Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi sonuçlar için, tarayıcınızın daha yeni bir sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stil veya JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Propiyonik asit (PPA), otizm spektrum bozukluğu gibi nörogelişimsel bozukluklarda mitokondriyal disfonksiyonun rolünü incelemek için kullanılır. PPA'nın mitokondriyal biyogenezi, metabolizmayı ve dönüşümü bozduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, PPA'nın mitokondriyal dinamikler, bölünme ve birleşme üzerindeki etkileri, bu mekanizmaların karmaşık zamansal doğası nedeniyle sorunlu olmaya devam etmektedir. Burada, PPA'nın nöron benzeri SH-SY5Y hücrelerinde mitokondriyal ultrastrüktürü, morfolojiyi ve dinamikleri nasıl etkilediğini araştırmak için tamamlayıcı kantitatif görüntüleme teknikleri kullanıyoruz. PPA (5 mM), mitokondriyal alanda (p < 0,01), Feret çapında ve çevresinde (p < 0,05) ve alan 2'de (p < 0,01) önemli bir azalmaya neden oldu. Mitokondriyal olay konumlandırıcı analizi, bölünme ve birleşme olaylarında önemli bir artış (p < 0,05) göstererek, stres koşulları altında mitokondriyal ağın bütünlüğünü korudu. Ek olarak, cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) ve OPA1 (p < 0,05) mRNA ekspresyonu önemli ölçüde azalmıştır. Bu, stres koşulları altında fonksiyonu korumak için mitokondriyal morfoloji, biyogenez ve dinamiklerin yeniden şekillenmesini göstermektedir. Verilerimiz, PPA'nın mitokondriyal dinamikler üzerindeki etkilerine dair yeni bir bakış açısı sunmakta ve mitokondriyal stres tepkilerinde yer alan karmaşık düzenleyici mekanizmaları incelemek için görüntüleme tekniklerinin faydasını vurgulamaktadır.
Mitokondriler, enerji üretimi ve biyosentezdeki tipik rollerinin ötesinde, çeşitli hücresel işlevlerde ayrılmaz birer katılımcıdır. Mitokondriyal metabolizma, kalsiyum sinyallemesi, metabolik ve redoks homeostazı, inflamatuar sinyalleme, epigenetik modifikasyonlar, hücre proliferasyonu, farklılaşma ve programlanmış hücre ölümü gibi süreçlerin temel bir düzenleyicisidir. Özellikle, mitokondriyal metabolizma nöronal gelişim, hayatta kalma ve işlev için kritik öneme sahiptir ve nöropatolojinin çeşitli tezahürlerinde yaygın olarak rol oynamaktadır.
Son on yılda, metabolik durum nörogenez, farklılaşma, olgunlaşma ve plastisitenin merkezi bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır5,6. Son zamanlarda, mitokondriyal morfoloji ve dinamikler, hücreler içinde sağlıklı mitokondri havuzunu koruyan dinamik bir süreç olan mitozun özellikle önemli bileşenleri haline gelmiştir. Mitokondriyal dinamikler, mitokondriyal biyogenez ve biyoeenerjiden mitokondriyal bölünme, birleşme, taşıma ve temizlenmeye kadar uzanan karmaşık, birbirine bağımlı yollarla düzenlenir7,8. Bu bütünleştirici mekanizmalardan herhangi birinin bozulması, sağlıklı mitokondriyal ağların korunmasını engeller ve nörogelişim için derin fonksiyonel sonuçlar doğurur9,10. Gerçekten de, mitokondriyal dinamiklerin düzensizliği, otizm spektrum bozuklukları (ASD) dahil olmak üzere birçok psikiyatrik, nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozuklukta gözlenmektedir11,12.
Otizm spektrum bozukluğu (ASD), karmaşık genetik ve epigenetik mimariye sahip heterojen bir nörogelişimsel bozukluktur. ASD'nin kalıtsallığı tartışmasızdır, ancak altta yatan moleküler etiyoloji hala yetersiz anlaşılmıştır. Klinik öncesi modellerden, klinik çalışmalardan ve çoklu omik moleküler veri kümelerinden elde edilen veriler, ASD'de mitokondriyal disfonksiyona dair artan kanıtlar sunmaktadır13,14. Daha önce, ASD'li bir hasta kohortunda genom çapında bir DNA metilasyon taraması gerçekleştirdik ve mitokondriyal metabolik yollar boyunca kümelenmiş farklı metillenmiş genleri belirledik15. Daha sonra, mitokondriyal biyogenez ve dinamiklerin merkezi düzenleyicilerinin farklı metilasyonunu bildirdik; bu durum, ASD'de artmış mtDNA kopya sayısı ve değişmiş idrar metabolik profili ile ilişkilendirilmiştir16. Verilerimiz, mitokondriyal dinamiklerin ve homeostazın ASD'nin patofizyolojisinde merkezi bir rol oynadığına dair artan kanıtlar sunmaktadır. Bu nedenle, mitokondriyal dinamikler, morfoloji ve işlev arasındaki ilişkinin mekanistik anlayışını geliştirmek, ikincil mitokondriyal disfonksiyonla karakterize nörolojik hastalıklar üzerine devam eden araştırmaların temel hedeflerinden biridir.
Moleküler teknikler, mitokondriyal stres yanıtlarında belirli genlerin rolünü incelemek için sıklıkla kullanılır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, mitotik kontrol mekanizmalarının çok yönlü ve zamansal doğası nedeniyle sınırlı olabilir. Dahası, mitokondriyal genlerin farklı ifadesi, özellikle tipik olarak yalnızca sınırlı sayıda gen analiz edildiğinden, fonksiyonel değişikliklerin dolaylı bir göstergesidir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon ve biyoeenerjiyi incelemek için daha doğrudan yöntemler önerilmiştir¹⁷. Mitokondriyal morfoloji, mitokondriyal dinamiklerle yakından ilişkilidir. Mitokondriyal şekil, bağlantı ve yapı, enerji üretimi ve mitokondriyal ve hücre sağkalımı için kritiktir⁵,¹⁸. Ayrıca, mitozun çeşitli bileşenleri, mitokondriyal disfonksiyonun yararlı uç noktaları olarak hizmet edebilecek ve sonraki mekanistik çalışmalar için bir temel sağlayabilecek mitokondriyal morfolojideki değişikliklere odaklanır.
Mitokondriyal morfoloji, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak doğrudan gözlemlenebilir ve bu da hücresel ultrastrüktürün ayrıntılı incelenmesine olanak tanır. TEM, hücre popülasyonlarında yalnızca gen transkripsiyonuna, protein ekspresyonuna veya mitokondriyal fonksiyonel parametrelere dayanmak yerine, mitokondriyal kristaların morfolojisini, şeklini ve yapısını bireysel mitokondri çözünürlüğünde doğrudan görselleştirir17,19,20. Ek olarak, TEM, mitokondriyal fonksiyon ve homeostazda önemli roller oynayan endoplazmik retikulum ve otofagozomlar gibi diğer organellerle mitokondriler arasındaki etkileşimlerin incelenmesini kolaylaştırır21,22. Bu nedenle, TEM, belirli yollara veya genlere odaklanmadan önce mitokondriyal disfonksiyonu incelemek için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Mitokondriyal fonksiyon nöropatoloji için giderek daha önemli hale geldikçe, in vitro nöronal modellerde mitokondriyal morfoloji ve dinamikleri doğrudan ve niceliksel olarak inceleyebilme ihtiyacı açıkça ortaya çıkmaktadır.
