Mevcut adres: Köln 50931, Almanya, Yaşlanmaya Bağlı Hastalıklarda Hücresel Stres Tepkisi Araştırmaları Köln Mükemmeliyet Kümesi (CECAD).
Mitokondriyal hastalıkların nörodejenerasyonu, nöronların metabolik plastisitesinin sınırlı olması nedeniyle geri döndürülemez olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal disfonksiyonun vücuttaki nöronal metabolizmanın hücre özerkliği üzerindeki etkisi yeterince anlaşılmamıştır. Burada, bozulmuş mitokondriyal füzyon dinamiklerinden kaynaklanan ilerleyici OXPHOS eksikliği olan Purkinje nöronlarının hücreye özgü proteomunu sunuyoruz. Mitokondriyal disfonksiyonun proteomik alanında derin bir değişime yol açtığını ve bunun da hücre ölümünden önce belirli metabolik programların ardışık aktivasyonuna neden olduğunu bulduk. Beklenmedik bir şekilde, TCA döngüsünün ara ürünlerini tamamlayan piruvat karboksilaz (PCx) ve diğer yaşlanma karşıtı enzimlerin belirgin bir şekilde indüklenmesini belirledik. PCx'in inhibisyonu oksidatif stresi ve nörodejenerasyonu şiddetlendirdi, bu da aterosklerozun OXPHOS eksikliği olan nöronlarda koruyucu bir etkiye sahip olduğunu gösteriyor. Terminal dejenere olmuş nöronlarda mitokondriyal füzyonun restorasyonu, bu metabolik özellikleri tamamen tersine çevirerek hücre ölümünü önler. Bulgularımız, mitokondriyal disfonksiyona karşı direnç sağlayan daha önce bilinmeyen yolları ortaya koymakta ve nörodejenerasyonun hastalığın geç evrelerinde bile tersine çevrilebileceğini göstermektedir.
Mitokondrilerin nöronal enerji metabolizmasının sürdürülmesindeki merkezi rolü, insan mitokondriyal hastalıklarıyla ilişkili yaygın nörolojik semptomlarla vurgulanmaktadır. Bu hastalıkların çoğu, mitokondriyal gen ekspresyonunu düzenleyen gen mutasyonlarından (1, 2) veya mitokondriyal dinamiklerle ilgili gen yıkımından kaynaklanır ve bu da dolaylı olarak mitokondriyal DNA'nın (mtDNA) stabilitesini etkiler (3, 4). Hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalar, çevredeki dokulardaki mitokondriyal disfonksiyona yanıt olarak, koruyucu metabolik yolların (5-7) aktive edilebileceğini göstermiştir; bu da bu karmaşık hastalıkların patogenezinin derinlemesine anlaşılması için önemli bilgiler sağlar. Buna karşılık, beyin mitokondriyal adenozin trifosfat (ATP) üretiminin genel yetersizliğinden kaynaklanan belirli hücre tiplerinin metabolik değişikliklerine ilişkin anlayışımız temeldir (8) ve hastalığı önlemek veya nörodejenerasyonu engellemek için kullanılabilecek terapötik hedeflerin belirlenmesi ihtiyacını vurgulamaktadır (9). Bilgi eksikliğinin nedeni, sinir hücrelerinin çevredeki dokuların hücre tiplerine kıyasla çok sınırlı metabolik esnekliğe sahip olduğunun yaygın olarak kabul edilmesidir (10). Bu hücrelerin, sinaptik iletimi teşvik etmek ve yaralanma ve hastalık koşullarına yanıt vermek için nöronlara metabolit tedarikini koordine etmede merkezi bir rol oynadığı göz önüne alındığında, hücre metabolizmasını beyin dokusunun zorlu koşullarına uyarlama yeteneği neredeyse sadece glial hücrelerle sınırlıdır (11-14). Ek olarak, beyin dokusunun doğal hücresel heterojenliği, belirli nöronal alt gruplarda meydana gelen metabolik değişikliklerin incelenmesini büyük ölçüde engellemektedir. Sonuç olarak, nöronlardaki mitokondriyal disfonksiyonun kesin hücresel ve metabolik sonuçları hakkında çok az şey bilinmektedir.
Mitokondriyal disfonksiyonun metabolik sonuçlarını anlamak için, mitokondriyal dış zar füzyonunun (Mfn2) yıkımından kaynaklanan nörodejenerasyonun farklı aşamalarındaki Purkinje nöronlarını (PN'ler) izole ettik. İnsanlarda Mfn2 mutasyonları, Charcot-Marie-Tooth tip 2A (15) olarak bilinen kalıtsal bir motor duyusal nöropati formuyla ilişkilendirilirken, farelerde Mfn2'nin koşullu yıkımı, oksidasyon fosforilasyon (OXPHOS) disfonksiyonunun iyi bilinen bir indüksiyon yöntemidir. Çeşitli nöronal alt tipler (16-19) ve ortaya çıkan nörodejeneratif fenotip, hareket bozuklukları (18, 19) veya serebellar ataksi (16) gibi ilerleyici nörolojik semptomlarla birlikte görülür. Etiketsiz kantitatif (LFQ) proteomik, metabolomik, görüntüleme ve virolojik yöntemlerin bir kombinasyonunu kullanarak, ilerleyici nörodejenerasyonun, in vivo olarak PN'lerin arteriosklerozunda rol oynayan piruvat karboksilaz (PCx) ve diğer faktörlerin enzim ekspresyonunu güçlü bir şekilde indüklediğini gösterdik. Bu bulgunun önemini doğrulamak için, Mfn2 eksikliği olan PN'lerde PCx ekspresyonunu spesifik olarak azalttık ve bu işlemin oksidatif stresi şiddetlendirdiğini ve nörodejenerasyonu hızlandırdığını bulduk; böylece azosperminin hücre ölümüne metabolik adaptasyon sağladığını kanıtladık. Şiddetli MFN2 ekspresyonu, şiddetli OXPHOS eksikliği, mitokondriyal DNA'nın yoğun tüketimi ve görünüşte bozulmuş mitokondriyal ağa sahip terminal dejenerasyon PN'lerini tamamen kurtarabilir; bu da bu nörodejenerasyon formunun hücre ölümünden önce hastalığın ileri aşamasında bile iyileşebileceğini daha da vurgular.
Mfn2 nakavt PN'lerindeki mitokondrileri görselleştirmek için, Cre'ye bağımlı mitokondrilerin sarı floresan protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre ekspresyonunu hedeflemesine izin veren bir fare suşu kullandık ve mitokondriyal morfolojiyi in vivo olarak kontrol ettik. PN'lerde Mfn2 geninin yok edilmesinin mitokondriyal ağın kademeli olarak bölünmesine yol açtığını bulduk (Şekil S1A) ve en erken değişiklik 3 haftalık yaşta bulundu. Buna karşılık, Calbindin immün boyamasının kaybıyla kanıtlandığı gibi, PN hücre tabakasının önemli dejenerasyonu 12 haftalık yaşa kadar başlamadı (Şekil 1, A ve B). Mitokondriyal morfolojideki en erken değişiklikler ile nöronal ölümün görünür başlangıcı arasındaki zaman uyumsuzluğu, hücre ölümünden önce mitokondriyal disfonksiyonun tetiklediği metabolik değişiklikleri araştırmamıza yol açtı. YFP (YFP+) eksprese eden PN'leri (Şekil 1C) ve kontrol farelerinde (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), bundan sonra CTRL olarak anılacak olan hücreleri (Şekil S1B) izole etmek için floresan aktivasyonlu hücre sıralama (FACS) tabanlı bir strateji geliştirdik. YFP sinyalinin göreceli yoğunluğuna dayalı olarak kapılama stratejisinin optimizasyonu, PN'lerin YFP+ gövdesini (YFPhigh) PN olmayanlardan (YFPneg) (Şekil S1B) veya olası floresan akson/dendritik parçalardan (YFPlow; Şekil S1D, sol) ayırmamızı sağlar; bu durum konfokal mikroskopla doğrulandı (Şekil S1D, sağ). Sınıflandırılmış popülasyonun kimliğini doğrulamak için LFQ proteomik ve ardından temel bileşen analizi gerçekleştirdik ve YFPhigh ve YFPneg hücreleri arasında net bir ayrım olduğunu bulduk (Şekil S1C). YFPhigh hücreleri, bilinen PN belirteçlerinin (yani Calb1, Pcp2, Grid2 ve Itpr3) net bir zenginleşmesini gösterdi (21, 22), ancak nöronlarda veya diğer hücre tiplerinde yaygın olarak ifade edilen proteinlerin zenginleşmesini göstermedi (Şekil 1D). Bağımsız deneylerde toplanan sınıflandırılmış YFPhigh hücrelerindeki örnekler arasındaki karşılaştırma, 0,9'dan büyük bir korelasyon katsayısı göstererek biyolojik tekrarlar arasında iyi bir tekrarlanabilirliği ortaya koydu (Şekil S1E). Özetle, bu veriler, uygulanabilir PN'nin akut ve spesifik izolasyonu için planımızı doğruladı. Kullanılan L7-cre sürücü sistemi, uygulamadan sonraki ilk hafta mozaik rekombinasyonu indüklediği için (23), CTRL ve koşullu (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) farelerden nöronları toplamaya başladık. Rekombinasyon tamamlandıktan sonra, 4 haftalıkken Mfn2cKO olarak adlandırılır. Son nokta olarak, mitokondriyal parçalanmanın belirgin olmasına rağmen PN tabakasının sağlam olduğu 8 haftalık yaşı seçtik (Şekil 1B ve Şekil S1A). Toplamda, yaklaşık %22'si mitokondriyal proteom temel alınarak MitoCarta 2.0 açıklamalarına göre mitokondriyal olarak belirlenen toplam 3013 proteini ölçtük (Şekil 1E) (Şekil 1E) (24). 8. haftada gerçekleştirilen diferansiyel gen ekspresyon analizi, tüm proteinlerin yalnızca %10,5'inde anlamlı değişiklikler olduğunu gösterdi (Şekil 1F ve Şekil S1F), bunlardan 195 protein aşağı regüle edilmiş ve 120 protein yukarı regüle edilmiştir (Şekil 1F). Bu veri setinin "yenilikçi yol analizi"nin, diferansiyel olarak ifade edilen genlerin esas olarak belirli metabolik yolların sınırlı bir kümesine ait olduğunu gösterdiğini belirtmekte fayda var (Şekil 1G). İlginç bir şekilde, OXPHOS ve kalsiyum sinyallemesiyle ilgili yolların aşağı regülasyonu, füzyon eksikliği olan PN'lerde mitokondriyal disfonksiyonun indüklenmesini doğrulasa da, esas olarak amino asit metabolizmasını içeren diğer kategoriler önemli ölçüde yukarı regüle edilmiştir; bu da mitokondriyal PN'lerde meydana gelen metabolizmayla uyumludur. Yeniden düzenleme, disfonksiyonla tutarlıdır.
(A) CTRL ve Mfn2cKO farelerinin serebellar kesitlerinin, PN'lerin (kalbindin, gri) ilerleyici kaybını gösteren temsili konfokal fotoğrafları; çekirdekler DAPI ile karşı boyanmıştır. (B) (A)'nın nicel değerlendirmesi (tek yönlü varyans analizi, ***P<0.001; üç fareden 4 ila 6 daire). (C) Deneysel iş akışı. (D) Purkinje (üst) ve diğer hücre tiplerine (orta) özgü belirteçlerin ısı haritası dağılımı. (E) Sınıflandırılmış PN'de tanımlanan mitokondriyal protein sayısını gösteren Venn diyagramı. (F) 8 haftalık Mfn2cKO nöronlarında farklı şekilde ifade edilen proteinlerin volkan grafiği (anlamlılık eşik değeri 1,3). (G) Yaratıcılık yolu analizi, 8 haftalık olarak sınıflandırılan Mfn2cKO PN'de en önemli beş yukarı düzenleme (kırmızı) ve aşağı düzenleme (mavi) yolunu göstermektedir. Tespit edilen her proteinin ortalama ifade düzeyi gösterilmiştir. Gri tonlamalı ısı haritası: ayarlanmış P değeri. ns, önemsiz.
