtmeli kurutulmuş mannitol içeren insülin NP'lerinde bazı büyük parçacıkların tespit edilebildiği açıktır (Şekil 2b,d), bu da mannitolün kapsüllenmiş insülinle birlikte parçacık çekirdeğinde birikmesinden kaynaklanabilir. Kitosan tabakası. Bu çalışmada, dehidrasyon sonrasında küresel yapının bozulmadan kalmasını sağlamak amacıyla mannitol ve kitosan oranının 5:1 olarak tutulduğunu belirtmekte fayda var; böylece büyük miktarda dolgu maddesi, kurutulmuş nanopartiküllerin partikül boyutunu da büyütebilir.
Fourier dönüşümlü kızılötesi zayıflatılmış toplam yansıma (FTIR-ATR) spektroskopisi, serbest insülin, kitosan, kitosan, TPP ve insülinin fiziksel karışımını karakterize etti. Tüm susuzlaştırılmış nanopartiküller, FTIR-ATR spektroskopisi kullanılarak karakterize edildi. Özellikle, mannitol ile dondurularak kurutulmuş kapsüllenmiş nanopartiküllerde ve mannitol ile ve mannitol olmadan püskürtülerek kurutulmuş nanopartiküllerde 1641, 1543 ve 1412 cm-1 bant yoğunlukları gözlemlendi (Şekil 3). Daha önce bildirildiği gibi, bu güç artışları kitosan, TPP ve insülin arasındaki çapraz bağlanma ile ilişkilendirildi. Kitosan ve insülin arasındaki etkileşimin incelenmesi, insülin yüklü kitosan nanopartiküllerinin FTIR spektrumlarında, kitosan bandının insülin bandıyla örtüştüğünü ve karbonil yoğunluğunu (1641 cm-1) ve amin (1543 cm-1) bandını artırdığını gösterdi. TPP'nin tripolifosfat grupları şunlara bağlanır: Kitosandaki amonyum grupları, 1412 cm-1'de bir bant oluşturur.
Serbest insülinin, kitosan'ın, kitosan/TPP/insülin fiziksel karışımlarının ve farklı yöntemlerle susuzlaştırılmış nanopartiküllerin FTIR-ATR spektrumları.
Ayrıca, bu sonuçlar, kapsüllenmiş nanopartiküllerin hem mannitol ile püskürtme hem de dondurarak kurutma yöntemleriyle işlendiğinde bozulmadan kaldığını, ancak mannitol yokluğunda sadece püskürtme kurutma yönteminin kapsüllenmiş partiküller ürettiğini gösteren SEM görüntüleriyle tutarlıdır. Buna karşılık, mannitol olmadan dondurularak kurutulmuş nanopartiküllerin FTIR-ATR spektral sonuçları, kitosan, TPP ve insülinin fiziksel karışımına çok benzerdi. Bu sonuç, kitosan, TPP ve insülin arasındaki çapraz bağların mannitol olmadan dondurularak kurutulmuş nanopartiküllerde artık mevcut olmadığını göstermektedir. Nanopartikül yapısı, kriyoprotektan olmadan dondurarak kurutma sırasında tahrip olmuştur; bu durum SEM sonuçlarında (Şekil 2a) görülebilir. Susuzlaştırılmış insülin nanopartiküllerinin morfolojisi ve FTIR sonuçlarına dayanarak, yeniden yapılandırma deneylerinde sadece liyofilize edilmiş, püskürtme kurutulmuş ve mannitol içermeyen nanopartiküller kullanılmıştır ve mannitol içermeyen nanopartiküllerin bozunması nedeniyle mannitol içermeyen nanopartiküller kullanılmamıştır. Dehidrasyon sırasında nanopartiküller. Tartışın.