Bu makalede, otizm spektrum bozukluğunda mitokondriyal disfonksiyonun nöronal bir modelinde mitokondriyal dinamikleri inceliyoruz. Daha önce, mitokondriyal propionil-CoA karboksilaz enzimi PCC'nin bir alt birimi olan propionil-CoA karboksilaz beta'nın (PCCB) ASD15'te farklı metilasyonunu bildirmiştik. PCC'nin düzensizliğinin, propiyonik asit (PPA)23,24,25 dahil olmak üzere propionil türevlerinin toksik birikimine neden olduğu bilinmektedir. PPA'nın nöronal metabolizmayı bozduğu ve in vivo olarak davranışı değiştirdiği gösterilmiştir ve ASD'de yer alan nörogelişimsel mekanizmaları incelemek için yerleşik bir hayvan modelidir26,27,28. Ek olarak, PPA'nın in vitro olarak mitokondriyal membran potansiyelini, biyogenezi ve solunumu bozduğu bildirilmiştir ve nöronlarda mitokondriyal disfonksiyonu modellemek için yaygın olarak kullanılmıştır29,30. Ancak, PPA'nın neden olduğu mitokondriyal disfonksiyonun mitokondriyal morfoloji ve dinamikler üzerindeki etkisi hala yeterince anlaşılamamıştır.
Bu çalışma, SH-SY5Y hücrelerinde PPA'nın mitokondriyal morfoloji, dinamik ve fonksiyon üzerindeki etkilerini nicelleştirmek için tamamlayıcı görüntüleme teknikleri kullanmaktadır. İlk olarak, mitokondriyal morfoloji ve ultrastrüktürdeki değişiklikleri görselleştirmek için bir TEM yöntemi geliştirdik17,31,32. Mitokondrilerin dinamik doğası göz önüne alındığında33, PPA stresi altında bölünme ve birleşme olayları arasındaki dengedeki, mitokondriyal sayı ve hacimdeki değişiklikleri nicelleştirmek için mitokondriyal olay lokalizasyon (MEL) analizini de kullandık. Son olarak, mitokondriyal morfoloji ve dinamiklerin, biyogenez, bölünme ve birleşmede yer alan genlerin ekspresyonundaki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını inceledik. Verilerimiz, mitokondriyal dinamikleri düzenleyen mekanizmaların karmaşıklığını aydınlatmanın zorluğunu göstermektedir. SH-SY5Y hücrelerinde mitozun ölçülebilir bir yakınsak son noktası olarak mitokondriyal morfolojiyi incelemede TEM'in faydasını vurguluyoruz. Ek olarak, TEM verilerinin, metabolik strese yanıt olarak dinamik olayları da yakalayan görüntüleme teknikleriyle birleştirildiğinde en zengin bilgiyi sağladığını vurguluyoruz. Nöronal hücre mitozunu destekleyen moleküler düzenleyici mekanizmaların daha ayrıntılı karakterizasyonu, sinir sistemi ve nörodejeneratif hastalıkların mitokondriyal bileşenine ilişkin önemli bilgiler sağlayabilir.
Mitokondriyal stresi indüklemek için, SH-SY5Y hücreleri 3 mM ve 5 mM sodyum propiyonat (NaP) kullanılarak PPA ile muamele edildi. TEM'den önce, örnekler yüksek basınçlı dondurma ve dondurma kullanılarak kriyojenik örnek hazırlama işlemine tabi tutuldu (Şekil 1a). Üç biyolojik tekrarda mitokondriyal popülasyonların sekiz morfolojik parametresini ölçmek için otomatik bir mitokondriyal görüntü analiz hattı geliştirdik. PPA tedavisinin dört parametreyi önemli ölçüde değiştirdiğini bulduk: alan 2, alan, çevre ve Feret çapı (Şekil 1b-e). Alan 2, hem 3 mM hem de 5 mM PPA tedavisiyle önemli ölçüde azaldı (sırasıyla p = 0,0183 ve p = 0,002) (Şekil 1b), alan (p = 0,003), çevre (p = 0,0106) ve Feret çapı da önemli ölçüde azaldı. 5 mM tedavi grubunda kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir azalma (p = 0,0172) gözlemlendi (Şekil 1c–e). Alan ve çevrede gözlemlenen anlamlı azalmalar, 5 mM PPA ile tedavi edilen hücrelerin daha küçük, daha yuvarlak mitokondrilere sahip olduğunu ve bu mitokondrilerin kontrol hücrelerindekilere göre daha az uzamış olduğunu gösterdi. Bu durum, parçacık kenarları arasındaki en büyük mesafenin azaldığını gösteren bağımsız bir parametre olan Feret çapındaki anlamlı azalma ile de tutarlıdır. Kristaların ultrastrüktüründe değişiklikler gözlemlendi: kristalar, PPA stresi altında daha az belirgin hale geldi (Şekil 1a, panel B). Bununla birlikte, tüm görüntüler kristaların ultrastrüktürünü açıkça yansıtmadığı için bu değişikliklerin nicel bir analizi yapılmadı. Bu TEM verileri üç olası senaryoyu yansıtabilir: (1) PPA, bölünmeyi artırır veya birleşmeyi engeller ve mevcut mitokondrilerin boyutunun küçülmesine neden olur; (2) artırılmış biyogenez yeni, daha küçük mitokondriler oluşturur veya (3) her iki mekanizmayı aynı anda tetikler. Bu koşullar TEM ile ayırt edilemese de, önemli morfolojik değişiklikler, PPA stresi altında mitokondriyal homeostaz ve dinamiklerdeki değişiklikleri gösterir. Daha sonra, bu dinamikleri ve altta yatan potansiyel mekanizmaları daha ayrıntılı olarak karakterize etmek için ek parametreler araştırdık.
Propiyonik asit (PPA), mitokondriyal morfolojiyi yeniden şekillendirir. (a) Artan PPA tedavisiyle mitokondri boyutunun azaldığını ve mitokondrilerin daha küçük ve daha yuvarlak hale geldiğini gösteren temsili transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri; sırasıyla 0 mM (işlem görmemiş), 3 mM ve 5 mM. Kırmızı oklar mitokondrileri göstermektedir. (b–e) 24 saat boyunca PPA ile muamele edilen SH-SY5Y hücreleri TEM için hazırlandı ve sonuçlar Fiji/ImageJ kullanılarak analiz edildi. Sekiz parametreden dördü, kontrol (işlem görmemiş, 0 mM PPA) ve muamele edilmiş (3 mM ve 5 mM PPA) hücreler arasında anlamlı farklılıklar gösterdi. (b) Bölge 2, (c) Alan, (d) Çevre, (e) Feret çapı. Anlamlı farklılıkları belirlemek için tek yönlü varyans analizi (kontrol vs. tedavi) ve Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi kullanıldı (p < 0,05). Veri noktaları, her bir hücre için ortalama mitokondriyal değeri temsil eder ve hata çubukları ortalama ± standart hata (SEM) değerini gösterir. Gösterilen veriler n = 3, tekrar başına en az 24 hücreyi temsil eder; toplam 266 görüntü analiz edildi; * p < 0,05, ** p < 0,01 anlamına gelir.