Proteomik veriler, kompleks I, III ve IV'ün protein ekspresyonunun kademeli olarak azaldığını gösterdi. Kompleks I, III ve IV'ün tümü temel mtDNA kodlu alt birimleri içerirken, yalnızca nükleer kodlu olan kompleks II temelde etkilenmedi (Şekil 2A ve Şekil S2A). Proteomik sonuçlarla tutarlı olarak, serebellar doku kesitlerinin immünohistokimyası, PN'deki kompleks IV'ün MTCO1 (mitokondriyal sitokrom C oksidaz alt birimi 1) alt birim seviyesinin kademeli olarak azaldığını gösterdi (Şekil 2B). mtDNA kodlu alt birim Mtatp8 önemli ölçüde azaldı (Şekil S2A), nükleer kodlu ATP sentaz alt biriminin kararlı durum seviyesi ise değişmeden kaldı; bu, mtDNA ekspresyonu kararlı olduğunda bilinen kararlı ATP sentaz alt montaj F1 kompleksinin oluşumuyla tutarlıdır. Kesinti (7). Sıralanmış Mfn2cKO PN'lerdeki mtDNA seviyesinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile değerlendirilmesi, mtDNA kopya sayısında kademeli bir azalmayı doğruladı. Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 8 haftalık yaşta mtDNA seviyesinin sadece yaklaşık %20'si korunmuştur (Şekil 2C). Bu sonuçlarla tutarlı olarak, Mfn2cKO PN'lerin konfokal mikroskopi boyaması DNA'yı tespit etmek için kullanıldı ve mitokondriyal nükleotidlerin zamana bağlı tüketimini gösterdi (Şekil 2D). Mitokondriyal protein yıkımı ve stres yanıtında rol alan bazı adayların, Lonp1, Afg3l2 ve Clpx ve OXPHOS kompleks montaj faktörleri de dahil olmak üzere, yukarı regüle edildiğini bulduk. Apoptosise dahil olan proteinlerin seviyelerinde önemli bir değişiklik tespit edilmedi (Şekil S2B). Benzer şekilde, kalsiyum taşınmasında rol alan mitokondri ve endoplazmik retikulum kanallarında sadece küçük değişiklikler olduğunu bulduk (Şekil S2C). Ek olarak, otofaji ile ilgili proteinlerin değerlendirilmesinde önemli bir değişiklik bulunmadı; bu da immünohistokimya ve elektron mikroskobu ile in vivo olarak gözlemlenen otofagozomların görünür indüksiyonuyla tutarlıdır (Şekil S3). Bununla birlikte, PN'lerdeki ilerleyici OXPHOS disfonksiyonuna belirgin ultrastrüktürel mitokondriyal değişiklikler eşlik etmektedir. 5 ve 8 haftalık Mfn2cKO PN'lerin hücre gövdelerinde ve dendritik ağaçlarında mitokondriyal kümeler görülebilir ve iç zar yapısı önemli değişikliklere uğramıştır (Şekil S4, A ve B). Bu ultrastrüktürel değişiklikler ve mtDNA'daki önemli azalma ile tutarlı olarak, tetrametilrodamin metil ester (TMRM) ile akut serebral serebellar dilimlerin analizi, Mfn2cKO PN'lerdeki mitokondriyal membran potansiyelinin önemli ölçüde azaldığını göstermiştir (Şekil S4C).
(A) OXPHOS kompleksinin ekspresyon seviyesinin zaman içindeki değişimini gösteren analiz. Sadece 8. haftada P<0,05 olan proteinler dikkate alınmıştır (iki yönlü ANOVA). Noktalı çizgi: CTRL ile karşılaştırıldığında herhangi bir ayarlama yapılmamıştır. (B) Sol: Anti-MTCO1 antikoru ile etiketlenmiş bir serebellar kesit örneği (ölçek çubuğu, 20 μm). Purkinje hücre gövdelerinin kapladığı alan sarı ile gösterilmiştir. Sağ: MTCO1 seviyelerinin kantifikasyonu (tek yönlü varyans analizi; üç fareden analiz edilen 7 ila 20 hücre). (C) Sıralanmış PN'deki mtDNA kopya sayısının qPCR analizi (tek yönlü varyans analizi; 3 ila 7 fare). (D) Sol: Anti-DNA antikoru ile etiketlenmiş bir serebellar dilim örneği (ölçek çubuğu, 20 μm). Purkinje hücre gövdelerinin kapladığı alan sarı ile gösterilmiştir. Sağ: mtDNA lezyonlarının nicelendirilmesi (tek yönlü varyans analizi; üç fareden 5 ila 9 hücre). (E) Tüm hücre yama kelepçesi kaydında mitoYFP + Purkinje hücrelerini (ok) gösteren akut bir serebellar kesit örneği. (F) IV eğrisinin nicelendirilmesi. (G) CTRL ve Mfn2cKO Purkinje hücrelerinde depolarize edici akım enjeksiyonunun temsili kayıtları. Üst iz: AP'yi tetikleyen ilk darbe. Alt iz: Maksimum AP frekansı. (H) Postsinaptik spontan girdilerin (sPSP'ler) nicelendirilmesi. Temsili kayıt izi ve yakınlaştırma oranı (I)'de gösterilmiştir. Tek yönlü varyans analizi, üç fareden 5 ila 20 hücreyi analiz etmiştir. Veriler ortalama±SEM olarak ifade edilmiştir; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Delikli yama kelepçesi modu kullanılarak kaydedilen spontan AP'nin temsili izleri. Üstteki iz: Maksimum AP frekansı. Alttaki iz: Tek bir AP'nin yakınlaştırılmış görüntüsü. (K) (J)'ye göre ortalama ve maksimum AP frekansını nicelendirin. Mann-Whitney testi; dört fareden 5 hücre analiz edildi. Veriler ortalama±SEM olarak ifade edilmiştir; önemli değil.
8 haftalık Mfn2cKO PN'de belirgin OXPHOS hasarı tespit edildi ve bu da nöronların fizyolojik fonksiyonunun ciddi derecede anormal olduğunu gösterdi. Bu nedenle, akut serebellar dilimlerde tüm hücre yama kelepçesi kayıtları yaparak 4-5 haftalık ve 7-8 haftalık OXPHOS eksikliği olan nöronların pasif elektriksel özelliklerini analiz ettik (Şekil 2E). Beklenmedik bir şekilde, Mfn2cKO nöronlarının ortalama dinlenme membran potansiyeli ve giriş direnci, hücreler arasında ince farklılıklar olmasına rağmen, kontrol grubuyla benzerdi (Tablo 1). Benzer şekilde, 4-5 haftalık yaşta, akım-voltaj ilişkisinde (IV eğrisi) önemli bir değişiklik bulunmadı (Şekil 2F). Bununla birlikte, 7-8 haftalık Mfn2cKO nöronlarının hiçbiri IV rejiminden (hiperpolarizasyon adımı) sağ çıkmadı; bu da bu geç aşamada hiperpolarizasyon potansiyeline karşı belirgin bir duyarlılık olduğunu gösteriyor. Bunun aksine, Mfn2cKO nöronlarında, tekrarlayan aksiyon potansiyeli (AP) deşarjlarına neden olan depolarize edici akımlar iyi tolere edilmektedir; bu da genel deşarj modellerinin 8 haftalık kontrol nöronlarınınkinden önemli ölçüde farklı olmadığını göstermektedir (Tablo 1 ve Şekil 2G). Benzer şekilde, spontan postsinaptik akımların (sPSC) frekansı ve genliği kontrol grubuyla karşılaştırılabilir düzeydeydi ve olayların frekansı 4 haftadan 5 haftaya, 7 haftaya ve 8 haftaya kadar benzer bir artışla yükseldi (Şekil 2, H ve I). PN'lerdeki sinaptik olgunlaşma dönemi (25). Delikli PN yamalarından sonra da benzer sonuçlar elde edildi. Bu konfigürasyon, tüm hücre yama kelepçesi kaydında olabileceği gibi, hücresel ATP kusurlarının olası telafisini önler. Özellikle, Mfn2cKO nöronlarının dinlenme membran potansiyeli ve spontan ateşleme frekansı etkilenmedi (Şekil 2, J ve K). Özetle, bu sonuçlar, belirgin OXPHOS disfonksiyonu olan PN'lerin yüksek frekanslı deşarj paternleriyle iyi başa çıkabildiğini ve neredeyse normal elektrofizyolojik yanıtları korumalarına olanak tanıyan bir telafi mekanizmasının var olduğunu göstermektedir.
Veriler ortalama ± standart hata (tek yönlü varyans analizi, Holm-Sidak çoklu karşılaştırma testi; *P<0,05) olarak ifade edilmiştir. Ünite numarası parantez içinde belirtilmiştir.
Proteomik veri setindeki (Şekil 1G) herhangi bir kategorinin, şiddetli OXPHOS eksikliğini giderebilecek yolları içerip içermediğini ve böylece etkilenen PN'nin neden normale yakın elektrofizyolojiyi koruyabildiğini (Şekil 2, E ila K) açıklayıp açıklamadığını araştırmak üzere yola çıktık. Proteomik analiz, dallı zincirli amino asitlerin (BCAA) katabolizmasında yer alan enzimlerin önemli ölçüde yukarı düzenlendiğini (Şekil 3A ve Şekil S5A) ve son ürün asetil-CoA (CoA) veya süksinil CoA'nın, ateroskleroz Asit (TCA) döngüsündeki trikarboksilatları destekleyebileceğini gösterdi. BCAA transaminaz 1 (BCAT1) ve BCAT2'nin içeriğinin her ikisinin de arttığını bulduk. Bunlar, α-ketoglutarattan glutamat üreterek BCAA katabolizmasının ilk adımını katalize eder (26). Dallı zincirli keto asit dehidrojenaz (BCKD) kompleksini oluşturan tüm alt birimler yukarı regüle edilmiştir (kompleks, ortaya çıkan BCAA karbon iskeletinin daha sonraki ve geri dönüşümsüz dekarboksilasyonunu katalize eder) (Şekil 3A ve Şekil S5A). Bununla birlikte, sıralanmış PN'lerde BCAA'nın kendisinde belirgin bir değişiklik bulunmamıştır; bu durum, bu temel amino asitlerin hücresel alımının artmasından veya TCA döngüsünü desteklemek için diğer kaynakların (glikoz veya laktik asit) kullanılmasından kaynaklanıyor olabilir (Şekil S5B). OXPHOS'tan yoksun PN'ler ayrıca 8 haftalık yaşta glutamin parçalanması ve transaminasyon aktivitelerinde artış göstermiştir; bu durum, mitokondriyal enzimler glutaminaz (GLS) ve glutamin piruvat transaminaz 2'nin (GPT2) yukarı regülasyonu ile yansıtılabilir (Şekil 3, A ve C). GLS'nin yukarı düzenlenmesinin, eklenmiş izoform glutaminaz C (GLS-GAC) ile sınırlı olduğunu (Mfn2cKO/CTRL'deki değişim yaklaşık 4,5 kat, P = 0,05) ve kanser dokularındaki spesifik yukarı düzenlenmesinin mitokondriyal biyoenerjiyi destekleyebileceğini belirtmekte fayda var. (27).
(A) Isı haritası, belirtilen yol için 8. haftadaki protein seviyesindeki katlanma değişimini göstermektedir. (B) Anti-PCx antikoru ile etiketlenmiş bir serebellar dilim örneği (ölçek çubuğu, 20 μm). Sarı ok, Purkinje hücre gövdesini göstermektedir. (C) Ateroskleroz için önemli bir aday olarak tanımlanan protein ekspresyonunun zaman içindeki değişimini gösteren analiz (çoklu t-testi, *FDR <%5; n = 3-5 fare). (D) Üstte: [1-13C]piruvat izleyicisinde bulunan etiketli karbonun farklı giriş yollarını gösteren şematik bir diyagram (yani, PDH veya trans-arteriyel yol yoluyla). Altta: Keman grafiği, akut serebellar dilimlerin [1-13C]piruvat ile etiketlenmesinden sonra aspartik asit, sitrik asit ve malik aside dönüştürülen tek etiketli karbonun (M1) yüzdesini göstermektedir (eşleştirilmiş t-testi; ** P <0,01). (E) Belirtilen yolun kapsamlı zaman geçmişi analizi. Sadece 8. haftada P<0,05 olan proteinleri dikkate alın. Kesikli çizgi: düzeltme değeri yok (iki yönlü varyans analizi; * P <0,05; *** P <0,001). Veriler ortalama±SEM olarak ifade edilmiştir.
Analizimizde, BCAA katabolizması, temel yukarı düzenleme yollarından biri haline gelmiştir. Bu gerçek, OXPHOS'tan yoksun PN'de TCA döngüsüne giren ventilasyon hacminin değişebileceğini güçlü bir şekilde düşündürmektedir. Bu, nöronal fizyoloji ve hayatta kalma üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olabilecek, nöronal metabolik yeniden düzenlemenin önemli bir biçimini temsil edebilir; bu durum, şiddetli OXPHOS disfonksiyonunun sürdürülmesi sırasında ortaya çıkabilir. Bu hipotezle tutarlı olarak, piruvatın oksaloasetata (28) dönüşümünü katalize eden ana anti-aterosklerotik enzim PCx'in yukarı düzenlendiğini bulduk (Mfn2cKO/CTRL yaklaşık 1,5 kat değişiyor; Şekil 3A), bunun beyin dokusunda ekspresyonunun astrositlerle sınırlı olduğuna inanılmaktadır (29, 30). Proteomik sonuçlarla tutarlı olarak, konfokal mikroskopi, PCx ekspresyonunun OXPHOS eksikliği olan PN'lerde spesifik ve önemli ölçüde arttığını, PCx reaktivitesinin ise kontrol grubunda esas olarak bitişik Bergmann glial hücreleriyle sınırlı olduğunu gösterdi (Şekil 3B). Gözlemlenen PCx artışını fonksiyonel olarak test etmek için, akut serebellar dilimleri [1-13C]piruvat izleyici ile tedavi ettik. Piruvat, piruvat dehidrojenaz (PDH) tarafından oksitlendiğinde, izotop etiketi kayboldu, ancak piruvat vasküler reaksiyonlarla metabolize edildiğinde TCA döngüsü ara ürünlerine dahil edildi (Şekil 3D). Proteomik verilerimizi desteklemek amacıyla, Mfn2cKO dilimlerinin aspartik asidinde bu izleyiciden çok sayıda belirteç gözlemledik, sitrik asit ve malik asit de anlamlı olmasa da orta derecede bir eğilim gösterdi (Şekil 3D).