Dehidrasyon, uzun süreli depolama ve diğer formülasyonlara yeniden işleme için kullanılır. Kurutulmuş nanopartiküllerin depolama sonrasında yeniden çözünebilme yeteneği, tabletler ve filmler gibi farklı formülasyonlarda kullanımları için kritiktir. Mannitol yokluğunda sprey kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin ortalama partikül boyutunun yeniden çözündürüldükten sonra sadece hafifçe arttığını gözlemledik. Öte yandan, mannitol ile sprey kurutulmuş ve dondurularak kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin partikül boyutu önemli ölçüde arttı (Tablo 1). Bu çalışmada tüm nanopartiküllerin yeniden birleştirilmesinden sonra PDI ve EE'de anlamlı bir değişiklik olmadı (p > 0,05) (Tablo 1). Bu sonuç, partiküllerin çoğunun yeniden çözündürüldükten sonra bozulmadan kaldığını göstermektedir. Bununla birlikte, mannitol ilavesi, liyofilize ve sprey kurutulmuş mannitol nanopartiküllerinin insülin yüklemesinde büyük ölçüde azalmaya neden oldu (Tablo 1). Buna karşılık, mannitol olmadan sprey kurutulmuş nanopartiküllerin insülin yükleme içeriği öncekiyle aynı kaldı (Tablo 1).
İlaç dağıtımında kullanıldığında nanopartiküllerin yüklenmesinin kritik öneme sahip olduğu iyi bilinmektedir. Düşük yüklemeli nanopartiküller için, terapötik eşiğe ulaşmak için çok büyük miktarda malzeme gereklidir. Bununla birlikte, bu kadar yüksek nanopartikül konsantrasyonlarının yüksek viskozitesi, sırasıyla oral uygulama ve enjeksiyon formülasyonlarında sakıncalara ve zorluklara yol açmaktadır. 22 Ayrıca, insülin nanopartikülleri tablet ve viskoz biyofilmler yapmak için de kullanılabilir. 23, 24 Bu da düşük yükleme seviyelerinde büyük miktarda nanopartikül kullanımını gerektirir ve sonuç olarak oral uygulamalar için uygun olmayan büyük tabletler ve kalın biyofilmler oluşur. Bu nedenle, yüksek insülin yüküne sahip susuzlaştırılmış nanopartiküller oldukça arzu edilmektedir. Sonuçlarımız, mannitol içermeyen sprey kurutulmuş nanopartiküllerin yüksek insülin yükünün, bu alternatif dağıtım yöntemleri için birçok cazip avantaj sunabileceğini göstermektedir.
Tüm susuzlaştırılmış nanopartiküller üç ay boyunca buzdolabında saklandı. SEM sonuçları, tüm susuzlaştırılmış nanopartiküllerin morfolojisinin üç aylık depolama süresi boyunca önemli ölçüde değişmediğini gösterdi (Şekil 4). Suda yeniden çözündürüldükten sonra, tüm nanopartiküller EE'de hafif bir azalma gösterdi ve üç aylık depolama süresi boyunca yaklaşık olarak az miktarda (%5) insülin saldı (Tablo 2). Bununla birlikte, tüm nanopartiküllerin ortalama partikül boyutu arttı. Mannitol içermeyen sprey kurutulmuş nanopartiküllerin partikül boyutu 525 nm'ye yükselirken, mannitol içeren sprey kurutulmuş ve dondurularak kurutulmuş nanopartiküllerin partikül boyutları sırasıyla 872 ve 921 nm'ye yükseldi (Tablo 2).
Üç ay boyunca saklanan farklı dehidrate insülin nanopartiküllerinin morfolojisi: (a) Mannitol içeren liyofilize insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüsü; (b) Mannitol içermeyen sprey kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüsü; (c) Mannitol içermeyen sprey kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüleri.
Ayrıca, mannitol ile püskürtmeli kurutma ve dondurarak kurutma işlemine tabi tutulan yeniden oluşturulmuş insülin nanopartiküllerinde çökelmeler gözlemlendi (Şekil S2). Bu durum, büyük parçacıkların suda düzgün bir şekilde süspansiyon halinde kalmamasından kaynaklanıyor olabilir. Yukarıdaki tüm sonuçlar, püskürtmeli kurutma tekniğinin insülin nanopartiküllerini dehidrasyondan koruyabileceğini ve herhangi bir dolgu maddesi veya kriyokoruyucu madde kullanılmadan yüksek miktarda insülin nanopartikülünün elde edilebileceğini göstermektedir.