Mitokondriyal dinamiklerin PPA'ya nasıl tepki verdiğini daha ayrıntılı olarak karakterize etmek için, mitokondrileri tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ile boyadık ve 3 ve 5 mM PPA'da 24 saat sonra mitokondrileri lokalize etmek ve nicelendirmek için zaman atlamalı mikroskopi ve MEL analizini kullandık. Bölünme ve birleşme olaylarının tedavisi. (Şekil 2a). MEL analizinden sonra, mitokondriyal yapıların sayısını ve ortalama hacimlerini nicelendirmek için mitokondriler daha ayrıntılı olarak analiz edildi. 3 mM'de meydana gelen fisyon olaylarının sayısında küçük ama anlamlı bir artış gözlemledik [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)], kontrol grubuna kıyasla fisyon [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] ve füzyon [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] olaylarında da anlamlı bir artış görüldü (Şekil 3b). Mitokondri sayısı hem 3 mM [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] hem de 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] konsantrasyonlarında anlamlı derecede artarken (Şekil 3c), her bir mitokondriyal yapının ortalama hacmi değişmeden kaldı (Şekil 3c, 3d). Bu bulgular birlikte ele alındığında, mitokondriyal dinamiklerin yeniden şekillenmesinin, mitokondriyal ağın bütünlüğünü başarıyla koruyan telafi edici bir yanıt görevi gördüğünü düşündürmektedir. 3 mM PPA'da bölünme olaylarının sayısındaki artış, mitokondri sayısındaki artışın kısmen mitokondriyal bölünmeden kaynaklandığını düşündürmektedir, ancak ortalama mitokondriyal hacmin esasen değişmeden kalması göz önüne alındığında, biyogenez ek bir telafi edici yanıt olarak göz ardı edilemez. Ancak bu veriler, TEM ile gözlemlenen daha küçük, yuvarlak mitokondriyal yapılarla tutarlıdır ve ayrıca PPA'nın neden olduğu mitokondriyal dinamiklerdeki önemli değişiklikleri de göstermektedir.
Propiyonik asit (PPA), ağ bütünlüğünü korumak için dinamik mitokondriyal yeniden yapılanmayı indükler. SH-SY5Y hücreleri kültüre edildi, 24 saat boyunca 3 ve 5 mM PPA ile muamele edildi ve TMRE ve Hoechst 33342 ile boyandıktan sonra MEL analizi yapıldı. (a) Her koşul için 2. zamanda (t2) renkli ve ikili maksimum yoğunluk projeksiyonlarını gösteren temsili zaman atlamalı mikroskopi görüntüleri. Her ikili görüntüde belirtilen seçili bölgeler, zaman içindeki dinamikleri göstermek için üç farklı zaman diliminde (t1-t3) 3 boyutlu olarak geliştirilmiş ve görüntülenmiştir; füzyon olayları yeşil renkle vurgulanmıştır; bölünme olayları kırmızı renkle vurgulanmıştır. (b) Koşul başına ortalama dinamik olay sayısı. (c) Hücre başına ortalama mitokondriyal yapı sayısı. (d) Hücre başına her mitokondriyal yapının ortalama hacmi (µm3). Gösterilen veriler, tedavi grubu başına n = 15 hücreyi temsil etmektedir. Gösterilen hata çubukları ortalama ± standart hata (SEM) değerlerini temsil eder, ölçek çubuğu = 10 μm, * p < 0,05.
Propiyonik asit (PPA), mitokondriyal dinamiklerle ilişkili genlerin transkripsiyonel baskılanmasına neden olur. SH-SY5Y hücreleri 24 saat boyunca 3 ve 5 mM PPA ile muamele edildi. Göreceli gen kantifikasyonu RT-qPCR kullanılarak yapıldı ve B2M'ye normalize edildi. Mitokondriyal biyogenez genleri (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ve (d) NFE2L2. Mitokondriyal füzyon ve bölünme genleri (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ve (i) DRP1. Anlamlı farklılıklar (p < 0,05), tek yönlü ANOVA (kontrol vs. tedavi) ve Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak test edildi: * p < 0,05, ** p < 0,01 ve **** p < 0,0001 anlamına gelir. Çubuklar ortalama ifade ± SEM'i temsil eder. Gösterilen veriler n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) ve n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biyolojik tekrarı temsil eder.
TEM ve MEL analizlerinden elde edilen veriler birlikte, PPA'nın mitokondriyal morfoloji ve dinamikleri değiştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu görüntüleme teknikleri, bu süreçleri yönlendiren altta yatan mekanizmalar hakkında bilgi vermemektedir. Bu nedenle, PPA tedavisine yanıt olarak mitokondriyal dinamiklerin, biyogenezin ve mitozun dokuz temel düzenleyicisinin mRNA ekspresyonunu inceledik. 3 mM ve 5 mM PPA ile 24 saatlik tedaviden sonra hücre miyelom onkogeni (cMYC), nükleer solunum faktörü (NRF1), mitokondriyal transkripsiyon faktörü 1 (TFAM), NFE2 benzeri transkripsiyon faktörü BZIP (NFE2L2), gastrin benzeri protein 2 (STOML2), optik sinir atrofisi 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) ve dinamik ilişkili protein 1'i (DRP1) ölçtük. 3 mM (sırasıyla p = 0,0053, p = 0,0415 ve p < 0,0001) ve 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA tedavisini gözlemledik (Şekil 3a–c). mRNA ekspresyonundaki azalma doza bağımlıydı: cMYC, NRF1 ve TFAM'ın ekspresyonu 3 mM'de sırasıyla 5,7, 2,6 ve 1,9 kat, 5 mM'de ise 11,2, 3 ve 2,2 kat azaldı. Buna karşılık, merkezi redoks biyogenez geni NFE2L2, benzer bir doza bağımlı azalma eğilimi gözlemlenmesine rağmen, PPA'nın hiçbir konsantrasyonunda değişmedi (Şekil 3d).
Ayrıca, bölünme ve birleşmenin düzenlenmesinde rol oynayan klasik genlerin ekspresyonunu da inceledik. STOML2'nin birleşme, mitofaji ve biyogenezde rol oynadığı düşünülmektedir ve ekspresyonu 3 mM (2,4 kat değişim) ve 5 mM (2,8 kat değişim) PPA ile önemli ölçüde azalmıştır (p < 0,0001) (Şekil 1). 3d). Benzer şekilde, OPA1 füzyon geni ekspresyonu 3 mM (1,6 kat değişim) ve 5 mM (1,9 kat değişim) PPA'da azalmıştır (sırasıyla p = 0,006 ve p = 0,0024) (Şekil 3f). Bununla birlikte, 24 saatlik PPA stresi altında füzyon genleri MFN1, MFN2 veya bölünme geni DRP1'in ekspresyonunda anlamlı farklılıklar bulamadık (Şekil 3g-i). Ek olarak, dört füzyon ve fisyon proteininin (OPA1, MFN1, MFN2 ve DRP1) seviyelerinin aynı koşullar altında değişmediğini bulduk (Şekil 4a–d). Bu verilerin tek bir zaman noktasını yansıttığını ve PPA stresinin erken aşamalarındaki protein ekspresyonu veya aktivite seviyelerindeki değişiklikleri yansıtmayabileceğini belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ve OPA1 ekspresyonundaki önemli azalmalar, mitokondriyal metabolizma, biyogenez ve dinamiklerin önemli transkripsiyonel düzensizliğini göstermektedir. Ayrıca, bu veriler, mitokondriyal fonksiyondaki son durum değişikliklerini doğrudan incelemek için görüntüleme tekniklerinin faydasını vurgulamaktadır.