Mitokondriyal transkripsiyon faktörü A genini (Tfam) spesifik olarak yok eden dopamin nöronlarının neden olduğu mitokondriyal disfonksiyonlu MitoPark farelerinin dopamin nöronlarında (Şekil S6B), PCx ekspresyonu da önemli ölçüde yukarı düzenlenmiştir (31), bu da aseton asit aterosklerozunun oluşumunun vücuttaki nöronal OXPHOS disfonksiyonu sırasında düzenlendiğini göstermektedir. Arteriyosklerozla ilişkili olabilecek nöronlarda ifade edilebilecek benzersiz enzimlerin (32-34), OXPHOS'tan yoksun PN'lerde önemli ölçüde yukarı düzenlendiği bulunmuştur; bunlar arasında propionil-CoA karboksilaz (PCC-A), malonil-CoA'yı süksinil-CoA'ya dönüştüren ve ana rolü malattan piruvatı geri kazanmak olan mitokondriyal malik enzim 3 (ME3) (Şekil 3, A ve C) (33, 35) yer almaktadır. Ek olarak, PDH'yi fosforlayarak etkisiz hale getiren Pdk3 enziminde önemli bir artış bulduk (36), oysa PDH'yi aktive eden Pdp1 enziminde veya PDH enzim kompleksinin kendisinde herhangi bir değişiklik tespit edilmedi (Şekil 3A). Buna paralel olarak, Mern2cKO PN'lerde, PDH kompleksinin piruvat dehidrojenaz E1 bileşeninin α1 alt birimi α (PDHE1α) alt biriminin Ser293'te (PDH'nin enzim aktivitesini inhibe ettiği bilinen) fosforilasyonu artmıştır (Şekil S6C). Piruvatın damar erişimi yoktur.
Son olarak, aktivasyon süreci sırasında, raporlara göre, serin ve glisin biyosentezinin süper yolunun, ilgili mitokondriyal folat (1C) döngüsünün ve prolin biyosentezinin (Şekil 1G ve Şekil S5C) önemli ölçüde yukarı düzenlendiğini bulduk. Çevre dokular mitokondriyal disfonksiyonla aktive olur (5-7). Bu proteomik verileri destekleyen konfokal analiz, OXPHOS eksikliği olan PN'de, 8 haftalık farelerin serebellar dilimlerinin, mitokondriyal folat döngüsünün anahtar enzimi olan serin hidroksimetiltransferaz 2'ye (SHMT2) maruz bırakıldığını gösterdi. Önemli bir bağışıklık yanıtı (Şekil S5D). 13 CU-glukoz inkübe edilmiş akut serebellar dilimlerde, metabolik izleme deneyleri, serin ve prolin biyosentezinin yukarı düzenlenmesini daha da doğruladı ve karbon izoformlarının serin ve proline akışının arttığını gösterdi (Şekil S5E). GLS ve GPT2 tarafından desteklenen reaksiyonlar, glutaminden glutamat sentezinden ve glutamat ile α-ketoglutarat arasındaki transaminasyondan sorumlu olduğundan, bunların yukarı regülasyonu, OXPHOS eksikliği olan nöronların glutamata olan ihtiyacının arttığını gösterir. Bu, prolin biyosentezinin artışını sürdürmeyi amaçlıyor olabilir (Şekil S5C). Bu değişikliklerin aksine, PN'ye özgü Mfn2cKO farelerinden elde edilen serebellar astrositlerin proteomik analizi, bu yolların (tüm antiperoksidazlar dahil) ekspresyonunda önemli bir değişiklik göstermediğini ortaya koymuştur; bu da bu metabolik yönlendirmenin, bozulmuş PN'ye özgü olduğunu göstermektedir (Şekil S6, D ila G).
Özetle, bu analizler, PN'lerde belirli metabolik yolların zamansal aktivasyonunda önemli ölçüde farklı kalıplar ortaya koymuştur. Anormal nöronal mitokondriyal fonksiyon, erken ateroskleroza ve 1C yeniden şekillenmesine (Şekil 3E ve Şekil S5C) ve hatta I ve IV komplekslerinin ekspresyonunda öngörülebilir değişikliklere yol açabilse de, serin de novo sentezindeki değişiklikler yalnızca geç aşamalarda belirgin hale gelmiştir. OXPHOS disfonksiyonu (Şekil 3E ve Şekil S5C). Bu bulgular, stres kaynaklı mitokondriyal (1C döngüsü) ve sitoplazmik (serin biyosentezi) yanıtın, nöronal metabolizmayı yeniden şekillendirmek için TCA döngüsündeki ateroskleroz artışıyla sinerjik olarak çalıştığı sıralı bir süreci tanımlar.
8 haftalık OXPHOS eksikliği olan PN'ler, yüksek frekanslı uyarım aktivitesini sürdürebilir ve mitokondriyal disfonksiyonu telafi etmek için önemli metabolik yeniden bağlantıya uğrayabilir. Bu keşif, bu hücrelerin şu anda bile nörodejenerasyonu geciktirmek veya önlemek için terapötik müdahale alabileceği ilginç bir olasılığı ortaya koymaktadır. Bu olasılığı iki bağımsız müdahale ile çözdük. İlk yöntemde, MFN2'nin in vivo olarak OXPHOS eksikliği olan PN'lerde seçici olarak ifade edilebilmesi için Cre'ye bağımlı bir adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü tasarladık (Şekil S7A). MFN2 ve floresan raporlayıcı gen mCherry'yi kodlayan AAV (Mfn2-AAV), in vitro birincil nöron kültürlerinde doğrulandı; bu da MFN2'nin Cre'ye bağımlı bir şekilde ifade edilmesine ve mitokondriyal morfolojinin kurtarılmasına neden olarak Mfn2cKO nöronlarında nöromutasyonu önledi (Şekil S7, B, D ve E). Daha sonra, 8 haftalık Mfn2-AAV'yi Mfn2cKO ve kontrol farelerinin serebellar korteksine stereotaktik olarak iletmek için in vivo deneyler gerçekleştirdik ve 12 haftalık fareleri analiz ettik (Şekil 4A). Tedavi edilen Mfn2cKO fareleri öldü (Şekil 1, A ve B) (16). İn vivo viral transdüksiyon, bazı serebellar halkalarda PN'nin seçici ekspresyonuna neden oldu (Şekil S7, G ve H). Sadece mCherry eksprese eden kontrol AAV'nin (Ctrl-AAV) enjeksiyonu, Mfn2cKO hayvanlarında nörodejenerasyon derecesi üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi. Buna karşılık, Mfn2-AAV ile transdüksiyon yapılan Mfn2cKO'ların analizi, PN hücre tabakasının önemli bir koruyucu etkisini gösterdi (Şekil 4, B ve C). Özellikle, nöron yoğunluğu kontrol hayvanlarından neredeyse ayırt edilemez görünmektedir (Şekil 4, B ve C ve Şekil S7, H ve I). MFN1'in ekspresyonu, MFN2'nin aksine, nöronal ölümü önlemede eşit derecede etkilidir (Şekil 4C ve Şekil S7, C ve F), bu da ektopik MFN1 ekspresyonunun MFN2 eksikliğini etkili bir şekilde telafi edebileceğini göstermektedir. Tek PN düzeyinde yapılan daha ileri analizler, Mfn2-AAV'nin mitokondrilerin ultrastrüktürünü büyük ölçüde kurtardığını, mtDNA seviyelerini normalleştirdiğini ve anti-anjiyogenez belirteci PCx'in yüksek ekspresyonunu tersine çevirdiğini göstermiştir (Şekil 4, C ila E). Dinlenme durumunda kurtarılan Mfn2cKO farelerinin görsel incelemesi, duruşlarının ve motor semptomlarının (hareket S1 ila S3) iyileştiğini göstermiştir. Sonuç olarak, bu deneyler, OXPHOS açısından ciddi derecede yetersiz olan PN'lere MFN2'nin gecikmeli olarak yeniden verilmesinin, mtDNA tüketimini tersine çevirmek ve aterosklerozu indüklemek için yeterli olduğunu, böylece in vivo olarak akson dejenerasyonunu ve nöronal ölümü önlediğini göstermektedir.
(A) Belirtilen metabolik yol aktif hale geldiğinde MFN2 kodlayan AAV'nin enjeksiyonu için deneysel programı gösteren bir şema. (B) Mfn2cKO farelerinde 8. haftada transdüksiyon uygulanan ve anti-Calbindin antikoru ile etiketlenen 12 haftalık serebellar dilimlerin temsili konfokal görüntüleri. Sağ: Akson liflerinin ölçeklendirilmesi. Akson yakınlaştırmasının ölçeği 450 ve 75 μm'dir. (C) Sol: AAV transdüksiyon döngüsündeki (AAV+) Purkinje hücresi yoğunluğunun nicelendirilmesi (tek yönlü varyans analizi; n = 3 fare). Sağ: 12. haftada transdüksiyon uygulanan PN'de mtDNA odak analizi (eşleştirilmemiş t-testi; n = üç fareden 6 hücre). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Belirtilen viral vektörlerle transdüksiyon uygulanan Mfn2cKO serebellar kesitlerinin PN'lerinin temsili transmisyon elektron mikrografları. Pembe maske, dendritlerin kapladığı alanı, sarı noktalı kare ise sağda sağlanan yakınlaştırmayı göstermektedir; n çekirdeği temsil eder. Ölçek çubuğu, 1 μm. (E) 12 haftada transdüksiyon uygulanan PN'de PCx boyamasının bir örneğini göstermektedir. Ölçek çubuğu, 20 μm. OE, aşırı ifade; FC, kat değişim.
Son olarak, OXPHOS disfonksiyonu yaşamış PN'lerde peroksidaz kaynaklı hücre sağkalımının önemini araştırdık. Fare PCx mRNA'sını spesifik olarak hedefleyen mCherry kodlayan AAV-shRNA (kısa saç tokası RNA) (AAV-shPCx) ürettik ve virüsü veya karıştırılmış kontrolünü (AAV-scr) Mfn2cKO farelerinin beyinciklerine enjekte ettik. Enjeksiyon, PCx ekspresyonunun arttığı (Şekil 3C) ve PN hücre tabakasının hala sağlam olduğu (Şekil 1A) dönemde etkili PCx baskılanması sağlamak için dördüncü haftada gerçekleştirildi (Şekil 5A). PCx'in baskılanmasının (Şekil S8A), enfekte halka ile sınırlı olan PN ölümünün önemli ölçüde hızlanmasına yol açtığını belirtmekte fayda var (Şekil 5, B ve C). PCx yukarı regülasyonunun neden olduğu metabolik etkilerin mekanizmasını anlamak için, PCx baskılanmasından sonra PN'lerin redoks durumunu inceledik ve glutatyonun nispi değişimini değerlendirmek için AAV aracılı optik biyosensör Grx1-roGFP2'yi eş zamanlı olarak ifade ettik (Şekil S8, B ila D) (38). Daha sonra, FLIM koşullarını doğruladıktan sonra sitoplazmik redoks durumundaki potansiyel değişiklikleri tespit etmek için 7 haftalık Mfn2cKO veya kontrol kardeşlerinin akut beyin dilimlerinde iki fotonlu floresans ömür görüntüleme mikroskobu (FLIM) uyguladık (Şekil S8, E ila G). Analiz, PCx ekspresyonu bulunmayan tek bir Mfn2cKO PN'nin oksidasyon durumunda önemli bir artış olduğunu gösterdi; bu, kontrol nöronlarından veya yalnızca karıştırılmış shRNA ifade eden Mfn2cKO PN'lerden farklıdır (Şekil 5, D ve E). PCx ekspresyonu azaltıldığında, yüksek oranda oksitlenmiş durumda olan Mfn2cKO PN'lerin yüzdesi üç kattan fazla arttı (Şekil 5E), bu da PCx yukarı regülasyonunun dejenere olmuş nöronların redoks kapasitesini koruduğunu gösteriyor.
(A) Belirtilen metabolik yol aktive edildiğinde shPCx kodlayan AAV'nin enjeksiyonu için deneysel programı gösteren bir şema. (B) 4 haftalık Mfn2cKO farelerinde transdüksiyon uygulanmış ve anti-kalsineurin antikoru ile etiketlenmiş 8 haftalık serebellar kesitlerin temsili konfokal fotoğrafları. Ölçek çubuğu, 450 μm. (C) AAV transdüksiyonlu halkalardaki Purkinje hücresi yoğunluğunun nicel değerlendirmesi (tek yönlü varyans analizi; n = 3 ila 4 fare). Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir; ***P<0,001. (D) Temsili FLIM görüntüsü, belirtilen deneysel koşullar altında glutatyon redoks sensörü Grx1-roGFP2'yi ifade eden 7 haftalık PN'nin ortalama yaşam süresini göstermektedir. LUT (arama tablosu) oranı: hayatta kalma zaman aralığı (pikosananiye cinsinden). Ölçek çubuğu, 25 μm. (E) Histogram, (D)'den elde edilen Grx1-roGFP2 ömür değerlerinin dağılımını göstermektedir (her koşul altında iki farede n=158 ila 368 hücre). Her histogramın üzerindeki pasta grafiği: CTRL-AAV-scr'deki ortalama ömür değerinin 1 SD'sini aşan, anlamlı derecede daha uzun (kırmızı, oksitlenmiş) veya daha kısa (mavi, indirgenmiş) ömür değerlerine sahip hücre sayısını göstermektedir. (F) Önerilen model, nöronal PCx'in yukarı düzenlenmesinin koruyucu etkisini göstermektedir.