Dehidrasyon sonrası enzimatik sindirime karşı NP'lerin koruyucu yeteneğini göstermek için, pH = 2,5 ortamında pepsin, tripsin ve α-kimotripsin ile insülin tutulumu test edildi. Dehidrate edilmiş NP'lerin insülin tutulumu, taze hazırlanmış NP'lerinkiyle karşılaştırıldı ve negatif kontrol olarak serbest insülin kullanıldı. Bu çalışmada, serbest insülin, üç enzimatik işlemin tümünde 4 saat içinde hızlı insülin eliminasyonu gösterdi (Şekil 5a-c). Buna karşılık, mannitol ile dondurularak kurutulmuş NP'lerin ve mannitol ile veya mannitol olmadan püskürtülerek kurutulmuş NP'lerin insülin eliminasyon testleri, bu NP'lerin enzimatik sindirime karşı önemli ölçüde daha yüksek koruma sağladığını gösterdi; bu koruma, taze hazırlanmış insülin NP'lerininkine benzerdi (Şekil 1). Pepsin, tripsin ve α-kimotripsin içindeki nanopartiküllerin yardımıyla, sırasıyla 4 saat içinde insülinin %50, %60 ve %75'inden fazlası korunabildi (Şekil 5a-c). 5a–c). Bu insülin koruyucu yetenek, kan dolaşımına daha yüksek insülin emilimi olasılığını artırabilir25. Bu sonuçlar, mannitol ile veya mannitol olmadan sprey kurutma ve mannitol ile dondurarak kurutmanın, dehidrasyondan sonra NP'lerin insülin koruyucu yeteneğini koruyabileceğini göstermektedir.
Susuzlaştırılmış insülin nanopartiküllerinin koruma ve salınım davranışı: (a) pepsin çözeltisinde insülinin korunması; (b) tripsin çözeltisinde insülinin korunması; (c) α-kimotripsin çözeltisinde insülinin korunması; (d) pH = 2,5 çözeltisinde susuzlaştırılmış nanopartiküllerin salınım davranışı; (e) pH = 6,6 çözeltisinde susuzlaştırılmış nanopartiküllerin salınım davranışı; (f) pH = 7,0 çözeltisinde susuzlaştırılmış nanopartiküllerin salınım davranışı.
Yeni hazırlanmış ve yeniden oluşturulmuş kuru insülin nanopartikülleri, insülinin insülin direncine etkisini incelemek amacıyla, mide, onikiparmak bağırsağı ve ince bağırsağın üst kısmının pH ortamını simüle eden çeşitli tampon çözeltilerde (pH = 2,5, 6,6, 7,0) 37 °C'de inkübe edildi. Farklı ortamlardaki salınım davranışı. Gastrointestinal sistemin bir parçası. pH = 2,5'te, insülin yüklü NP'ler ve yeniden çözünmüş kuru insülin NP'leri ilk bir saat içinde ani bir salınım gösterdi, ardından sonraki 5 saat boyunca yavaş bir salınım izledi (Şekil 5d). Başlangıçtaki bu hızlı salınım, büyük olasılıkla, parçacığın iç yapısında tamamen immobilize edilmemiş protein moleküllerinin hızlı yüzey desorpsiyonunun sonucudur. pH = 6,5'te, insülin yüklü NP'ler ve yeniden oluşturulmuş kuru insülin NP'leri, test çözeltisinin pH'ı NP'lerin hazırlandığı çözeltinin pH'ına benzer olduğundan, 6 saat boyunca düzgün ve yavaş bir salınım gösterdi (Şekil 5e). pH = 7'de, NP'ler kararsızdı ve ilk iki saat içinde neredeyse tamamen parçalandı (Şekil 5f). Bunun nedeni, daha yüksek pH'ta kitosanın deprotonasyonunun meydana gelmesi ve bunun da daha az kompakt bir polimer ağına ve yüklü insülinin salınımına yol açmasıdır.