Propiyonik asit (PPA) tedavisi sonrasında füzyon ve fisyon faktörü protein seviyelerinde değişiklik gözlenmedi. SH-SY5Y hücreleri 24 saat boyunca 3 ve 5 mM PPA ile muamele edildi. Protein seviyeleri Western blot analizi ile ölçüldü ve ekspresyon seviyeleri toplam proteine ​​göre normalize edildi. Ortalama protein ekspresyonu ve hedef ve toplam proteinin temsili Western blot görüntüleri gösterilmiştir. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Çubuklar ortalama ± SEM'i temsil eder ve gösterilen veriler n = 3 biyolojik tekrarın temsilidir. Çoklu karşılaştırmalar (p < 0,05) tek yönlü varyans analizi ve Dunnett testi kullanılarak yapıldı. Orijinal jel ve blot Şekil S1'de gösterilmiştir.
Mitokondriyal disfonksiyon, metabolik, kardiyovasküler ve kas hastalıklarından nörolojik hastalıklara kadar uzanan çoklu sistem hastalıklarıyla ilişkilidir1,10. Birçok nörodejeneratif ve nörodejeneratif hastalık, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkilidir ve bu organellerin beynin yaşam döngüsü boyunca önemini vurgulamaktadır. Bu hastalıklar arasında Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve ASD3,4,18 yer almaktadır. Bununla birlikte, bu hastalıkları incelemek için beyin dokusuna erişim, özellikle mekanistik düzeyde zordur ve bu da hücresel model sistemlerini gerekli bir alternatif haline getirmektedir. Bu çalışmada, nöronal hastalıklarda, özellikle otizm spektrum bozukluklarında gözlemlenen mitokondriyal disfonksiyonu yeniden oluşturmak için PPA ile tedavi edilmiş SH-SY5Y hücreleri kullanan bir hücresel model sistemi kullanıyoruz. Nöronlardaki mitokondriyal dinamikleri incelemek için bu PPA modelini kullanmak, ASD'nin etiyolojisine dair fikir verebilir.
Mitokondriyal morfolojideki değişiklikleri görüntülemek için TEM kullanma olasılığını araştırdık. Etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için TEM'in doğru şekilde kullanılması gerektiğini belirtmek önemlidir. Kriyojenik örneklerin hazırlanması, hücresel bileşenleri eş zamanlı olarak sabitleyerek ve artefakt oluşumunu azaltarak nöronal yapıların daha iyi korunmasını sağlar34. Buna uygun olarak, nöron benzeri SH-SY5Y hücrelerinin sağlam hücre altı organellerine ve uzamış mitokondrilere sahip olduğunu gözlemledik (Şekil 1a). Bu, nöronal hücre modellerinde mitokondriyal morfolojiyi incelemek için kriyojenik hazırlama tekniklerinin faydasını vurgulamaktadır. TEM verilerinin objektif analizi için nicel ölçümler kritik olsa da, mitokondriyal morfolojik değişiklikleri doğrulamak için hangi spesifik parametrelerin ölçülmesi gerektiği konusunda hala bir fikir birliği yoktur. Mitokondriyal morfolojiyi niceliksel olarak inceleyen çok sayıda çalışmaya dayanarak17,31,32, sekiz morfolojik parametreyi ölçen otomatik bir mitokondriyal görüntü analiz hattı geliştirdik: alan, alan2, en boy oranı, çevre, dairesellik, derece, Feret çapı ve yuvarlaklık.
Bunlar arasında PPA, alan 2, alan, çevre ve Feret çapını önemli ölçüde azalttı (Şekil 1b–e). Bu, mitokondrilerin daha küçük ve daha yuvarlak hale geldiğini gösterdi; bu da PPA30 kaynaklı mitokondriyal stresin 72 saat sonrasında mitokondriyal alanda azalma gösteren önceki çalışmalarla tutarlıdır. Bu morfolojik özellikler, hasarlı bileşenleri mitokondriyal ağdan ayırmak ve mitofaji yoluyla parçalanmalarını teşvik etmek için gerekli bir süreç olan mitokondriyal bölünmeyi gösterebilir35,36,37. Öte yandan, ortalama mitokondriyal boyuttaki azalma, küçük yeni mitokondrilerin oluşumuyla sonuçlanan artmış biyogenezle ilişkili olabilir. Artmış bölünme veya biyogenez, mitokondriyal strese karşı mitozu sürdürmek için telafi edici bir yanıtı temsil eder. Bununla birlikte, azalmış mitokondriyal büyüme, bozulmuş füzyon veya diğer koşullar göz ardı edilemez.
TEM ile oluşturulan yüksek çözünürlüklü görüntüler, bireysel mitokondri düzeyinde morfolojik özelliklerin belirlenmesine olanak sağlasa da, bu yöntem tek bir zaman noktasında iki boyutlu anlık görüntüler üretir. Metabolik strese karşı dinamik yanıtları incelemek için, mitokondrileri TMRE ile boyadık ve zaman içinde mitokondriyal ağdaki değişikliklerin yüksek verimli 3 boyutlu görselleştirilmesine olanak sağlayan MEL analizi ile zaman atlamalı mikroskopi kullandık33,38. PPA stresi altında mitokondriyal dinamiklerde ince ama önemli değişiklikler gözlemledik (Şekil 2). 3 mM'de, bölünme olaylarının sayısı önemli ölçüde artarken, birleşme olayları kontroldekiyle aynı kaldı. 5 mM PPA'da hem bölünme hem de birleşme olaylarının sayısında bir artış gözlemlendi, ancak bu değişiklikler yaklaşık olarak orantılıydı, bu da bölünme ve birleşme kinetiğinin daha yüksek konsantrasyonlarda dengeye ulaştığını düşündürmektedir (Şekil 2b). Ortalama mitokondri hacmi hem 3 hem de 5 mM PPA'da değişmeden kaldı, bu da mitokondri ağının bütünlüğünün korunduğunu gösteriyor (Şekil 2d). Bu, dinamik mitokondri ağlarının, ağ parçalanmasına neden olmadan homeostazı etkili bir şekilde korumak için hafif metabolik strese yanıt verme yeteneğini yansıtır. 3 mM PPA'da, bölünmedeki artış yeni bir dengeye geçişi teşvik etmek için yeterlidir, ancak daha yüksek PPA konsantrasyonlarının neden olduğu strese yanıt olarak daha derin kinetik yeniden yapılanma gereklidir.