Özetle, burada sunduğumuz veriler, MFN2'nin yeniden ekspresyonunun, şiddetli OXPHOS eksikliği, şiddetli mtDNA tükenmesi ve son derece anormal ista benzeri morfolojiye sahip ileri PN'yi tamamen kurtarabileceğini ve böylece ileri hastalıklarda bile sürekli ilerleme sağlayabileceğini göstermektedir. Nörodejenerasyon, hücre ölümünden önceki aşamanın geri dönüşümlü kanıtını sağlar. Bu metabolik esneklik derecesi, nöronların aterosklerozu (TCA döngüsünün yeniden düzenlenmesi) indükleme yeteneğiyle daha da vurgulanmaktadır; bu da OXPHOS eksikliği olan PN'lerde PCx ekspresyonunu inhibe eder ve hücre ölümünü artırarak koruyucu bir rol oynar (Şekil 5F).
Bu çalışmada, PN'lerin OXPHOS disfonksiyonuna verdiği yanıtın, metabolik programlar tarafından aktive edilen farklı aktivasyon yoluyla kademeli olarak TCA döngüsü aterosklerozuna yakınsadığı yönünde kanıtlar sunduk. Proteomik analizi birçok tamamlayıcı yöntemle doğruladık ve şiddetli mitokondriyal disfonksiyonla karşı karşıya kaldıklarında nöronların daha önce bilinmeyen bir metabolik esneklik biçimine sahip olduğunu ortaya koyduk. Şaşırtıcı bir şekilde, tüm yeniden yapılandırma süreci, nörodejenerasyona eşlik eden terminal metabolik durumu kademeli ve geri dönüşümsüz olarak mutlaka işaret etmiyor, ancak verilerimiz, hücre ölümünden önceki aşamada bile bir bakım nöronu işlevsel telafi mekanizması oluşturabileceğini düşündürüyor. Bu bulgu, nöronların vücutta önemli derecede metabolik plastisiteye sahip olduğunu göstermektedir. Bu gerçek, MFN2'nin daha sonra yeniden tanıtılmasının, temel metabolik belirteçlerin ifadesini tersine çevirebileceğini ve PN dejenerasyonunu önleyebileceğini kanıtlamaktadır. Aksine, aterosklerozu inhibe eder ve sinirleri hızlandırır.
Araştırmamızdaki en ilgi çekici bulgulardan biri, OXPHOS'tan yoksun PN'lerin, özellikle aterosklerozu uyaran enzimleri yukarı düzenleyerek TCA döngüsü metabolizmasını değiştirebilmesidir. Metabolik yeniden düzenleme, bazıları solunum zincirini çalıştıran ve lipid ve nükleotid biyosentezi öncüllerinin üretimini sürdüren indirgeyici eşdeğerler üretmek için TCA döngüsü ara ürünlerini desteklemek üzere glutamine dayanan kanser hücrelerinin ortak bir özelliğidir (39, 40). Yakın zamanda yapılan bir çalışma, OXPHOS disfonksiyonu yaşayan periferik dokularda glutamin/glutamat metabolizmasının yeniden bağlanmasının da belirgin bir özellik olduğunu göstermiştir (5, 41), burada glutaminin TCA döngüsüne giriş yönü, OXPHOS hasarının şiddetine bağlıdır (41). Bununla birlikte, vücuttaki nöronal metabolik plastisitenin herhangi bir benzerliği ve hastalık bağlamındaki olası önemi konusunda net bir kanıt bulunmamaktadır. Son zamanlarda yapılan bir in vitro çalışmada, birincil kortikal nöronların nörotransmisyon için glutamat havuzlarını harekete geçirdiği ve böylece metabolik stres koşulları altında oksidatif metabolizmayı ve aterosklerozu desteklediği gösterilmiştir (42). TCA döngüsü enzimi süksinat dehidrogenazın farmakolojik inhibisyonu altında, piruvat karboksilasyonunun kültürlenmiş serebellar granül nöronlarında oksaloasetat sentezini koruduğuna inanılmaktadır (34). Bununla birlikte, bu mekanizmaların beyin dokusuna (aterosklerozun esas olarak astrositlerle sınırlı olduğuna inanılan) fizyolojik önemi hala önemli fizyolojik öneme sahiptir (43). Bu durumda, verilerimiz, vücutta OXPHOS tarafından hasar gören PN'lerin, TCA havuzu ara ürünlerinin takviyesinin iki ana kaynağı olan BCAA bozunmasına ve piruvat karboksilasyonuna geçebileceğini göstermektedir. Her ne kadar BCAA katabolizmasının nöronal enerji metabolizmasına olası katkısı, glutamat ve GABA'nın nörotransmisyon rolüne ek olarak önerilmiş olsa da (44), bu mekanizmaların in vivo olarak varlığına dair henüz bir kanıt bulunmamaktadır. Bu nedenle, işlevsiz PN'lerin, asimilasyon süreci tarafından yönlendirilen TCA ara ürünlerinin tüketimini aterosklerozu artırarak otomatik olarak telafi edebileceğini tahmin etmek kolaydır. Özellikle, mitokondriyal disfonksiyonlu çoğalan hücrelerde önerildiği gibi (45), aspartik asit için artan talebi sürdürmek için PCx'in yukarı düzenlenmesi gerekebilir. Bununla birlikte, metabolomik analizimiz, Mfn2cKO PN'lerinde aspartik asidin kararlı durum seviyesinde önemli bir değişiklik ortaya koymadı (Şekil S6A), bu da muhtemelen çoğalan hücreler ve mitoz sonrası nöronlar arasında aspartik asidin farklı metabolik kullanımını yansıtmaktadır. Her ne kadar in vivo işlevsiz nöronlarda PCx yukarı regülasyonunun kesin mekanizması henüz karakterize edilmemiş olsa da, bu erken yanıtın nöronların redoks durumunu korumada önemli bir rol oynadığını gösterdik; bu, serebellar dilimler üzerinde yapılan FLIM deneylerinde gösterilmiştir. Özellikle, PN'lerin PCx'i yukarı regüle etmesini önlemek, daha oksitlenmiş bir duruma yol açabilir ve hücre ölümünü hızlandırabilir. BCAA bozunmasının aktivasyonu ve piruvatın karboksilasyonu, mitokondriyal disfonksiyonun periferik dokularını karakterize etmenin yolları değildir (7). Bu nedenle, nörodejenerasyon için önemli olan tek özellik olmasa bile, OXPHOS eksikliği olan nöronların öncelikli bir özelliği gibi görünmektedirler.
Serebellar hastalık, genellikle ataksi olarak kendini gösteren ve sıklıkla PN'lere zarar veren heterojen bir nörodejeneratif hastalık türüdür (46). Bu nöron popülasyonu, mitokondriyal disfonksiyona karşı özellikle hassastır çünkü farelerdeki seçici dejenerasyonları, insan spinoserebellar ataksisini karakterize eden birçok motor semptomu yeniden üretmek için yeterlidir (16, 47, 48). Raporlara göre, mutant bir gene sahip transgenik bir fare modeli, insan spinoserebellar ataksisi ile ilişkilidir ve mitokondriyal disfonksiyona sahiptir (49, 50), bu da PNPH'de OXPHOS eksikliğinin sonuçlarını incelemenin önemini vurgulamaktadır. Bu nedenle, bu benzersiz nöron popülasyonunu etkili bir şekilde izole etmek ve incelemek özellikle uygundur. Bununla birlikte, PN'lerin basınca çok duyarlı olması ve tüm serebellar hücre popülasyonunun düşük bir oranını oluşturması nedeniyle, birçok omik tabanlı çalışma için, bunların bütün hücreler olarak seçici olarak ayrılması hala zorlu bir konudur. Diğer hücre tiplerinin (özellikle yetişkin dokuların) kontaminasyonundan tamamen arınmış bir şekilde elde edilmesi neredeyse imkansız olsa da, aşağı akış proteomik analizi için yeterli sayıda canlı nöron elde etmek amacıyla etkili bir ayrıştırma adımını FACS ile birleştirdik ve tüm serebellumun mevcut veri setine kıyasla oldukça yüksek protein kapsamına (yaklaşık 3000 protein) sahibiz (51). Tüm hücrelerin canlılığını koruyarak, burada sunduğumuz yöntem, yalnızca mitokondrideki metabolik yollardaki değişiklikleri kontrol etmemize değil, aynı zamanda sitoplazmik karşılıklarındaki değişiklikleri de kontrol etmemize olanak tanır; bu da hücre tipini zenginleştirmek için mitokondriyal membran etiketlerinin kullanımını tamamlar. Karmaşık dokulardaki mitokondri sayısı için yeni yöntem (52, 53). Tanımladığımız yöntem yalnızca Purkinje hücrelerinin incelenmesiyle ilgili değildir, aynı zamanda mitokondriyal disfonksiyonun diğer modelleri de dahil olmak üzere, hastalıklı beyinlerdeki metabolik değişiklikleri ele almak için herhangi bir hücre tipine kolayca uygulanabilir.
Son olarak, bu metabolik yeniden düzenleme sürecinde, hücresel stresin temel belirtilerini tamamen tersine çevirebilen ve nöronal dejenerasyonu önleyebilen bir terapötik pencere belirledik. Bu nedenle, burada açıklanan yeniden bağlantının fonksiyonel etkilerini anlamak, mitokondriyal disfonksiyon sırasında nöronal canlılığı korumaya yönelik olası tedaviler hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu ilkenin diğer nörolojik hastalıklara uygulanabilirliğini tam olarak ortaya koymak için, diğer beyin hücresi tiplerindeki enerji metabolizmasındaki değişiklikleri incelemeyi amaçlayan gelecekteki araştırmalara ihtiyaç vardır.
MitoPark fareleri daha önce tanımlanmıştır (31). Mfn2 genlerini çevreleyen loxP'ye sahip C57BL/6N fareleri daha önce tanımlanmıştır (18) ve L7-Cre fareleriyle çaprazlanmıştır (23). Elde edilen çift heterozigot yavrular daha sonra Mfn2 için Purkinje'ye özgü gen nakavtları (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) oluşturmak üzere homozigot Mfn2loxP/Mfn2loxP fareleriyle çaprazlanmıştır. Çiftleşmenin bir alt kümesinde, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP aleli (stop-mtYFP) ek çaprazlamalar yoluyla tanıtılmıştır (20). Tüm hayvan prosedürleri Avrupa, ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Almanya, Kuzey Ren-Vestfalya, LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz tarafından onaylanmıştır. Hayvan çalışmaları ayrıca Avrupa Laboratuvar Hayvan Bilimleri Dernekleri Federasyonu'nun yönergelerine de uymaktadır.
Hamile kadının servikal dislokasyonu anestezi uygulandıktan sonra fare embriyosu izole edildi (E13). Korteks, 10 mM Hepes ile desteklenmiş Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi'nde (HBSS) diseke edildi ve papain (20 U/ml) ve sistein (1 μg/ml) içeren Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı'nda (DMEM) geçirildi. Doku, DMEM'de inkübe edildi ve enzimatik sindirimle ayrıştırıldı. 37°C'de 20 dakika boyunca DMEM'de inkübe edildi ve ardından %10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM'de mekanik olarak öğütüldü. Hücreler, polilizin ile kaplanmış cam lameller üzerine 6 cm'lik kültür kabında 2×10⁶ hücre yoğunluğunda veya görüntüleme analizi için 0,5×10⁵ hücre/cm² yoğunluğunda ekildi. 4 saat sonra ortam, %1 B27 takviyesi ve 0,5 mM GlutaMax içeren Neurobasal serumsuz ortam ile değiştirildi. Nöronlar daha sonra deney boyunca 37°C ve %5 CO2'de tutuldu ve haftada bir kez beslendi. İn vitro rekombinasyonu indüklemek için, ikinci gün in vitro olarak nöronlara aşağıdaki AAV9 virüs vektörünün 3 μl'si (24 kuyucuklu kültür kabı) veya 0,5 μl'si (24 kuyucuklu plaka) uygulandı: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, katalog numarası 105530-AAV9) ve AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalog numarası 105545-AAV9).