Ayrıca, mannitol kullanılmadan sprey kurutma yöntemiyle elde edilen insülin nanopartikülleri, diğer susuzlaştırılmış nanopartiküllere göre daha hızlı bir salınım profili göstermiştir (Şekil 5d–f). Daha önce açıklandığı gibi, mannitol kullanılmadan kurutulan yeniden oluşturulmuş insülin nanopartikülleri en küçük partikül boyutuna sahipti. Küçük partiküller daha geniş bir yüzey alanı sağlar, bu nedenle ilgili ilacın çoğu partikül yüzeyinde veya yakınında bulunur ve bu da hızlı ilaç salınımına neden olur.
Nanopartiküllerin sitotoksisitesi MTT testi ile araştırıldı. Şekil S4'te gösterildiği gibi, tüm dehidrate nanopartiküllerin 50-500 μg/ml konsantrasyonlarında hücre canlılığı üzerinde önemli bir etkisi olmadığı bulundu; bu da tüm dehidrate nanopartiküllerin terapötik aralığa ulaşmak için güvenle kullanılabileceğini göstermektedir.
Karaciğer, insülinin fizyolojik fonksiyonlarını gösterdiği ana organdır. HepG2 hücreleri, in vitro hepatosit alım modeli olarak yaygın olarak kullanılan bir insan hepatoma hücre hattıdır. Burada, HepG2 hücreleri, dondurarak kurutma ve püskürtmeli kurutma yöntemleri kullanılarak dehidrate edilmiş nanopartiküllerin hücresel alımını değerlendirmek için kullanılmıştır. Hücresel alım, 25 μg/mL konsantrasyonda serbest FITC insülin, taze hazırlanmış FITC insülin yüklü nanopartiküller ve eşit insülin konsantrasyonlarında dehidrate edilmiş FITC insülin yüklü nanopartiküller ile birkaç saatlik inkübasyondan sonra akış sitometrisi ve görüntüleme kullanılarak konfokal lazer tarama ile değerlendirilmiştir. Kantitatif mikroskopi (CLSM) gözlemleri yapılmıştır. Mannitol içermeyen liyofilize nanopartiküller dehidrasyon sırasında tahrip olmuş ve bu testte değerlendirilmemiştir. Taze hazırlanmış insülin yüklü nanopartiküllerin, mannitol içeren liyofilize nanopartiküllerin ve mannitol içeren ve içermeyen püskürtmeli kurutulmuş nanopartiküllerin hücre içi floresans yoğunlukları ölçülmüştür. (Şekil 6a) sırasıyla serbest insüline göre 4,3, 2,6, 2,4 ve 4,1 kat daha yüksekti. FITC-insülin grubu (Şekil 6b). Bu sonuçlar, kapsüllenmiş insülinin, çalışmada üretilen insülin yüklü nanopartiküllerin daha küçük boyutu nedeniyle, serbest insüline göre hücresel alımda daha güçlü olduğunu göstermektedir.
Yeni hazırlanmış NP'ler ve susuzlaştırılmış NP'lerle 4 saatlik inkübasyondan sonra HepG2 hücre alımı: (a) HepG2 hücreleri tarafından FITC-insülin alımının dağılımı. (b) Akış sitometrisi ile analiz edilen floresans yoğunluklarının geometrik ortalaması (n = 3), *P < 0,05 serbest insülin ile karşılaştırıldığında.