Her iki PPA stres konsantrasyonunda da mitokondri sayısı arttı, ancak ortalama mitokondri hacmi önemli ölçüde değişmedi (Şekil 2c). Bu, artan biyogenez veya artan bölünmeden kaynaklanıyor olabilir; ancak, ortalama mitokondri hacminde önemli bir azalma olmaması durumunda, biyosentezin artması daha olasıdır. Bununla birlikte, Şekil 2'deki veriler iki telafi mekanizmasının varlığını desteklemektedir: mitokondriyal bölünmenin yukarı regülasyonuyla tutarlı olarak bölünme olaylarının sayısında bir artış ve mitokondriyal biyogenezle tutarlı olarak olay sayısında bir artış. Sonuç olarak, hafif stres için dinamik telafi, bölünme, birleşme, biyogenez ve mitofaji içeren eş zamanlı süreçlerden oluşabilir. Önceki yazarlar PPA'nın mitozu30,39 ve mitofajiyi29 artırdığını göstermiş olsa da, biz PPA'ya yanıt olarak mitokondriyal bölünme ve birleşme dinamiklerinin yeniden şekillenmesine dair kanıt sunuyoruz. Bu veriler, TEM ile gözlemlenen morfolojik değişiklikleri doğrulamakta ve PPA kaynaklı mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili mekanizmalara dair daha fazla bilgi sağlamaktadır.
TEM ve MEL analizlerinin gözlemlenen morfolojik değişikliklerin altında yatan gen düzenleyici mekanizmalara dair doğrudan kanıt sağlamaması nedeniyle, mitokondriyal metabolizma, biyogenez ve dinamiklerde rol alan genlerin RNA ekspresyonunu inceledik. cMYC proto-onkogeni, mitokondri, glikoliz, amino asit ve yağ asidi metabolizmasının düzenlenmesinde rol alan bir transkripsiyon faktörüdür40. Ek olarak, cMYC'nin, NRF1 ve TFAM41 dahil olmak üzere mitokondriyal transkripsiyon, translasyon ve kompleks montajında ​​rol alan yaklaşık 600 mitokondriyal genin ekspresyonunu düzenlediği bilinmektedir. NRF1 ve TFAM, mitozun iki merkezi düzenleyicisidir ve mtDNA replikasyonunu aktive etmek için PGC-1α'nın aşağısında yer alırlar. Bu yol, cAMP ve AMPK sinyallemesi ile aktive edilir ve enerji harcamasına ve metabolik strese duyarlıdır. Ayrıca, PPA'nın etkilerinin oksidatif stres yoluyla aracılık edilip edilmediğini belirlemek için mitokondriyal biyogenezin redoks düzenleyicisi olan NFE2L2'yi de inceledik.
NFE2L2 ekspresyonu değişmeden kalmasına rağmen, 3 mM ve 5 mM PPA ile 24 saatlik tedaviden sonra cMYC, NRF1 ve TFAM ekspresyonunda tutarlı bir doza bağımlı azalma bulduk (Şekil 3a–c). cMYC ekspresyonunun aşağı regülasyonu daha önce mitokondriyal strese bir yanıt olarak bildirilmiştir42 ve tersine, cMYC ekspresyonunun aşağı regülasyonu, mitokondriyal metabolizmayı, ağ bağlantısını ve membran polarizasyonunu yeniden şekillendirerek mitokondriyal disfonksiyona neden olabilir43. İlginç bir şekilde, cMYC ayrıca mitokondriyal bölünme ve birleşmenin düzenlenmesinde de rol oynar42,43 ve hücre bölünmesi sırasında DRP1 fosforilasyonunu ve mitokondriyal lokalizasyonu artırdığı44 ve nöronal kök hücrelerde mitokondriyal morfolojik yeniden şekillendirmeye aracılık ettiği bilinmektedir45. Gerçekten de, cMYC eksikliği olan fibroblastlar, PPA43 stresi tarafından indüklenen değişikliklerle tutarlı olarak, azalmış mitokondriyal boyut sergiler. Bu veriler, cMYC ve mitokondriyal dinamikler arasında ilginç ancak henüz net olmayan bir ilişkiyi ortaya koymakta ve PPA stresi kaynaklı yeniden yapılanmanın gelecekteki çalışmaları için ilginç bir hedef sunmaktadır.
NRF1 ve TFAM'ın azalması, cMYC'nin önemli bir transkripsiyonel aktivatör olarak rolüyle tutarlıdır. Bu veriler ayrıca, PPA'nın 22 saatte NRF1 mRNA ekspresyonunu azalttığını ve bunun ATP tükenmesi ve ROS46 artışıyla ilişkili olduğunu gösteren insan kolon kanseri hücrelerinde yapılan önceki çalışmalarla da tutarlıdır. Bu yazarlar ayrıca TFAM ekspresyonunun 8,5 saatte arttığını ancak 22 saatte bazal seviyelere döndüğünü bildirmişlerdir. Buna karşılık, Kim ve ark. (2019), SH-SY5Y hücrelerinde 4 saatlik PPA stresi sonrasında TFAM mRNA ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını; ancak 72 saat sonra TFAM protein ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını ve mtDNA kopya sayısının önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Bu nedenle, 24 saat sonra gözlemlediğimiz mitokondriyal biyogenez genlerinin sayısındaki azalma, mitokondri sayısındaki artışın daha erken zaman noktalarında biyogenezin aktivasyonuyla ilişkili olma olasılığını dışlamaz. Önceki çalışmalar, PPA'nın SH-SY5Y hücrelerinde 4 saat 30 dakika sonra PGC-1α mRNA ve proteinini önemli ölçüde artırdığını, propiyonik asidin ise 12 saat 39 dakika sonra buzağı hepatositlerinde PGC-1α aracılığıyla mitokondriyal biyogenezi artırdığını göstermiştir. İlginç bir şekilde, PGC-1α sadece NRF1 ve TFAM'ın doğrudan transkripsiyonel düzenleyicisi olmakla kalmayıp, aynı zamanda bölünme ve birleşmeyi düzenleyerek MFN2 ve DRP1'in aktivitesini de düzenlediği gösterilmiştir47. Bu durum, PPA tarafından indüklenen mitokondriyal telafi edici yanıtları düzenleyen mekanizmaların yakın bağlantısını vurgulamaktadır. Dahası, verilerimiz PPA stresi altında biyogenez ve metabolizmanın transkripsiyonel düzenlemesinde önemli bir düzensizliği yansıtmaktadır.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 ve DRP1 genleri, mitokondriyal bölünme, birleşme ve dinamiklerin merkezi düzenleyicileri arasındadır37,48,49. Mitokondriyal dinamiklerde rol oynayan birçok başka gen de vardır; ancak STOML2, OPA1 ve MFN2'nin daha önce ASD kohortlarında farklı şekilde metillendiği bulunmuştur16 ve birkaç bağımsız çalışma, mitokondriyal strese yanıt olarak bu transkripsiyon faktörlerinde değişiklikler olduğunu bildirmiştir50,51, 52. Hem OPA1 hem de STOML2'nin ekspresyonu, 3 mM ve 5 mM PPA tedavisiyle önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 3e, f). OPA1, MFN1 ve 2 ile doğrudan etkileşim yoluyla mitokondriyal birleşmenin klasik düzenleyicilerinden biridir ve krista yeniden şekillenmesinde ve mitokondriyal morfolojide rol oynar53. STOML2'nin mitokondriyal dinamiklerdeki kesin rolü hala belirsizliğini koruyor, ancak kanıtlar mitokondriyal füzyon, biyogenez ve mitofaji süreçlerinde rol oynadığını gösteriyor.