Fare Mfn1 ve Mfn2 tamamlayıcı DNA'ları (sırasıyla Addgene plazmid #23212 ve #23213'ten elde edilmiştir) C-terminalinde V5 dizisi (GKPIPNPLLGLDST) ile işaretlenmiştir ve T2A dizisi üzerinden çerçeve içinde mCherry ile birleştirilmiştir. Grx1-roGFP2, Heidelberg TP Dick DFKZ'den (Deutsches Krebsforschungszentrum) bir hediyedir. Geleneksel klonlama yöntemleri kullanılarak tdTomato kaseti değiştirilerek, kaset pAAV-CAG-FLEX-tdTomato omurgasına (Addgene referans numarası 28306) alt klonlanarak pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ve pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektörleri oluşturuldu. Kontrol vektörü pAAV-CAG-FLEX-mCherry'yi oluşturmak için de benzer bir strateji kullanıldı. AAV-shPCx yapısını oluşturmak için, fare PCx'i hedefleyen shRNA'yı kodlayan DNA dizisini (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) içeren bir plazmid AAV vektörü (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) gereklidir. U6 promotörünün kontrolü altında, mCherry, CMV promotörünün kontrolü altında kullanılır. Yardımcı AAV vektörlerinin üretimi, üreticinin talimatlarına göre (Cell Biolabs) gerçekleştirilmiştir. Özetle, kalsiyum fosfat yöntemi kullanılarak 293AAV hücrelerine geçici olarak mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) veya Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodlayan genin yanı sıra AAV1 kapsid proteini ve aksesuar proteini kodlayan bir paketleme plazmidi ile transfeksiyon yapılır. Ham virüs süpernatantı, kuru buz/etanol banyosunda dondurma-çözme döngüleri ile elde edilir ve hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) içinde lizize edilir. AAV vektörü, kesintili iyodiksanol gradyanlı ultra santrifüjleme (32.000 rpm ve 4°C'de 24 saat) ile saflaştırıldı ve Amicon ultra-15 santrifüj filtresi kullanılarak konsantre edildi. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×10¹³ genom kopyası (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN1-V5 (1,9×10¹³ GC/ml) ve AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×10¹² GC/ml) genom titreleri daha önce açıklandığı gibi (54) gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ile ölçüldü.
Primer nöronlar buz gibi soğuk 1x PBS'de kazınarak toplandı, santrifüjlenerek çökeltildi ve ardından fosfataz ve proteaz inhibitörü (Roche) içeren %0,5 Triton X-100 / %0,5 sodyum deoksikolat/PBS lizis tamponunda homojenize edildi. Protein miktar tayini, bikinchoninic asit testi (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak gerçekleştirildi. Proteinler daha sonra SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı ve ardından poliviniliden florür membrana (GE Healthcare) aktarıldı. Spesifik olmayan bölgeleri bloke edin ve %5 süt içeren TBST'de (Tweenli Tris tamponlu salin) primer antikorla (ayrıntılar için Tablo S1'e bakınız) inkübe edin, yıkama adımlarını ve TBST'de sekonder antikoru uygulayın. Primer antikorla +4°C'de gece boyunca inkübe edin. Yıkamadan sonra, sekonder antikoru oda sıcaklığında 2 saat uygulayın. Daha sonra, aynı blotun anti-β-aktin antikoru ile inkübe edilmesiyle aynı yükleme doğrulandı. Kemilüminesansa dönüştürme ve kemilüminesansı artırma yoluyla tespit (GE Healthcare).
Daha önce cam lameller üzerine ekilen nöronlar, belirtilen zaman noktasında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA)/PBS ile sabitlendi. Lameller önce oda sıcaklığında 5 dakika boyunca %0,1 Triton X-100/PBS ile geçirgen hale getirildi, ardından bloke edici tamponda [%3 sığır serum albümini (BSA)/PBS] bekletildi. İkinci gün, lameller bloke edici tamponla yıkandı ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca uygun florofor konjugeli ikincil antikor ile inkübe edildi; son olarak, örnekler 4′,6-diamidino-2 -Fenilindol (DAPI) ile karşı boyama yapılarak PBS'de iyice yıkandı ve ardından Aqua-Poly/Mount ile mikroskop lamına sabitlendi.
Erkek ve dişi fareler, intraperitoneal yolla ketamin (130 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) enjeksiyonu ile anestezi altına alındı ​​ve subkutan olarak karprofen analjezik (5 mg/kg) uygulandı. Daha sonra, sıcak ped ile donatılmış bir stereotaktik alete (Kopf) yerleştirildiler. Kafatası açığa çıkarıldı ve serebellar korteksin mis kemiğine karşılık gelen kısmı (lambda'dan: kuyruk 1.8, lateral 1, IV ve V lobüllerine karşılık gelen) inceltmek için bir diş matkabı kullanıldı. Alttaki damar yapısını bozmamak için, kavisli bir şırınga iğnesi kullanılarak kafatasında dikkatlice küçük bir delik açıldı. Daha sonra ince çekilmiş cam kılcal boru, mikro deliğe (dura materin ventral tarafında -1,3 ila -1 arasında) yavaşça yerleştirilir ve 200 ila 300 nl AAV, 10 ila 20 dakikalık bir süre boyunca düşük basınçta birkaç kez manuel şırıngalar (Narishige) ile mikro enjektöre (Narishige) enjekte edilir. İnfüzyondan sonra, virüsün tamamen yayılmasına izin vermek için kılcal boru 10 dakika daha yerinde bırakılır. Kılcal borular çıkarıldıktan sonra, yara iltihabını en aza indirmek ve hayvanın iyileşmesini sağlamak için deri dikkatlice dikilir. Hayvanlara ameliyattan sonra birkaç gün boyunca ağrı kesiciler (kaspofen) verilir, bu süre zarfında fiziksel durumları dikkatlice izlenir ve daha sonra belirtilen zaman noktasında ötenazi uygulanır. Tüm işlemler Avrupa, ulusal ve kurumsal yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilir ve Almanya, Kuzey Ren-Vestfalya, Çevre ve Tüketici Koruma Bakanlığı tarafından onaylanır.
Hayvanlar ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) ile anestezi altına alındı ​​ve kalp önce 0,1 M PBS ile, ardından PBS içinde %4 PFA ile perfüze edildi. Doku diseke edildi ve 4°C'de bir gece boyunca %4 PFA/PBS içinde sabitlendi. PBS içinde sabitlenmiş beyinden sagital kesitler (50 μm kalınlığında) hazırlamak için titreşimli bir bıçak (Leica Microsystems GmbH, Viyana, Avusturya) kullanıldı. Aksi belirtilmedikçe, serbest yüzen kesitlerin boyanması yukarıda (13) açıklandığı gibi oda sıcaklığında ve karıştırılarak gerçekleştirildi. Kısaca, önce elde edilen dilimler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %0,5 Triton X-100/PBS ile geçirgen hale getirildi; bazı epitoplar (Pcx ve Shmt2) için, bu adım yerine dilimler 80°C'de (pH 9) tris-EDTA tamponunda 25 dakika ısıtıldı. Daha sonra, kesitler, bloke edici tamponda (%3 BSA/PBS) birincil antikor (bkz. Tablo S1) ile 4°C'de gece boyunca karıştırılarak inkübe edildi. Ertesi gün, kesitler bloke edici tamponla yıkandı ve uygun florofor konjugeli ikincil antikor ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi; son olarak, kesitler PBS ile iyice yıkandı, DAPI ile karşı boyama yapıldı ve ardından AquaPolymount ile mikroskop lamı üzerine sabitlendi.
Örneklerin görüntülenmesi için beyaz ışık lazeri ve 405 diyot ultraviyole lazer ile donatılmış bir lazer taramalı konfokal mikroskop (TCS SP8-X veya TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) kullanıldı. Floroforu uyararak ve sinyali Hibrit Dedektör (HyD) ile toplayarak, LAS-X yazılımı, ardışık modda Nyquist örneklemesine uygun yığılmış görüntüler toplamak için kullanıldı: nicel olmayan paneller için, oldukça dinamik sinyaller (örneğin, somatik hücrelerde ve dendritlerde mtYFP) kullanılır. BrightR modunda PN sayısını tespit etmek için HyD kullanılır. Arka planı azaltmak için 0,3 ila 6 ns arasında bir gating uygulanır.
Sıralanmış hücrelerin gerçek zamanlı görüntülenmesi. %1 B27 takviyesi ve 0,5 mM GlutaMax içeren Neurobasal-A ortamında sıralandıktan sonra, hücreler hemen poli-l-lizin kaplı cam slaytlara (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalog numarası 80826) ekildi ve hücrelerin yerleşmesi için 1 saat boyunca 37°C ve %5 CO2'de bekletildi. Gerçek zamanlı görüntüleme, beyaz lazer, HyD, 63× [1,4 sayısal açıklık (NA)] yağ objektif lensi ve ısıtma tablası ile donatılmış bir Leica SP8 lazer taramalı konfokal mikroskopta gerçekleştirildi.
Fare hızla karbondioksit ile anestezi altına alındı ​​ve başı kesildi, beyin hızla kafatasından çıkarıldı ve 200 μm kalınlığında (13C etiketleme deneyi için) veya 275 μm kalınlığında (iki foton deneyi için) sagital kesitler halinde kesildi ve aşağıdaki maddelerle dolduruldu: 125 mM buz gibi soğuk, karbonla doyurulmuş (%95 O2 ve %5 CO2) düşük Ca2+ yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodyum fosfat tamponu, 25 mM NaHCO3, 25 mM glikoz, 0,5 mM CaCl2 ve 3,5 mM MgCl2 (ozmotik basınç 310 ila 330 mmol). Elde edilen beyin dilimlerini, daha yüksek Ca2+ içeren bir ön inkübasyon odasına aktarın (ACSF ortamı: 125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodyum fosfat tamponu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 1,0 mM CaCl2 ve 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 ve 310 ila 320 mmol).
Görüntüleme işlemi sırasında, dilimler özel bir görüntüleme odasına taşındı ve deney, 32° ila 33°C arasında sabit bir sıcaklıkta sürekli ACSF perfüzyonu altında gerçekleştirildi. Dilim görüntüleme için, Leica 25x objektif lens (NA 0.95, su) ve Ti: Safir lazer (Chameleon Vision II, Coherent) ile donatılmış çok fotonlu lazer tarama mikroskobu (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) kullanıldı. FLIM modülü (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2'nin FLIM'i. PN'lerin sitoplazmik redoks durumundaki değişiklikler, Grx1-roGFP2 biyosensörünün PN'leri hedeflediği sagital beyin dilimlerinde iki fotonlu FLIM ile ölçüldü. PN katmanında, canlı bir PN'nin (yani, boncuklu yapının veya dendritler boyunca nöronal morfolojik değişikliklerin olmaması) ve çift pozitif roGFP2 sensörünün ve shRNA PCx veya kontrol dizisini kodlayan AAV'nin (her biri mCherry'yi birlikte ifade eder) varlığını sağlamak için, dilim yüzeyinin yaklaşık 50 ila 80 μm altında bir görüntüleme alanı seçildi. 2x dijital yakınlaştırma ile tek yığın görüntüler toplandı [uyarma dalga boyu: 890 nm; 512 nm 512 piksel]. Algılama: Eğri uydurma için yeterli fotonun (toplam 1000 foton) toplanmasını sağlamak amacıyla dahili HyD, flüoresan izotiyosiyanat (FITC) filtre grubu ve 2 ila 3 dakika içinde görüntü ortalaması alma yöntemleri kullanılmıştır. Grx1-roGFP2 probunun hassasiyeti ve FLIM koşullarının doğrulanması, perfüzyon ACSF'ye ekzojen 10 mM H2O2 eklenerek (oksidasyonu en üst düzeye çıkararak ömrü uzatmak için) ve ardından 2 mM ditiyotreitol eklenerek (indirgenme derecesini en aza indirerek ömrü kısaltmak için) roGFP2'nin ömür değerinin izlenmesiyle gerçekleştirilmiştir (Şekil S8, D ila G). Elde edilen sonuçları analiz etmek için FLIMfit 5.1.1 yazılımı kullanıldı, tüm görüntünün tek üstel bozunma eğrisi ölçülen IRF'ye (enstrüman yanıt fonksiyonu) uyduruldu ve χ2 yaklaşık 1 oldu. Tek bir PN'nin ömrünü hesaplamak için, sinir gövdesinin etrafına manuel olarak bir maske çizildi ve her maskede ortalama ömür nicelleştirme için kullanıldı.
Mitokondriyal potansiyel analizi. Akut kesit, perfüze edilmiş ACSF'ye doğrudan eklenen 100 nM TMRM ile 30 dakika inkübe edildikten sonra, PN'lerin mitokondriyal potansiyel değişiklikleri iki fotonlu mikroskop ile ölçüldü. TMRM görüntülemesi, probun 920 nm'de uyarılması ve sinyalleri toplamak için dahili HyD (tetrametilrodamin izotiyosiyanat: 585/40 nm) kullanılarak gerçekleştirildi; mtYFP'yi görüntülemek için aynı uyarı dalga boyu ancak farklı bir dahili HyD (FITC: 525/50) kullanıldı. Tek hücre düzeyinde mitokondriyal potansiyeli değerlendirmek için ImageJ'nin Görüntü Hesaplayıcı eklentisi kullanıldı. Kısaca, eklenti denklemi: sinyal = min (mtYFP, TMRM), ilgili kanalın tek katmanlı konfokal görüntüsünde Purkinje Somali dilinde TMRM sinyalini gösteren mitokondriyal bölgeyi tanımlamak için kullanılır. Daha sonra elde edilen maskenin piksel alanı nicelleştirilir ve ardından mitokondriyal potansiyeli gösteren mitokondriyal fraksiyonu elde etmek için mtYFP kanalının karşılık gelen eşik tekli yığın görüntüsüne göre normalize edilir.