Benzer şekilde, CLSM görüntüleri, yeni hazırlanmış FITC-insülin yüklü nanopartiküllerin ve FITC-insülin yüklü sprey kurutulmuş nanopartiküllerin (mannitol içermeyen) FITC floresans yoğunluklarının diğer örneklerden çok daha güçlü olduğunu göstermiştir (Şekil 6a). Ayrıca, mannitol ilavesiyle, çözeltinin daha yüksek viskozitesi hücresel alıma karşı direnci artırarak insülin proliferasyonunun azalmasına neden olmuştur. Bu sonuçlar, mannitol içermeyen sprey kurutulmuş nanopartiküllerin, yeniden çözündürüldükten sonra dondurularak kurutulmuş nanopartiküllere göre daha küçük partikül boyutuna sahip olmaları nedeniyle en yüksek hücresel alım verimliliğini sergilediğini göstermektedir.
Kitin (ortalama moleküler ağırlığı 100 kDa, %75-85 deasetillenmiş) Sigma-Aldrich'ten (Oakville, Ontario, Kanada) satın alındı. Sodyum tripolifosfat (TPP) VWR'den (Radnor, Pennsylvania, ABD) satın alındı. Bu çalışmada kullanılan rekombinant insan insülini Fisher Scientific'ten (Waltham, MA, ABD) temin edildi. Fluorescein izotiyosiyanat (FITC) etiketli insan insülini ve 4′,6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) Sigma-Aldrich'ten (Oakville, Ontario, Kanada) satın alındı. HepG2 hücre hattı ATCC'den (Manassas, Virginia, ABD) elde edildi. Diğer tüm reaktifler analitik veya kromatografik saflıktaydı.
0.1% asetik asit içeren çift damıtılmış suda (DD su) çözerek 1 mg/ml CS çözeltisi hazırlayın. Sırasıyla DD su ve 0.1% asetik asit içinde çözerek 1 mg/ml TPP ve insülin çözeltileri hazırlayın. Ön emülsiyon, bir Polytron PCU-2-110 yüksek hızlı homojenizatör (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ABD) ile hazırlandı. Hazırlama işlemi şu şekildedir: Öncelikle, 4 ml insülin çözeltisine 2 ml TPP çözeltisi eklenir ve karışım 30 dakika boyunca karıştırılarak tamamen homojen hale getirilir. Daha sonra, karışım çözeltisi, yüksek hızlı karıştırma (10.000 rpm) altında bir şırınga yardımıyla damla damla CS çözeltisine eklenir. Karışımlar, 30 dakika boyunca buz banyosunda yüksek hızlı karıştırma (15.000 rpm) altında tutulur ve çapraz bağlı insülin nanopartikülleri elde etmek için belirli bir pH'a ayarlanır. İnsülin nanopartiküllerinin daha da homojenleştirilmesi ve partikül boyutunun küçültülmesi için, Prob tipi bir sonikatör (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Almanya) kullanılarak buz banyosunda 30 dakika daha sonikasyona tabi tutuldu.
İnsülin nanopartikülleri (NPS), 25°C'de saf suda seyreltilerek, Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Avusturya) kullanılarak dinamik ışık saçılımı (DLS) ölçümleriyle Z-ortalama çapı, polidispersite indeksi (PDI) ve zeta potansiyeli açısından test edildi. Morfoloji ve boyut dağılımı, Hitachi H7600 transmisyon elektron mikroskobu (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japonya) ile karakterize edildi ve görüntüler daha sonra Hitachi görüntüleme yazılımı (Hitachi, Tokyo, Japonya) kullanılarak analiz edildi. İnsülin NP'lerinin kapsülleme verimliliğini (EE) ve yükleme kapasitesini (LC) değerlendirmek için, NP'ler 100 kDa moleküler ağırlık kesme sınırına sahip ultrafiltrasyon tüplerine pipetlendi ve 30 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjlendi. Filtrattaki kapsüllenmemiş insülin, dörtlü pompa içeren bir Agilent 1100 Serisi HPLC sistemi (Agilent, Santa Clara, Kaliforniya, ABD) kullanılarak ölçüldü. Otomatik örnekleyici, kolon ısıtıcısı ve DAD dedektörü kullanıldı. İnsülin, bir C18 kolonu (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, ABD) ile analiz edildi ve 214 nm'de tespit edildi. Hareketli faz, %0,1 TFA içeren asetonitril ve sudan oluşuyordu, gradyan oranları 10/90'dan 100/0'a kadar değişiyordu ve 10 dakika süreyle çalıştırıldı. Hareketli faz, 1,0 ml/dakika akış hızında pompalandı. Kolon sıcaklığı 20 °C'ye ayarlandı. Denklem (1) ve Denklem (2) kullanılarak EE ve LC yüzdeleri hesaplandı.