STOML2, mitokondriyal solunum eşleşmesinin ve solunum zinciri komplekslerinin oluşumunun sürdürülmesinde rol oynar54,55 ve kanser hücrelerinin metabolik özelliklerini önemli ölçüde değiştirdiği gösterilmiştir56. Çalışmalar, STOML2'nin BAN ve kardiyolipin ile etkileşim yoluyla mitokondriyal membran potansiyelini ve biyogenezi desteklediğini göstermiştir55, 57, 58. Ek olarak, bağımsız çalışmalar, STOML2 ve PINK1 arasındaki etkileşimin mitofajiyi düzenlediğini göstermiştir59,60. Özellikle, STOML2'nin MFN2 ile doğrudan etkileşime girdiği ve onu stabilize ettiği ve ayrıca OPA1 bozunmasından sorumlu proteazı inhibe ederek uzun OPA1 izoformlarının stabilize edilmesinde önemli bir rol oynadığı bildirilmiştir53,61,62. PPA reaksiyonlarında gözlemlenen STOML2 ekspresyonundaki azalma, bu füzyon proteinlerini ubiquitin ve proteazom bağımlı yollarla bozunmaya daha yatkın hale getirebilir48. STOML2 ve OPA1'in PPA'ya karşı dinamik yanıttaki kesin rolü belirsiz olsa da, bu füzyon genlerinin azalmış ifadesi (Şekil 3), bölünme ve birleşme arasındaki dengeyi bozabilir ve mitokondri boyutunun azalmasına yol açabilir (Şekil 3). 1).
Öte yandan, OPA1 protein ekspresyonu 24 saat sonra değişmeden kalırken, MFN1, MFN2 veya DRP1'in mRNA ve protein seviyelerinde PPA tedavisi sonrasında anlamlı bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 3g-i, Şekil 4). Bu, mitokondriyal füzyon ve bölünmede rol oynayan bu faktörlerin düzenlenmesinde herhangi bir değişiklik olmadığını gösterebilir. Bununla birlikte, bu dört genin her birinin protein aktivitesini kontrol eden transkripsiyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler) tarafından da düzenlendiğini belirtmekte fayda var. OPA1, mitokondride proteolitik olarak parçalanarak iki farklı izoform üreten sekiz alternatif ekleme varyantına sahiptir 63. Uzun ve kısa izoformlar arasındaki denge, nihayetinde OPA1'in mitokondriyal füzyondaki ve mitokondriyal ağın korunmasındaki rolünü belirler 64. DRP1 aktivitesi kalsiyum/kalmodulin bağımlı protein kinaz II (CaMKII) fosforilasyonu ile düzenlenirken, DRP1 bozunması ubikitinasyon ve SUMOilasyon65 ile düzenlenir. Son olarak, hem DRP1 hem de MFN1/2 GTPazlardır, bu nedenle aktivite mitokondrideki GTP üretim hızı tarafından etkilenebilir 66. Bu nedenle, bu proteinlerin ekspresyonu sabit kalsa da, bu durum protein aktivitesinin veya lokalizasyonunun değişmediğini yansıtmayabilir67,68. Gerçekten de, mevcut PTM protein repertuarları genellikle akut stres tepkilerini düzenlemekten sorumlu ilk savunma hattı olarak görev yapar. Modelimizde orta düzeyde metabolik stresin varlığında, PTM'nin, bu genlerin mRNA veya protein düzeyinde ek aktivasyonuna gerek kalmadan mitokondriyal bütünlüğü yeterince geri kazandırmak için füzyon ve bölünme proteinlerinin aktivitesini artırması muhtemeldir.
Yukarıdaki veriler birlikte ele alındığında, mitokondriyal morfolojinin karmaşık ve zamana bağlı düzenlenmesini ve bu mekanizmaların aydınlatılmasının zorluklarını vurgulamaktadır. Gen ekspresyonunu incelemek için öncelikle yolaktaki spesifik hedef genlerin belirlenmesi gereklidir. Bununla birlikte, verilerimiz aynı yolaktaki genlerin aynı strese aynı şekilde yanıt vermediğini göstermektedir. Aslında, önceki çalışmalar aynı yolaktaki farklı genlerin farklı zamansal yanıt profilleri sergileyebileceğini göstermiştir30,46. Ek olarak, transkripsiyon ve gen fonksiyonu arasındaki ilişkiyi bozan karmaşık transkripsiyon sonrası mekanizmalar vardır. Proteomik çalışmalar, PTM'lerin ve protein fonksiyonunun etkisine dair fikir verebilir, ancak düşük verimli yöntemler, yüksek sinyal-gürültü oranları ve düşük çözünürlük gibi zorluklar da içermektedir.
Bu bağlamda, TEM ve MEL kullanarak mitokondriyal morfolojiyi incelemek, mitokondriyal dinamikler ve fonksiyon arasındaki ilişki ve bunun hastalığı nasıl etkilediği hakkındaki temel soruları ele almak için büyük bir potansiyele sahiptir. En önemlisi, TEM, mitokondriyal disfonksiyon ve dinamiklerin yakınsak bir son noktası olarak mitokondriyal morfolojiyi ölçmek için doğrudan bir yöntem sağlar51. MEL ayrıca, üç boyutlu hücresel ortamda bölünme ve birleşme olaylarını görselleştirmek için doğrudan bir yöntem sağlar ve gen ekspresyonunda değişiklik olmasa bile dinamik mitokondriyal yeniden yapılanmanın nicelleştirilmesine olanak tanır33. Burada, ikincil mitokondriyal hastalıklarda mitokondriyal görüntüleme tekniklerinin faydasını vurguluyoruz. Bu hastalıklar tipik olarak, akut mitokondriyal hasardan ziyade mitokondriyal ağların ince yeniden yapılanmasıyla karakterize edilen kronik hafif metabolik stresle karakterize edilir. Bununla birlikte, kronik stres altında mitozu sürdürmek için gereken mitokondriyal telafi, derin fonksiyonel sonuçlara sahiptir. Sinirbilim bağlamında, bu telafi mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili pleiotropik nöropatoloji hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Sonuç olarak, verilerimiz, nöronal mitokondriyal dinamikleri kontrol eden gen ekspresyonu, protein modifikasyonları ve protein aktivitesi arasındaki karmaşık etkileşimlerin fonksiyonel sonuçlarını anlamada görüntüleme tekniklerinin faydasını vurgulamaktadır. ASD'nin mitokondriyal bileşenine dair bilgi edinmek için nöronal hücre modelinde mitokondriyal disfonksiyonu modellemek amacıyla PPA kullandık. PPA ile muamele edilen SH-SY5Y hücrelerinde mitokondriyal morfolojide değişiklikler gözlendi: mitokondriler küçüldü ve yuvarlaklaştı, kristalar ise TEM ile incelendiğinde belirsizleşti. MEL analizi, bu değişikliklerin, hafif metabolik strese yanıt olarak mitokondriyal ağı korumak için bölünme ve birleşme olaylarındaki artışla eş zamanlı olarak meydana geldiğini göstermektedir. Dahası, PPA, mitokondriyal metabolizma ve homeostazın transkripsiyonel düzenlemesini önemli ölçüde bozmaktadır. PPA stresi tarafından bozulan ve mitokondriyal morfoloji ve fonksiyondaki PPA kaynaklı değişikliklere aracılık etmede rol oynayabilecek temel mitokondriyal düzenleyiciler olarak cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 ve OPA1'i tanımladık. Gen ekspresyonunda ve protein aktivitesinde, lokalizasyonunda ve post-translasyonel modifikasyonlarında PPA kaynaklı zamansal değişiklikleri daha iyi karakterize etmek için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır. Verilerimiz, mitokondriyal stres yanıtına aracılık eden düzenleyici mekanizmaların karmaşıklığını ve birbirine bağımlılığını vurgulamakta ve daha hedefli mekanistik çalışmalar için TEM ve diğer görüntüleme tekniklerinin faydasını göstermektedir.