Görüntü, Huygens Pro (Bilimsel Hacim Görüntüleme) yazılımı ile dekonvolüsyon işlemine tabi tutuldu. Karo resimlerinin taranması için, LAS-X yazılımı tarafından sağlanan otomatik birleştirme algoritması kullanılarak tek bir karonun montajı yapıldı. Görüntü kalibrasyonundan sonra, görüntüyü daha fazla işlemek ve parlaklık ve kontrastı eşit şekilde ayarlamak için ImageJ ve Adobe Photoshop kullanıldı. Grafik hazırlığı için Adobe Illustrator kullanıldı.
mtDNA odak analizi. Konfokal mikroskop kullanılarak DNA'ya karşı antikorlarla işaretlenmiş serebellar kesitlerdeki mtDNA lezyonlarının sayısı ölçüldü. Her hücrenin hücre gövdesi ve çekirdeği için ayrı ayrı hedef alanlar oluşturuldu ve ilgili alan, Multi Measure eklentisi (ImageJ yazılımı) kullanılarak hesaplandı. Sitoplazmik alanı elde etmek için hücre gövdesi alanından çekirdek alanı çıkarıldı. Son olarak, eşik görüntüsünde mtDNA'yı gösteren sitoplazmik DNA noktalarını otomatik olarak ölçmek için Analyze Particles eklentisi (ImageJ yazılımı) kullanıldı ve elde edilen sonuçlar CTRL farelerinin PN ortalamasına göre normalize edildi. Sonuçlar, hücre başına ortalama nükleosit sayısı olarak ifade edildi.
Protein ekspresyon analizi. PN'deki protein ekspresyonunu tek hücre düzeyinde değerlendirmek için ImageJ'nin Image Calculator eklentisini kullanın. Kısaca, ilgili kanalın tek katmanlı konfokal görüntüsünde, sinyal = min (mtYFP, antikor) denklemi aracılığıyla, Purkina'da belirli bir antikora karşı immünoreaktivite gösteren mitokondriyal bölge belirlenir. Daha sonra, elde edilen maskede piksel alanı nicelendirilir ve ardından görüntülenen proteinin mitokondriyal fraksiyonunu elde etmek için mtYFP kanalının ilgili eşik tek katmanlı görüntüsüne göre normalize edilir.
Purkinje hücresi yoğunluğu analizi. Purkinje yoğunluğunu değerlendirmek için ImageJ'nin Cell Counter eklentisi kullanıldı; sayılan Purkinje hücresi sayısı, sayılan hücrelerin kapladığı serebellar halkanın uzunluğuna bölünerek hesaplama yapıldı.
Örnek hazırlama ve toplama. Kontrol grubu ve Mfn2cKO farelerinin beyinleri, 0,1 M fosfat tamponunda (PB) %2 PFA/%2,5 glutaraldehit ile sabitlendi ve ardından siliyatlar (Leica Mikrosysteme GmbH, Viyana, Avusturya) kullanılarak koronal kesitler hazırlandı (Kalınlık 50 ila 60 μm). Daha sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %1 os tetraoksit ve %1,5 potasyum ferrosiyanür içeren PB tamponunda sabitlendi. Kesitler üç kez damıtılmış su ile yıkandı ve ardından 20 dakika boyunca %1 uranil asetat içeren %70 etanol ile boyandı. Kesitler daha sonra kademeli alkolde dehidrate edildi ve silikon kaplı cam slaytlar arasına Durcupan ACM (Araldite döküm reçinesi M) epoksi reçinesi (Electron Microscopy Sciences, katalog numarası 14040) içine gömüldü ve son olarak 60°C'de fırında 48 saat boyunca polimerize edildi. Beyincik korteksi bölgesi seçildi ve Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viyana, Avusturya) cihazında 50 nm ultra ince kesitler alındı ​​ve polistiren filmle kaplanmış 2×1 mm'lik bakır yarık ızgaraya yerleştirildi. Kesitler, 10 dakika boyunca %4'lük uranil asetat çözeltisiyle (H2O içinde) boyandı, birkaç kez H2O ile yıkandı, ardından 10 dakika boyunca Reynolds kurşun sitrat çözeltisiyle (H2O içinde) boyandı ve son olarak birkaç kez H2O ile yıkandı. Mikrograflar, TVIPS (Tietz Video ve Görüntü İşleme Sistemi) TemCam-F416 dijital kamera (TVIPS GmbH, Gauting, ABD) kullanılarak Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) transmisyon elektron mikroskobu ile çekildi.
AAV ile enfekte edilmiş farelerde, beyin ayrıldı ve 1 mm kalınlığında sagital kesitler halinde dilimlendi ve AAV ile enfekte olmuş halkayı (yani mCherry ekspresyonunu) belirlemek için serebellum floresan mikroskop kullanılarak incelendi. Sadece AAV enjeksiyonunun, en az iki ardışık serebellar halkada Purkinje hücre tabakasının (yani neredeyse tüm tabakanın) çok yüksek transdüksiyon verimliliğiyle sonuçlandığı deneyler kullanıldı. AAV ile transdükte edilmiş halka, gece boyunca post-fiksasyon (0,1 M kokoat tamponunda %4 PFA ve %2,5 glutaraldehit) için mikrodiseksiyona tabi tutuldu ve daha sonra işlendi. EPON'a gömme için, sabitlenmiş doku 0,1 M sodyum kokoat tamponu (Applichem) ile yıkandı ve 0,1 M sodyum kokoat tamponunda (Applichem) %2 OsO4 (os, Science Services; Caco) ile 4 saat inkübe edildi, ardından 2 saat yıkandı. 0,1 M kokamid tamponu ile 3 kez tekrarlayın. Daha sonra, dokuyu dehidrate etmek için her bir etanol çözeltisi 4°C'de 15 dakika süreyle artan etanol serisi kullanılarak inkübe edildi. Doku propilen okside aktarıldı ve 4°C'de EPON'da (Sigma-Aldrich) bir gece boyunca inkübe edildi. Dokuyu oda sıcaklığında 2 saat boyunca taze EPON'a yerleştirin ve ardından 62°C'de 72 saat boyunca gömün. 70 nm ultra ince kesitler almak için bir ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) ve bir elmas bıçak (Diatome, Biel, İsviçre) kullanın ve 37°C'de 15 dakika boyunca %1,5 uranil asetat ile boyayın ve 4 dakika boyunca kurşun sitrat çözeltisi ile boyayın. Elektron mikrografları, Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ve DigitalMicrograph yazılımı (Gatan) ile donatılmış bir JEM-2100 Plus transmisyon elektron mikroskobu (JEOL) kullanılarak çekilmiştir. Analiz için, elektron mikrografları 5000× veya 10.000× dijital yakınlaştırma ile elde edilmiştir.
Mitokondrilerin morfolojik analizi. Tüm analizler için, bireysel mitokondrilerin konturları ImageJ yazılımı kullanılarak dijital görüntülerde manuel olarak çizilmiştir. Farklı morfolojik parametreler analiz edilmiştir. Mitokondri yoğunluğu, her hücrenin toplam mitokondri alanının sitoplazma alanına bölünmesiyle elde edilen yüzde olarak ifade edilir (sitoplazma alanı = hücre alanı - hücre çekirdeği alanı) × 100. Mitokondrilerin yuvarlaklığı [4π∙(alan/çevre 2)] formülüyle hesaplanmıştır. Mitokondrilerin ista morfolojisi analiz edilmiş ve ana şekillerine göre iki kategoriye ("tübüler" ve "kabarcık") ayrılmıştır.
Otofagozom/lizozom sayısı ve yoğunluk analizi. Dijital görüntüdeki her otofagozom/lizozomun konturlarını elle çizmek için ImageJ yazılımı kullanın. Otofagozom/lizozom alanı, her hücrenin toplam otofagozom/lizozom yapı alanının sitoplazma alanına bölünmesiyle hesaplanan yüzde olarak ifade edilir (sitoplazma alanı = hücre alanı - çekirdek alanı) × 100. Otofagozom/lizozom yoğunluğu, toplam sayının hücre başına düşen otofagozom/lizozom yapı sayısına (sitoplazma alanı cinsinden) bölünmesiyle hesaplanır (sitoplazma alanı = hücre alanı - çekirdek alanı).
Akut kesit alma ve numune hazırlama için etiketleme. Glikoz etiketlemesi gerektiren deneyler için, akut beyin dilimlerini doymuş karbon (%95 O2 ve %5 CO2), yüksek Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodyum fosfat tamponu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoz, 1,0 mM CaCl2 ve 2,0 mM MgCl2, pH 7,4 ve 310 ila 320 mOsm'ye ayarlanmış) içeren bir ön inkübasyon odasına aktarın; burada glikoz 13C6-Glikoz ikamesidir (Eurisotop, katalog numarası CLM-1396). Piruvat etiketlemesi gerektiren deneyler için, akut beyin dilimlerini daha yüksek Ca2+ ACSF'ye (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodyum fosfat tamponu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 1,0 mM CaCl2 ve 2,0 mM MgCl2 ekleyin, pH'ı 7,4'e ve 310-320 mOsm'ye ayarlayın) aktarın ve 1 mM 1-[1-13C]piruvat (Eurisotop, katalog numarası CLM-1082) ekleyin. Kesitleri 37°C'de 90 dakika inkübe edin. Deneyin sonunda, kesitler 75 mM amonyum karbonat içeren sulu bir çözelti (pH 7,4) ile hızlıca yıkandı ve ardından 40:40:20 (v:v:v) asetonitril (ACN): metanol: su karışımında homojenize edildi. Kesitler 30 dakika buz üzerinde bekletildikten sonra, örnekler 4°C'de 10 dakika boyunca 21.000 g'de santrifüjlendi ve berrak üst sıvı SpeedVac konsantratöründe kurutuldu. Elde edilen kurutulmuş metabolit peleti analiz edilene kadar -80°C'de saklandı.
13C etiketli amino asitlerin sıvı kromatografi-kütle spektrometresi analizi. Sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) analizi için, metabolit peleti 75 μl LC-MS sınıfı suda (Honeywell) yeniden süspansiyon haline getirildi. 4°C'de 5 dakika boyunca 21.000 g'de santrifüj edildikten sonra, berraklaştırılmış süpernatantın 20 μl'si amino asit akış analizi için kullanılırken, ekstraktın geri kalanı hemen anyon analizi için kullanıldı (aşağıya bakınız). Amino asit analizi, daha önce açıklanan benzoil klorür türevlendirme protokolü kullanılarak gerçekleştirildi (55, 56). İlk adımda, 20 μl metabolit ekstraktına 10 μl 100 mM sodyum karbonat (Sigma-Aldrich) eklendi ve ardından LC sınıfı ACN'ye 10 μl %2 benzoil klorür (Sigma-Aldrich) eklendi. Örnek kısa süre vortekslenerek karıştırıldı ve ardından 20°C'de 5 dakika boyunca 21.000 g'de santrifüjlendi. Berraklaştırılmış süpernatant, konik cam insertli (200 μl hacim) 2 ml'lik otomatik örnekleyici şişesine aktarıldı. Örnekler, Q-Exactive (QE)-HF (Ultra Yüksek Alanlı Orbitrap) yüksek çözünürlüklü hassas kütle spektrometresine (Thermo Fisher Scientific) bağlı Acquity iClass ultra yüksek performanslı LC sistemi (Waters) kullanılarak analiz edildi. Analiz için, türevlendirilmiş örneğin 2 μl'si, 1,8 μm partiküller içeren 100×1,0 mm yüksek mukavemetli silika T3 kolonuna (Waters) enjekte edildi. Akış hızı 100 μl/dakika olup, tampon sistemi tampon A (suda 10 mM amonyum format ve %0,15 formik asit) ve tampon B'den (ACN) oluşmaktadır. Eğim şu şekildedir: 0 dakikada %0 B; 0 ila 0,1 dakikada %0 ila %15 B; 0,1 ila 0,5 dakikada %15 ila %17 B; 0,5 ila 14 dakikada %17 ila %55 B; 14 ila 14,5 dakikada %55 ila %70 B; 14,5 ila %70 ila %100 B, 18 dakikada; 18 ila 19 dakikada %100 B; 19 ila 19,1 dakikada %100 ila %0 B; 19,1 ila 28 dakikada %0 B (55, 56). QE-HF kütle spektrometresi, 50 ila 750 m/z (kütle/yük oranı) kütle aralığında pozitif iyonizasyon modunda çalışır. Uygulanan çözünürlük 60.000'dir ve elde edilen kazanç kontrolü (AGC) iyon hedefi 3×10⁶'dır ve maksimum iyon süresi 100 milisaniyedir. Isıtmalı elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı, 3,5 kV püskürtme voltajında, 250°C kılcal sıcaklıkta, 60 AU (keyfi birimler) kılıf hava akışında ve 20 AU yardımcı hava akışında çalışır. S lensi 60 AU'ya ayarlanmıştır.