İnsülin nanopartiküllerinin optimizasyonu için 2,0 ile 4,0 arasında değişen çeşitli CS/insülin oranları test edildi. Hazırlık sırasında farklı miktarlarda CS çözeltisi eklenirken, insülin/TPP karışımı sabit tutuldu. Tüm çözeltiler (insülin, TPP ve CS) eklendikten sonra karışımın pH'ı dikkatlice kontrol edilerek, insülin nanopartikülleri 4,0 ile 6,5 pH aralığında hazırlandı. İnsülin nanopartiküllerinin oluşumunu optimize etmek için farklı pH değerlerinde ve CS/insülin kütle oranlarında insülin nanopartiküllerinin EE'si ve partikül boyutu değerlendirildi.
Optimize edilmiş insülin nanopartikülleri alüminyum bir kaba yerleştirildi ve üzeri bir dokuyla kapatılarak bantla sıkıştırıldı. Daha sonra, vidalı kaplar, tepsi kurutucu ile donatılmış bir Labconco FreeZone dondurarak kurutma cihazına (Labconco, Kansas City, MO, ABD) yerleştirildi. Kuru insülin nanopartikülleri elde etmek için sıcaklık ve vakum basıncı ilk 2 saat için -10 °C, 0,350 Torr ve kalan 22 saat için 0 °C ve 0,120 Torr olarak ayarlandı.
Kapsüllenmiş insülin üretmek için Buchi Mini Sprey Kurutucu B-290 (BÜCHI, Flawil, İsviçre) kullanıldı. Seçilen kurutma parametreleri şunlardı: sıcaklık 100 °C, besleme akışı 3 L/dak ve gaz akışı 4 L/dak.
Dehidratasyon öncesi ve sonrası insülin nanopartikülleri, FTIR-ATR spektroskopisi kullanılarak karakterize edildi. Dehidrate edilmiş nanopartiküllerin yanı sıra serbest insülin ve kitosan, evrensel bir ATR örnekleme aksesuarı (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ABD) ile donatılmış bir Spectrum 100 FTIR spektrofotometresi (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ABD) kullanılarak analiz edildi. Sinyal ortalamaları, 4000-600 cm2 frekans aralığında 4 cm2 çözünürlükte 16 taramadan elde edildi.
Kuru insülin nanopartiküllerinin morfolojisi, Helios NanoLab 650 Odaklanmış İyon Demeti Taramalı Elektron Mikroskobu (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, ABD) ile çekilen dondurularak kurutulmuş ve püskürtülerek kurutulmuş insülin nanopartiküllerinin SEM görüntüleri ile değerlendirildi. Kullanılan ana parametreler 5 keV voltaj ve 30 mA akımdı.
Tüm dehidrate edilmiş insülin nanopartikülleri damıtılmış suda yeniden çözüldü. Dehidratasyondan sonra kalitelerini değerlendirmek için daha önce belirtilen aynı yöntem kullanılarak partikül boyutu, PDI, EE ve LC tekrar test edildi. Anhidroinsülin nanopartiküllerinin stabilitesi de uzun süreli depolamadan sonra nanopartiküllerin özelliklerinin test edilmesiyle ölçüldü. Bu çalışmada, dehidratasyondan sonra tüm nanopartiküller üç ay boyunca buzdolabında saklandı. Üç aylık depolamadan sonra, nanopartiküllerin morfolojik partikül boyutu, PDI, EE ve LC özellikleri test edildi.