SH-SY5Y hücre hattı (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich'ten satın alındı. SH-SY5Y hücreleri, 25 cm2'lik şişelerde, %20 fetal sığır serumu (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) ve %1 penisilin-streptomisin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı/F-12 besin karışımı (DMEM/F-12) ve L-glutamin (SC09411, ScienCell) içinde 37 °C'de, %5 CO2'de yetiştirildi. Hücreler, %0,05 tripsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) kullanılarak %80 yoğunluğa ulaşana kadar alt kültürlendi, 300 g'de santrifüjlendi ve yaklaşık 7 × 10⁵ hücre/ml yoğunluğunda plaklara ekildi. Tüm deneyler, 19-22 pasaj arasındaki farklılaşmamış SH-SY5Y hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. PPA, NaP olarak uygulandı. NaP tozunu (CAS No. 137-40-6, kimyasal formül C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ılık MilliQ suda 1 M konsantrasyona kadar çözün ve 4 °C'de saklayın. Tedavi gününde, bu çözeltiyi serumsuz ortamda (L-glutaminli DMEM/F-12) 1 M PPA ile 3 mM ve 5 mM PPA'ya kadar seyreltin. Tüm deneyler için tedavi konsantrasyonları PPA içermiyordu (0 mM, kontrol), 3 mM ve 5 mM PPA idi. Deneyler en az üç biyolojik tekrar ile gerçekleştirildi.
SH-SY5Y hücreleri 25 cm5'lik şişelere 5,5 × 10⁵ hücre/ml oranında ekildi ve 24 saat boyunca büyütüldü. PPA uygulaması, 24 saatlik inkübasyondan önce şişeye eklendi. Hücre peletleri, normal memeli doku alt kültür protokolleri (yukarıda açıklanmıştır) izlenerek toplandı. Hücre peleti 100 µl %2,5 glutaraldehit, 1× PBS içinde süspansiyon haline getirildi ve işleme kadar 4 °C'de saklandı. SH-SY5Y hücreleri, hücreleri çökeltmek ve %2,5 glutaraldehit, 1× PBS çözeltisini uzaklaştırmak için kısa bir süre santrifüjlendi. Çökelti, damıtılmış suda hazırlanan %4'lük agaroz jelinde süspansiyon haline getirildi (agarozun çökelti hacmine oranı 1:1'dir). Agaroz parçaları düz plakalar üzerindeki ızgaralara yerleştirildi ve yüksek basınçlı dondurmadan önce 1-heksadesen ile kaplandı. Numuneler, 24 saat boyunca -90°C'de %100 kuru asetonda donduruldu. Daha sonra sıcaklık -80°C'ye yükseltildi ve %1 osmiyum tetroksit ve %0,1 glutaraldehit çözeltisi eklendi. Numuneler 24 saat boyunca -80°C'de saklandı. Bundan sonra, sıcaklık birkaç gün içinde kademeli olarak oda sıcaklığına yükseltildi: 24 saat boyunca -80°C'den -50°C'ye, 24 saat boyunca -30°C'ye, 24 saat boyunca -10°C'ye ve son olarak oda sıcaklığına.
Kriyojenik hazırlıktan sonra, örnekler reçine ile emprenye edildi ve Leica Reichert UltracutS ultramikrotom (Leica Microsystems) kullanılarak ultra ince kesitler (∼100 nm) hazırlandı. Kesitler %2 uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyandı. Örnekler, 200 kV'de (Lab6 verici) çalışan bir FEI Tecnai 20 transmisyon elektron mikroskobu (ThermoFisher (eski adıyla FEI), Eindhoven, Hollanda) ve Tridiem enerji filtresi ile donatılmış bir Gatan CCD kamera (Gatan, İngiltere) kullanılarak incelendi.
Her teknik tekrarda, toplam 266 görüntü için en az 24 tek hücre görüntüsü elde edildi. Tüm görüntüler, İlgi Alanı (ROI) makrosu ve Mitokondri makrosu kullanılarak analiz edildi. Mitokondri makrosu, yayınlanmış yöntemlere17,31,32 dayanmaktadır ve Fiji/ImageJ69'da TEM görüntülerinin yarı otomatik toplu işlenmesine olanak tanır. Özetle: görüntü ters çevrilir ve yuvarlanan top arka plan çıkarma (60 piksel yarıçap) ve bir FFT bant geçiren filtre (sırasıyla 60 ve 8 piksel üst ve alt sınırları kullanılarak) ve %5'lik bir yönelim toleransı ile dikey çizgi bastırma kullanılarak ters çevrilir. İşlenmiş görüntü, maksimum entropi algoritması kullanılarak otomatik olarak eşiklenir ve ikili bir maske oluşturulur. Ham TEM görüntülerinde manuel olarak seçilen ROI'lerle ilişkili görüntü bölgeleri çıkarılarak mitokondriler karakterize edildi ve plazma zarı ve diğer yüksek kontrastlı bölgeler hariç tutuldu. Çıkarılan her bir ROI için, 600 pikselden büyük ikili parçacıklar analiz edildi ve Fiji/ImageJ'nin yerleşik ölçüm fonksiyonları kullanılarak parçacık alanı, çevre, ana ve ikincil eksenler, Feret çapı, yuvarlaklık ve dairesellik ölçüldü. Merrill, Flippo ve Strack'ı (2017) takip ederek, bu verilerden alan², parçacık en boy oranı (ana eksen/ikincil eksen oranı) ve şekil faktörü (FF) hesaplandı; burada FF = çevre²/4π x alan. Parametrik formülün tanımı Merrill, Flippo ve Strack'ta (2017) bulunabilir. Bahsedilen makrolar GitHub'da mevcuttur (Veri Erişilebilirlik Bildirimi'ne bakınız). Ortalama olarak, PPA uygulaması başına yaklaşık 5.600 parçacık analiz edildi ve toplamda yaklaşık 17.000 parçacık analiz edildi (veriler gösterilmemiştir).