13C etiketli organik asitlerin anyon kromatografisi-MS analizi. Kalan metabolit çökeltisi (55 μl), bir QE-HF kütle spektrometresine (Thermo Fisher Scientific) bağlı bir Dionex iyon kromatografi sistemi (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) kullanılarak analiz edildi. Kısaca, 5 μl metabolit ekstraktı, 1 dolum oranıyla itme-içeri kısmi döngü modunda HPLC ile donatılmış bir Dionex IonPac AS11-HC kolonuna (2 mm × 250 mm, partikül boyutu 4 μm, Thermo Fisher Scientific) enjekte edildi. Kolon sıcaklığı 30 °C'de, otomatik örnekleyici ise 6 °C'de tutuldu. Elüent jeneratöründen potasyum hidroksit gradyanı oluşturmak için deiyonize su ile birlikte verilen bir potasyum hidroksit kartuşu kullanıldı. Metabolitlerin ayrıştırılması, 380 μl/dakika akış hızında aşağıdaki gradyan uygulanarak gerçekleştirildi: 0-3 dakika, 10 mM KOH; 3-12 dakika, 10-50 mM KOH; 12-19 dakika, 50-100 mM KOH; 19-21 dakika, 100 mM KOH; 21-21,5 dakika, 100-10 mM KOH. Kolon, 8,5 dakika boyunca 10 mM KOH altında yeniden dengelendi.
Kolondan sonra elüe edilen metabolitler, 150 μl/dakika izopropanol takviye akımıyla birleştirilir ve daha sonra negatif iyonizasyon modunda çalışan yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresine yönlendirilir. MS, 60.000 çözünürlükle m/z 50 ila 750 kütle aralığını izler. AGC 1×10⁶ olarak ayarlanmıştır ve maksimum iyon süresi 100 ms'de tutulmuştur. Isıtmalı ESI kaynağı 3,5 kV püskürtme voltajında ​​çalıştırılmıştır. İyon kaynağının diğer ayarları şu şekildedir: kılcal sıcaklık 275°C; kılıf gaz akışı 60 AU; yardımcı gaz akışı 300°C'de 20 AU ve S lens ayarı 60 AU.
13C etiketli metabolitlerin veri analizi. İzotop oranının veri analizi için TraceFinder yazılımı (sürüm 4.2, Thermo Fisher Scientific) kullanıldı. Her bir bileşiğin kimliği güvenilir bir referans bileşik ile doğrulandı ve bağımsız olarak analiz edildi. İzotop zenginleştirme analizi yapmak için, her bir 13C izotopunun (Mn) çıkarılmış iyon kromatogramının (XIC) alanı, amino asitleri analiz etmek için kullanılan [M + H]+'dan veya anyonları analiz etmek için kullanılan [MH]+'dan çıkarıldı. XIC'nin kütle doğruluğu milyonda beşten azdır ve RT'nin doğruluğu 0,05 dakikadır. Zenginleştirme analizi, tespit edilen her bir izotopun, karşılık gelen bileşiğin tüm izotoplarının toplamına oranının hesaplanmasıyla gerçekleştirilir. Bu oranlar her bir izotop için yüzde değerleri olarak verilir ve sonuçlar daha önce açıklandığı gibi (42) molar yüzde zenginleştirme (MPE) olarak ifade edilir.
Dondurulmuş nöron peleti, buz gibi soğuk %80 metanol (v/v) içinde homojenize edildi, vortekslendi ve -20°C'de 30 dakika inkübe edildi. Numune tekrar vortekslendi ve +4°C'de 30 dakika karıştırıldı. Numune, 4°C'de 5 dakika boyunca 21.000 g'de santrifüjlendi ve ardından elde edilen süpernatant toplandı ve daha sonraki analiz için 25°C'de bir SpeedVac konsantratörü kullanılarak kurutuldu. Yukarıda açıklandığı gibi, sıralanmış hücrelerin amino asitleri üzerinde LC-MS analizi yapıldı. TraceFinder (sürüm 4.2, Thermo Fisher Scientific) kullanılarak, her bir bileşiğin monoisotopik kütlesi kullanılarak veri analizi yapıldı. Metabolit verilerinin kantil normalizasyonu, preprocessCore yazılım paketi (57) kullanılarak gerçekleştirildi.
Dilim hazırlama. Fare hızla karbondioksit ile anestezi altına alındı ​​ve başı kesildi, beyin hızla kafatasından çıkarıldı ve buz dolu titreşimli bıçak (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Almanya) kullanılarak 300 ila 375 μm kalınlığında sagital kesitler halinde kesildi. Soğuk karbon gazlaştırma (%95 O2 ve %5 CO2) Düşük Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodyum fosfat tamponu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 1,0 mM CaCl2 ve 6,0 mM MgCl2 pH 7,4 ve 310 ila 330 mOsm'ye ayarlandı). Elde edilen beyin dilimlerini, daha yüksek Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM sodyum fosfat tamponu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoz, 4,0 mM CaCl2 ve 3,5 mM MgCl2) içeren bir odaya aktarın (pH 7,4 ve 310 ila 320 mOsm). Dilimleri, kayıt öncesinde eski haline getirilebilmeleri için 20 ila 30 dakika bekletin.
Kayıt işlemi için, sabit kayıt odası ve 20x su daldırma objektif lensi (Scientifica) ile donatılmış bir mikroskop tablası kullanıldı. Olası Purkinje hücreleri (i) vücut büyüklüğü, (ii) serebellumun anatomik konumu ve (iii) floresan mtYFP muhabir geninin ekspresyonu ile tanımlandı. Uç direnci 5 ila 11 megaohm olan yama pipeti, borosilikat cam kılcal boru (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Almanya) ve yatay pipet Instruments (P-1000, Sutter, Novato, CA) ile dışarı çekildi. Tüm kayıtlar, Signal yazılımı (sürüm 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, İngiltere) tarafından kontrol edilen ELC-03XS npi yama kelepçe amplifikatörü (npi electronic GmbH, Tam, Almanya) ile gerçekleştirildi. Deney 12,5 kHz örnekleme hızında kaydedildi. Sinyal, sırasıyla 1,3 ve 10 kHz kesme frekanslarına sahip iki kısa geçişli Bessel filtresi ile filtrelenir. Membranın ve pipetin kapasitansı, yükseltici kullanılarak kompanzasyon devresi ile telafi edilir. Tüm deneyler, Hokawo yazılımı (sürüm 2.8, Hamamatsu, Gerden, Almanya) tarafından kontrol edilen bir Orca-Flash 4.0 kamera (Hamamatsu, Gerden, Almanya) kontrolü altında gerçekleştirildi.
Rutin hücre içi yapılandırma ve analiz. Kayıttan hemen önce, pipet aşağıdaki maddeleri içeren iç çözelti ile doldurulur: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM potasyum glukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanozin trifosfat (GTP) (Na) ve 10,0 mM kreatinin fosfat. Çözelti pH 7,25'e ayarlandı ve ozmotik basınç 290 mOsm (sükroz) olarak belirlendi. Membranı yırtmak için 0 pA'lık bir kuvvet uygulandıktan hemen sonra, dinlenme membran potansiyeli ölçüldü. Giriş direnci, -40, -30, -20 ve -10 pA'lık hiperpolarize akımlar uygulanarak ölçülür. Voltaj yanıtının büyüklüğü ölçülür ve giriş direncini hesaplamak için Ohm yasası kullanılır. Spontan aktivite, 5 dakika boyunca voltaj kelepçesi altında kaydedildi ve sPSC, yarı otomatik bir tanıma betiği kullanılarak Igor Pro'da (sürüm 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, ABD) tanımlandı ve ölçüldü. IV eğrisi ve kararlı durum akımı, pili farklı potansiyellerde (başlangıçta -110 mV) kelepçeleyerek ve voltajı 5 mV'lik adımlarla artırarak ölçüldü. AP üretimi, depolarize edici bir akım uygulanarak test edildi. Depolarize edici bir akım darbesi uygularken pili -70 mV'de kelepçeleyin. Her kayıt ünitesinin adım boyutunu ayrı ayrı ayarlayın (10 ila 60 pA). En yüksek AP frekansına neden olan darbe sivri uçlarını manuel olarak sayarak maksimum AP frekansını hesaplayın. AP eşiği, bir veya daha fazla AP'yi ilk tetikleyen depolarizasyon darbesinin ikinci türevi kullanılarak analiz edildi.
Delikli yama yapılandırması ve analizi. Standart protokollere göre delikli yama kaydı gerçekleştirin. Aşağıdaki bileşenleri içermeyen, ATP ve GTP içermeyen bir pipet kullanın: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA ve 2 mM MgCl2 ve pH'ı 7,2'ye ayarlayın (KOH kullanarak). Hücre zarının kontrolsüz geçirgenliğini önlemek için hücre içi çözeltiden ATP ve GTP çıkarılır. Delikli yama kaydı elde etmek için yama pipeti, amfoterisin içeren bir iç çözelti (yaklaşık 200 ila 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ile doldurulur. Amfoterisin, dimetil sülfoksitte (nihai konsantrasyon: %0,1 ila %0,3; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich) çözülmüştür. Kullanılan DMSO konsantrasyonunun incelenen nöronlar üzerinde önemli bir etkisi olmamıştır. Delme işlemi sırasında kanal direnci (Ra) sürekli olarak izlendi ve Ra ve AP genliği stabilize olduktan sonra (20-40 dakika) deney başlatıldı. Spontan aktivite, 2 ila 5 dakika boyunca voltaj ve/veya akım kelepçesi kullanılarak ölçüldü. Veri analizi, Igor Pro (sürüm 7.05.2, WaveMetrics, ABD), Excel (sürüm 2010, Microsoft Corporation, Redmond, ABD) ve GraphPad Prism (sürüm 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. Spontan AP'leri belirlemek için IgorPro'nun NeuroMatic v3.0c eklentisi kullanıldı. Her kayıt için ayrı ayrı ayarlanan belirli bir eşik kullanılarak AP'ler otomatik olarak tanımlandı. Spike aralığı kullanılarak, maksimum anlık spike frekansı ve ortalama spike frekansı ile spike frekansı belirlendi.
PN izolasyonu. Daha önce yayınlanan protokole uyarlanarak, PN'ler belirli bir aşamada fare serebellumundan saflaştırıldı (58). Kısaca, serebellum buz gibi soğuk ayrıştırma ortamında [HBSS Ca2+ ve Mg2+ içermeyen, 20 mM glikoz, penisilin (50 U/ml) ve streptomisin (0,05 mg/ml) ile desteklenmiş] kesildi ve kıyıldı, ardından ortam papain ile sindirildi [HBSS, 1-sistein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ve deoksiribonükleaz I (DNase I; 0,1 mg/ml) ile desteklenmiş]. 30°C'de 30 dakika işlem uygulandı. Öncelikle dokular, enzimatik sindirimi önlemek için oda sıcaklığında yumurta mukusu (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) ve DNaz (0,1 mg/ml) içeren HBSS ortamında yıkanır, ardından 20 mM glikoz içeren HBSS ortamında hafifçe öğütülerek tek hücreler elde edilir. Elde edilen hücre süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzülür, daha sonra hücreler santrifüjleme (1110 rpm, 5 dakika, 4°C) ile çökeltilir ve ayırma ortamında [HBSS, 20 mM glikoz, %20 fetal sığır serumu, penisilin (50 U/ml) ve streptomisin (0,05 mg/ml) ile desteklenmiş] yeniden süspansiyon haline getirilir; Hücre canlılığını propidium iyodür ile değerlendirin ve hücre yoğunluğunu 1×10⁶ ila 2×10⁶ hücre/ml arasına ayarlayın. Akış sitometrisinden önce süspansiyon 50 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirildi.
Akış sitometresi. Hücre ayırma işlemi, 4°C'de FACSAria III cihazı (BD Biosciences) ve FACSDiva yazılımı (BD Biosciences, sürüm 8.0.1) kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre süspansiyonu, 20 psi basınç altında 100 μm'lik bir nozul kullanılarak ~2800 olay/saniye hızında ayrıştırıldı. Geleneksel gating kriterleri (hücre boyutu, bimodal ayrım ve saçılma özellikleri) PN'nin diğer hücre tiplerinden doğru şekilde izole edilmesini sağlayamadığı için, gating stratejisi mitoYFP+ ​​ve kontrol mitoYFP − farelerindeki YFP yoğunluğu ve otofloresansın doğrudan karşılaştırılmasına dayanarak belirlendi. YFP, numunenin 488 nm lazer hattı ile ışınlanmasıyla uyarılır ve sinyal 530/30 nm bant geçiren filtre kullanılarak algılanır. MitoYFP+ ​​farelerde, Rosa26-mitoYFP muhabir geninin göreceli gücü, nöron gövdesi ve akson parçalarını ayırt etmek için de kullanılır. 7-AAD, 561 nm sarı lazerle uyarılır ve ölü hücreleri dışlamak için 675/20 nm bant geçiren filtre ile tespit edilir. Astrositleri aynı anda ayırmak için, hücre süspansiyonu ACSA-2-APC ile boyanır, ardından örnek 640 nm lazer hattı ile ışınlanır ve sinyali tespit etmek için 660/20 nm bant geçiren filtre kullanılır.