Dehidrasyon sonrası nanopartiküllerin korunmasında insülinin etkinliğini değerlendirmek için, 5 mL yeniden oluşturulmuş nanopartikül, simüle edilmiş mide sıvısı (pH 1,2, %1 pepsin içeren), bağırsak sıvısı (pH 6,8, %1 tripsin içeren) veya kimotripsin çözeltisi (100 g/mL, fosfat tamponunda, pH 7,8) içeren 45 mL'de çözüldü. 37°C'de 100 rpm'lik bir karıştırma hızıyla inkübe edildiler. Çözeltiden farklı zaman noktalarında 500 μL alındı ​​ve insülin konsantrasyonu HPLC ile belirlendi.
Yeni hazırlanmış ve susuzlaştırılmış insülin nanopartiküllerinin in vitro salınım davranışı, diyaliz torbası yöntemiyle (moleküler ağırlık kesme noktası 100 kDa, Spectra Por Inc.) test edildi. Yeni hazırlanmış ve yeniden sulandırılmış kuru nanopartiküller, sırasıyla mide, duodenum ve üst ince bağırsağın pH ortamını simüle etmek için pH 2,5, pH 6,6 ve pH 7,0 (0,1 M fosfat tamponlu salin, PBS) sıvılarında diyaliz edildi. Tüm örnekler 37 °C'de 200 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edildi. 5 mL'lik diyaliz torbasının dışındaki sıvı aşağıdaki zamanlarda aspire edildi: 0,5, 1, 2, 3, 4 ve 6 saat ve hacim hemen taze diyalizat ile dolduruldu. Sıvıdaki insülin kontaminasyonu HPLC ile analiz edildi ve nanopartiküllerden insülin salınım hızı, salınan serbest insülinin toplam kapsüllenmiş insüline oranından hesaplandı. nanopartiküller (Denklem 3).
İnsan hepatoselüler karsinom hücre hattı HepG2 hücreleri, %10 fetal sığır serumu, 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı (DMEM) kullanılarak 60 mm çaplı kaplarda yetiştirildi29. Kültürler 37°C, %95 bağıl nem ve %5 CO2'de muhafaza edildi. Alım deneyleri için HepG2 hücreleri, 8 kuyucuklu Nunc Lab-Tek oda slayt sistemine (Thermo Fisher, NY, ABD) 1 × 10⁵ hücre/ml yoğunlukta ekildi. Sitotoksisite deneyleri için ise 96 kuyucuklu plakalara (Corning, NY, ABD) 5 × 10⁴ hücre/ml yoğunlukta ekildi.
MTT testi, taze hazırlanmış ve dehidrate edilmiş insülin nanopartiküllerinin sitotoksisitesini değerlendirmek için kullanıldı.30 HepG2 hücreleri, 96 kuyucuklu plaklara 5 × 104 hücre/mL yoğunluğunda ekildi ve testten önce 7 gün boyunca kültüre edildi. İnsülin nanopartikülleri, kültür ortamında çeşitli konsantrasyonlarda (50 ila 500 μg/mL) seyreltildi ve daha sonra hücrelere uygulandı. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreler PBS ile 3 kez yıkandı ve 0,5 mg/ml MTT içeren ortamda 4 saat daha inkübe edildi. Sitotoksisite, Tecan infinite M200 pro spektrofotometre plaka okuyucusu (Tecan, Männedorf, İsviçre) kullanılarak 570 nm'de sarı tetrazolyum MTT'nin mor formazana enzimatik indirgenmesinin ölçülmesiyle değerlendirildi.