SH-SH5Y hücreleri, yapışmayı sağlamak için gece boyunca 8 bölmeli kültür kaplarına (ThermoFisher, #155411) yerleştirildi ve daha sonra TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) ve Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) ile inkübe edildi. Görüntüler, 10 dakikalık bir ortamda 405 nm ve 561 nm lazerler kullanılarak elde edildi ve ham görüntüler, 12 ardışık zaman noktasında görüntü kareleri arasında 0,2 μm'lik az adımıyla 10 görüntü mikrografı içeren z-yığınları olarak elde edildi. Görüntüler, bir Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 süper çözünürlük platformu (Carl Zeiss, Oberkochen, Almanya) ve bir LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lens kullanılarak toplandı. Görüntüler, daha önce açıklanan bir işlem hattı ve ImageJ eklentisi kullanılarak ImageJ'de analiz edildi ve füzyon ve bölünme olayları, ortalama mitokondriyal yapı sayısı ve hücre başına ortalama mitokondriyal hacim ölçüldü.33 MEL makroları GitHub'da mevcuttur (Veri Erişilebilirlik Bildirimi'ne bakınız).
SH-SY5Y hücreleri, tedavi öncesinde 24 saat boyunca 0,3 × 10⁶ hücre/mL yoğunluğunda altı kuyucuklu plaklarda yetiştirildi. RNA, Quick-RNA™ Miniprep protokolü (ZR R1055, Zymo Research) kullanılarak, bazı küçük değişikliklerle ekstrakte edildi: Her bir kuyucuğa 300 μl RNA lizis tamponu eklendi ve son adımda her örnek 30 μl DNaz/RNaz elüsyonu ile lizize edildi. Tüm örneklerin miktarı ve kalitesi NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spektrofotometre kullanılarak kontrol edildi. Hücre lizatlarından toplam protein, 200 μl RIPA lizis tamponu kullanılarak elde edildi ve protein konsantrasyonu Bradford protein testi70 kullanılarak ölçüldü.
cDNA sentezi, üreticinin talimatlarına bazı değişiklikler yapılarak Tetro™ cDNA Sentez Kiti (BIO-65043, Meridian Bioscience) kullanılarak gerçekleştirildi. cDNA, 0,7 ila 1 μg toplam RNA kullanılarak 20 μl'lik reaksiyonlarda sentezlendi. Primerler, daha önce yayınlanmış makalelerden (Tablo S1) seçildi ve eşlik eden problar, Integrated DNA Technologies'in PrimerQuest aracı kullanılarak tasarlandı. İlgi duyulan tüm genler, nükleer B2M genine göre normalize edildi. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC ve OPA1 genlerinin ekspresyonu RT-qPCR ile ölçüldü. Ana karışım, her reaksiyon için 10 μL'lik nihai hacim elde etmek üzere LUNA Taq polimeraz (M3003L, New England Biolabs), 10 μM ileri ve geri primerler, cDNA ve PCR sınıfı su içeriyordu. Bölünme ve ayrışma genlerinin (DRP1, MFN1/2) ekspresyonu, TaqMan multipleks testleri kullanılarak ölçüldü. Üreticinin talimatlarına göre, küçük değişikliklerle Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) kullanıldı. Multipleks RT-qPCR ana karışımı, 1X LUNA Taq polimeraz, 10 μM ileri ve geri primerler, 10 μM prob, cDNA ve PCR sınıfı su içerir ve her reaksiyon için 20 μL'lik nihai hacim elde edilir. RT-qPCR, Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—seri numarası: R0618110) kullanılarak gerçekleştirildi. Döngü koşulları Tablo S1'de gösterilmiştir. Tüm cDNA örnekleri üçlü olarak çoğaltılmış ve on katlı seyreltme serisi kullanılarak bir standart eğri oluşturulmuştur. Veri tekrarlanabilirliğini sağlamak için, döngü eşik standart sapması (Ct) >0,5 olan üçlü örneklerdeki aykırı değerler analizden çıkarılmıştır30,72. Göreceli gen ekspresyonu 2-ΔΔCt79 yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır.
Protein örnekleri (60 μg), 2:1 oranında Laemmli yükleme tamponu ile karıştırıldı ve %12'lik renksiz bir protein jelinde (Bio-Rad #1610184) yürütüldü. Proteinler, Trans-Blot Turbo sistemi (#170-4155, Bio-Rad) kullanılarak bir PVDF (poliviniliden florür) membranına (#170-84156, Bio-Rad) aktarıldı. Membran bloke edildi ve uygun birincil antikorlarla (OPA1, MFN1, MFN2 ve DRP1) (1:1000 oranında seyreltilmiş) 48 saat inkübe edildi, ardından ikincil antikorlarla (1:10.000) 1 saat inkübe edildi. Membranlar daha sonra Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) kullanılarak görüntülendi ve bir Bio-Rad ChemiDoc MP sistemi kullanılarak kaydedildi. Western blot analizi için ImageLab sürüm 6.1 kullanılmıştır. Orijinal jel ve blot Şekil S1'de gösterilmiştir. Antikor bilgileri Tablo S2'de verilmiştir.
Veri setleri, en az üç bağımsız örneğin ortalaması ve ortalama standart hatası (SEM) olarak sunulmuştur. Veri setleri, Gauss dağılımı ve eşit standart sapmalar varsayılmadan ve analizlere devam edilmeden önce (aksi belirtilmedikçe) Shapiro-Wilks testi kullanılarak normallik açısından test edilmiştir. Veri setinin analizine ek olarak, anlamlılığı belirlemek için Fisher'ın MEL LSD'si (p < 0,05), tek yönlü ANOVA (tedaviye karşı kontrol ortalaması) ve Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi (p < 0,05) kullanılmıştır. Anlamlı p değerleri grafikte *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 olarak gösterilmiştir. Tüm istatistiksel analizler ve grafikler GraphPad Prism 9.4.0 kullanılarak gerçekleştirilmiş ve oluşturulmuştur.
TEM görüntü analizi için Fiji/ImageJ makroları GitHub'da herkese açık olarak mevcuttur: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitokondriyal Olay Bulucu (MEL) makrosu da GitHub'da herkese açık olarak mevcuttur: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM ve Vijaya A. Mitokondri: metabolizma, homeostaz, stres, yaşlanma ve epigenetiğin ana düzenleyicileri. Endonezya Biyomedikal Bilimler Dergisi 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Şizofrenide çok yönlü mitokondriyal disfonksiyon, olası patolojik hedef olarak kompleks I. Şizofreni. kaynak. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. ve Beal, MF Parkinson hastalığında mitokondriyal disfonksiyon. J. Nörokimya. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG ve Mehta V. Stresli mitokondriler: Alzheimer hastalığında istilanın hedefleri. Mitokondri 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF ve Ferreira GK Mitokondri ve beyin: biyoenerji ve daha fazlası. Nörotoksinler. kaynak. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. ve diğerleri. Pleiotropik mitokondriler: mitokondrilerin nöronal gelişim ve hastalık üzerindeki etkisi. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. ve Morais, VA Nöronlarda mitokondriyal biyogenez: nasıl ve nerede. uluslararası. J. Mohr. bilim. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. ve Zhao, J. Memeli mitokondriyal dinamiklerinin düzenlenmesi: fırsatlar ve zorluklar. ön. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. ve Slack, RS Nörogenezin düzenlenmesinde mitokondriyal dinamikler: Gelişmekte olan beyinden yetişkin beyne. gelişim. dinamik. 247, 47–53 (2018).