Toplanan hücreler santrifüjleme yoluyla (1110 rpm, 5 dakika, 4°C) çökeltildi ve kullanıma kadar -80°C'de saklandı. İşlemsel değişkenliği en aza indirmek için Mfn2cKO fareleri ve yavruları aynı gün sınıflandırıldı. FACS verilerinin sunumu ve analizi FlowJo yazılımı (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.
Yukarıda belirtildiği gibi (59), sıralanmış nöronlardan DNA'yı izole etmek ve daha sonra mtDNA miktarını belirlemek için gerçek zamanlı PCR kullanılmıştır. Doğrusallık ve eşik hassasiyeti başlangıçta farklı sayıda hücre üzerinde qPCR çalıştırılarak test edilmiştir. Kısaca, 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, %0,5 Tween 20 ve proteinaz K (200 ng/ml) içeren bir lizis tamponunda 300 PN toplayın ve 55°C'de 120 dakika inkübe edin. Proteinaz K'nın tamamen inaktivasyonunu sağlamak için hücreler ayrıca 95°C'de 10 dakika daha inkübe edildi. mt-Nd1'e özgü bir TaqMan probu (Thermo Fisher) kullanılarak, mtDNA, 7900HT Gerçek Zamanlı PCR sisteminde (Thermo Fisher Scientific) yarı kantitatif PCR ile ölçüldü. mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalog numarası Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalog numarası AIVI3E8) ve 18S (Thermo Fisher Scientific, katalog numarası Hs99999901_s1) genleri.
Proteom numunesi hazırlama. Çözelti 95°C'de 10 dakika ısıtılarak ve sonikasyon uygulanarak, lizis tamponunda [6 M guanidin klorür, 10 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür, 10 mM kloroasetamid ve 100 mM tris-HCl içinde dondurulmuş nöron peletleri HCl içinde lizize edildi]. Bioruptor (Diagenode) cihazında 10 dakika (30 saniye darbe / 30 saniye duraklama süresi) inkübe edildi. Numune 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içinde 1:10 oranında seyreltildi, 300 ng tripsin gold (Promega) ile karıştırıldı ve tam sindirim sağlamak için 37°C'de bir gece inkübe edildi. İkinci gün, numune 20.000 g'de 20 dakika santrifüjlendi. Süpernatant %0,1 formik asit ile seyreltildi ve çözelti kendi yapımımız StageTips ile tuzdan arındırıldı. Örnek, 45°C'de bir SpeedVac cihazında (Eppendorf konsantratör plus 5305) kurutuldu ve ardından peptit %0,1 formik asit içinde süspansiyon haline getirildi. Tüm örnekler aynı kişi tarafından eş zamanlı olarak hazırlandı. Astrosit örneklerini analiz etmek için, 4 μg tuzdan arındırılmış peptit, 1:20 peptit-TMT reaktif oranıyla bir tandem kütle etiketi (TMT10plex, katalog numarası 90110, Thermo Fisher Scientific) ile etiketlendi. TMT etiketlemesi için, 0,8 mg TMT reaktifi 70 μl susuz ACN içinde süspansiyon haline getirildi ve kurutulmuş peptit, 9 μl 0,1 M TEAB (trietilamonyum bikarbonat) içinde yeniden çözündürüldü; buna 7 μl ACN içindeki TMT reaktifi eklendi. Konsantrasyon %43,75 idi. 60 dakikalık inkübasyondan sonra reaksiyon 2 μl %5 hidroksilamin ile durduruldu. Etiketlenmiş peptitler toplandı, kurutuldu, 200 μl %0,1 formik asit (FA) içinde yeniden süspansiyon haline getirildi, ikiye bölündü ve ardından kendi yapımımız olan StageTips kullanılarak tuzdan arındırıldı. UltiMate 3000 ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UltiMate 3000 ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi) kullanılarak, iki yarıdan biri 130Å 1,7 μm C18 partikülleri (Waters, katalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific ile doldurulmuş 1 mm x 150 mm Acquity kromatografik kolonda fraksiyonlandı. Peptitleri 30 μl/dk akış hızında ayırın; 85 dakika boyunca %1'den %50'ye kadar B tampon çözeltisi ile, 96 dakikalık kademeli bir gradyanla, 3 dakika boyunca %50'den %95'e kadar B tampon çözeltisi ile ve ardından 8 dakika boyunca %95 B tampon çözeltisi ile ayırın; A tampon çözeltisi %5 ACN ve 10 mM amonyum bikarbonat (ABC), B tampon çözeltisi ise %80 ACN ve 10 mM ABC'dir. Fraksiyonları her 3 dakikada bir toplayın ve iki gruba (1 + 17, 2 + 18, vb.) birleştirin ve vakumlu santrifüjde kurutun.
LC-MS/MS analizi. Kütle spektrometresi için, peptitler (r119.aq numaralı) 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ ortamı (Dr. Maisch, mat) ile donatılmış 25 cm, 75 μm iç çaplı PicoFrit analitik kolonda (yeni objektif lens, parça numarası PF7508250) EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Almanya) kullanılarak ayrıştırıldı. Kolon 50°C'de tutuldu. Tampon A ve B sırasıyla suda %0,1 formik asit ve %80 ACN'de %0,1 formik asittir. Peptitler, 200 nl/dakika gradyan ile 65 dakika boyunca %6'dan %31'e tampon B ve 5 dakika boyunca %31'den %50'ye tampon B arasında ayrıştırıldı. Elüsyondan elde edilen peptitler, bir Orbitrap Fusion kütle spektrometresi (Thermo Fisher Scientific) üzerinde analiz edildi. Peptit öncülünün m/z ölçümü, 350 ila 1500 m/z aralığında 120.000 çözünürlükle gerçekleştirildi. %27 normalize çarpışma enerjisi kullanılarak, 2 ila 6 yük durumuna sahip en güçlü öncül, yüksek enerjili C tuzak ayrışması (HCD) parçalanması için seçildi. Döngü süresi 1 s olarak ayarlandı. Peptit parçasının m/z değeri, iyon tuzağında 5×104'lük en küçük AGC hedefi ve 86 ms'lik maksimum enjeksiyon süresi kullanılarak ölçüldü. Parçalanmadan sonra, öncül 45 saniye boyunca dinamik dışlama listesine yerleştirildi. TMT etiketli peptitler, 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap kolonunda (Thermo Fisher Scientific, katalog numarası 164942) ayrıştırıldı ve migrasyon spektrumları, yüksek alanlı asimetrik dalga formu iyonları (FAIMS) ekipmanı (Thermo Fisher Scientific) ile donatılmış bir Orbitrap Lumos Tribrid kütle spektrometresinde (Thermo Fisher Scientific) analiz edildi; bu ekipman -50 ve -70 V olmak üzere iki kompanzasyon voltajında ​​çalışmaktadır. Senkronizasyon öncülüne göre seçilen MS3, TMT rapor iyon sinyali ölçümü için kullanılır. Peptit ayrımı, %90 doğrusal gradyan elüsyonu kullanılarak, %6 ila %31 tampon konsantrasyonu ile EASY-nLC 1200 üzerinde gerçekleştirildi; tampon A %0,1 FA, tampon B ise %0,1 FA ve %80 ACN idi. Analitik kolon 50°C'de çalıştırıldı. Orijinal dosyayı FAIMS kompanzasyon voltajına göre bölmek için FreeStyle (sürüm 1.6, Thermo Fisher Scientific) kullanın.
Protein tanımlama ve nicelleştirme. Entegre Andromeda arama motoru kullanılarak, orijinal veriler MaxQuant sürüm 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ile analiz edildi. Aequorea victoria'dan elde edilen Cre rekombinaz ve YFP sekanslarına ek olarak, peptit fragman spektrumları, fare referans proteomunun (Proteom ID UP000000589, Mayıs 2017'de UniProt'tan indirildi) kanonik sekansı ve izoform sekansı için arandı. Metiyonin oksidasyonu ve protein N-terminal asetilasyonu değişken modifikasyonlar olarak; sistein karbamoil metilasyonu ise sabit modifikasyonlar olarak ayarlandı. Sindirim parametreleri "özgüllük" ve "tripsin/P" olarak ayarlandı. Protein tanımlama için kullanılan minimum peptit ve jilet peptit sayısı 1; minimum benzersiz peptit sayısı 0'dır. Peptit haritası eşleştirme koşulları altında, protein tanımlama oranı 0,01 idi. “İkinci Peptit” seçeneği etkinleştirildi. Başarılı tanımlamaları farklı orijinal dosyalar arasında aktarmak için “çalıştırmalar arası eşleştirme” seçeneğini kullanın. Etiketsiz kantifikasyon (LFQ) için LFQ minimum oran sayımı 1 kullanın (60). LFQ yoğunluğu, her zaman noktasında en az bir genotip grubunda en az iki geçerli değer için filtrelenir ve 0,3 genişliğinde ve 1,8 aşağı doğru hareket eden normal bir dağılımdan ekstrapole edilir. LFQ sonuçlarını analiz etmek için Perseus hesaplama platformunu (https://maxquant.net/perseus/) ve R'yi (https://r-project.org/) kullanın. Diferansiyel ifade analizi için limma yazılım paketinden iki yönlü orta dereceli t testi kullanıldı (61). Keşifsel veri analizi ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ve pheatmap kullanılarak gerçekleştirilir. TMT tabanlı proteomik veriler MaxQuant sürüm 1.6.10.43 kullanılarak analiz edildi. Eylül 2018'de indirilen UniProt'un insan proteomik veritabanından ham proteomik verileri arayın. Analiz, üretici tarafından sağlanan izotop saflık düzeltme faktörünü içerir. Diferansiyel ifade analizi için R'de limma kullanın. Orijinal veriler, veritabanı arama sonuçları ve veri analizi iş akışı ve sonuçları, PXD019690 veri seti tanımlayıcısıyla PRIDE ortak deposu aracılığıyla ProteomeXchange ittifakında saklanmaktadır.
Fonksiyonel açıklamalar analizi zenginleştirir. Veri setinin 8 haftalık fonksiyonel açıklama terimlerinin zenginliğini belirlemek için Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) aracı kullanılmıştır (Şekil 1). Kısaca, LC-MS/MS (tandem kütle spektrometrisi) veri analizinden elde edilen kantitatif protein listesi aşağıdaki filtre kriterleriyle kullanılır: Tür ve arka plan olarak Mus musculus seçilir ve kategori, Benjamini tarafından zenginleştirme için ayarlanmış P değeri 0,05 veya daha düşükse anlamlı kabul edilir. Bu grafik için, ayarlanmış P değerine göre her kümedeki en yüksek beş fazla kategori gösterilmiştir. Çoklu t-testi kullanılarak, Benjamini, Krieger ve Yekutieli'nin iki aşamalı doğrusal artırma programı (Q = %5) kullanılarak, her kategoride tanımlanan önemli adaylar üzerinde zaman serisi protein ekspresyon analizi yapılır ve her satır ayrı ayrı analiz edilir. Tutarlı bir standart sapma benimsemeye gerek yoktur.
Bu çalışmanın sonuçlarını yayınlanmış veritabanlarıyla karşılaştırmak ve Şekil 1'de bir Venn diyagramı oluşturmak için, nicel protein listesini MitoCarta 2.0 açıklamalarıyla birleştirdik (24). Diyagramı oluşturmak için çevrimiçi araç Draw Venn Diagram'ı (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) kullanın.
Proteomik analiz için kullanılan istatistiksel prosedürler hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Malzeme ve Yöntemler bölümünün ilgili kısmına bakınız. Diğer tüm deneyler için ayrıntılı bilgiler ilgili açıklamada bulunabilir. Aksi belirtilmedikçe, tüm veriler ortalama ± standart hata (SEM) olarak ifade edilir ve tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism 8.1.2 yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
Bu makaleye ait ek materyaller için lütfen şu adresi ziyaret edin: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Bu, Creative Commons Atıf-Ticari Olmayan Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir; bu lisans, son kullanımın ticari kazanç amacı taşımaması ve orijinal çalışmanın doğru olması şartıyla, herhangi bir ortamda kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin verir. Referans.
Not: Sizden yalnızca e-posta adresinizi istiyoruz, böylece sayfaya tavsiye ettiğiniz kişi e-postayı görmek istediğini ve bunun spam olmadığını anlasın. E-posta adreslerinizi hiçbir şekilde kaydetmeyeceğiz.
Bu soru, ziyaretçi olup olmadığınızı test etmek ve otomatik spam gönderimini önlemek için kullanılır.
Yazan: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
İşlevsiz nöronların proteomik analizi, nörodejenerasyona karşı koymak için metabolik programların aktive edildiğini ortaya koymuştur.
Yazan: E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
İşlevsiz nöronların proteomik analizi, nörodejenerasyona karşı koymak için metabolik programların aktive edildiğini ortaya koymuştur.
©2020 Amerikan Bilimi İlerletme Derneği. her hakkı saklıdır. AAAS, HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ve COUNTER'ın ortağıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.