Nanopartiküllerin hücresel alım verimliliği, konfokal lazer tarama mikroskobu ve akış sitometrisi analizi ile test edildi. Nunc Lab-Tek oda slayt sisteminin her bir kuyucuğuna serbest FITC-insülin, FITC-insülin yüklü nanopartiküller ve aynı konsantrasyonda 25 μg/mL susuzlaştırılmış FITC-insülin nanopartikülleri uygulandı ve 4 saat inkübe edildi. Hücreler PBS ile 3 kez yıkandı ve %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Çekirdekler 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyandı. İnsülin lokalizasyonu, Olympus FV1000 lazer tarama/iki fotonlu konfokal mikroskop (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japonya) kullanılarak gözlemlendi. Akış sitometrisi analizi için, aynı konsantrasyonlarda 10 μg/mL serbest FITC-insülin, FITC-insülin yüklü nanopartiküller ve yeniden çözünmüş dehidrate FITC-insülin nanopartikülleri, HepG2 hücreleriyle ekilen 96 kuyucuklu plakalara eklendi ve 4 saat inkübe edildi. 4 saatlik inkübasyondan sonra hücreler uzaklaştırıldı ve FBS ile 3 kez yıkandı. Her örnekten 5 × 10⁴ hücre, BD LSR II akış sitometresi (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Amerika Birleşik Devletleri) ile analiz edildi.
Tüm değerler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir. Tüm gruplar arasındaki karşılaştırmalar, IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, ABD) kullanılarak tek yönlü ANOVA veya t-testi ile değerlendirilmiş ve p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Bu çalışma, çapraz bağlı kitosan/TPP/insülin nanopartiküllerinin dehidratasyonunda sprey kurutmanın esnekliğini ve yeteneğini, hacim artırıcı maddeler veya kriyoprotektanlar kullanan standart dondurarak kurutma yöntemlerine kıyasla daha iyi yeniden çözünme kapasitesi ve daha yüksek yükleme kapasitesi ile göstermektedir. Optimize edilmiş insülin nanopartikülleri, ortalama 318 nm partikül boyutu ve %99,4 kapsülleme verimliliği sağlamıştır. Dehidratasyondan sonraki SEM ve FTIR sonuçları, küresel yapının yalnızca mannitol içeren ve içermeyen sprey kurutulmuş nanopartiküllerde ve mannitol ile liyofilize edilmiş nanopartiküllerde korunduğunu, ancak mannitol içermeyen liyofilize nanopartiküllerin dehidratasyon sırasında parçalandığını göstermiştir. Yeniden çözünme yeteneği testinde, mannitol içermeyen sprey kurutulmuş insülin nanopartikülleri en küçük ortalama partikül boyutunu ve yeniden çözünme üzerine en yüksek yüklemeyi göstermiştir. Tüm bu dehidrate edilmiş nanopartiküllerin salınım davranışları, pH = 2,5 ve pH = 7 çözeltilerinde hızla salındıklarını ve pH = 7 çözeltisinde çok kararlı olduklarını göstermiştir. 6.5. Diğer yeniden çözülmüş susuzlaştırılmış nanopartiküllere kıyasla, mannitol içermeyen sprey kurutma yöntemiyle elde edilen nanopartiküller en hızlı salınımı göstermiştir. Bu sonuç, hücresel alım deneyinde gözlemlenenle tutarlıdır; çünkü mannitol içermeyen sprey kurutma yöntemiyle elde edilen nanopartiküller, taze hazırlanmış nanopartiküllerin hücresel alım verimliliğini neredeyse tamamen korumuştur. Bu sonuçlar, mannitol içermeyen sprey kurutma yöntemiyle hazırlanan kuru insülin nanopartiküllerinin, oral tabletler veya biyoadhezif filmler gibi diğer susuz dozaj formlarına dönüştürülmek üzere en uygun olduğunu göstermektedir.
Fikri mülkiyet sorunları nedeniyle, bu çalışma sırasında oluşturulan ve/veya analiz edilen veri kümeleri kamuya açık değildir, ancak makul bir talep üzerine ilgili yazarlardan temin edilebilir.
Kagan, A. Tip 2 diyabet: sosyal ve bilimsel kökenleri, tıbbi komplikasyonları ve hastalar ve diğerleri için sonuçları. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. İnsülin kapsüllemesinin gelişimi: ağızdan uygulama artık mümkün mü? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Diyabet tedavisinde oral insülin yüklü lipozom dağıtım sistemlerinde son gelişmeler. Yorumlama. Eczacılık Dergisi. 549, 201–217 (2018).