Bu makale, “Gelişmiş biyoremediasyon teknolojileri ve sentetik organik bileşiklerin (SOC) geri dönüşüm süreçleri” araştırma konusunun bir parçasıdır. Tüm 14 makaleyi görüntüleyin.
Naftalin ve ikame edilmiş naftalinler (metilnaftalin, naftoik asit, 1-naftil-N-metilkarbamat vb.) gibi düşük molekül ağırlıklı polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'lar) çeşitli endüstrilerde yaygın olarak kullanılmaktadır ve organizmalar için genotoksik, mutajenik ve/veya kanserojen etkiye sahiptir. Bu sentetik organik bileşikler (SOC'ler) veya ksenobiyotikler öncelikli kirleticiler olarak kabul edilir ve küresel çevre ve halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturur. İnsan faaliyetlerinin yoğunluğu (örneğin kömür gazlaştırma, petrol rafinerisi, araç emisyonları ve tarımsal uygulamalar), bu yaygın ve kalıcı bileşiklerin konsantrasyonunu, akıbetini ve taşınmasını belirler. Fiziksel ve kimyasal arıtma/uzaklaştırma yöntemlerine ek olarak, PAH'ları tamamen parçalayabilen veya toksik olmayan yan ürünlere dönüştürebilen mikroorganizmalar kullanan biyoremediasyon gibi yeşil ve çevre dostu teknolojiler, güvenli, uygun maliyetli ve umut vadeden bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Toprak mikrobiyotasında bulunan Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia ve Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus ve Paenibacillus) ve Actinobacteria (Rhodococcus ve Arthrobacter) filumlarına ait çeşitli bakteri türleri, çeşitli organik bileşikleri parçalama yeteneği göstermiştir. Metabolik çalışmalar, genomik ve metagenomik analizler, bu basit yaşam formlarında mevcut olan katabolik karmaşıklığı ve çeşitliliği anlamamıza yardımcı olur ve bu da verimli biyolojik bozunma için daha da uygulanabilir. PAH'ların uzun süreli varlığı, plazmidler, transpozonlar, bakteriyofajlar, genomik adalar ve entegratif konjugatif elementler gibi genetik elementler kullanılarak yatay gen transferi yoluyla yeni bozunma fenotiplerinin ortaya çıkmasına neden olmuştur. Belirli izolatların veya model toplulukların (konsorsiyumların) sistem biyolojisi ve genetik mühendisliği, sinerjik etkiler yoluyla bu PAH'ların kapsamlı, hızlı ve verimli biyoremediasyonunu sağlayabilir. Bu incelemede, naftalin ve ikame edilmiş naftalini parçalayan bakterilerin farklı metabolik yollarına ve çeşitliliğine, genetik bileşimine ve çeşitliliğine ve hücresel yanıtlarına/adaptasyonlarına odaklanıyoruz. Bu, saha uygulamaları ve verimli biyoremediasyon için suş optimizasyonu için ekolojik bilgiler sağlayacaktır.
Petrokimya, tarım, ilaç, tekstil boyaları, kozmetik vb. endüstrilerin hızlı gelişimi, küresel ekonomik refaha ve yaşam standartlarının iyileşmesine katkıda bulunmuştur. Bu üstel gelişme, çeşitli ürünlerin üretiminde kullanılan çok sayıda sentetik organik bileşiğin (SOC) üretimine yol açmıştır. Bu yabancı bileşikler veya SOC'ler arasında polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'lar), pestisitler, herbisitler, plastikleştiriciler, boyalar, ilaçlar, organofosfatlar, alev geciktiriciler, uçucu organik çözücüler vb. yer almaktadır. Bunlar atmosfere, su ve kara ekosistemlerine salınarak çok boyutlu etkilere neden olmakta ve fizikokimyasal özelliklerin ve topluluk yapısının değişmesi yoluyla çeşitli biyolojik formlar üzerinde zararlı etkiler yaratmaktadır (Petrie vd., 2015; Bernhardt vd., 2017; Sarkar vd., 2020). Birçok aromatik kirletici, birçok bozulmamış ekosistem/biyoçeşitlilik sıcak noktası üzerinde güçlü ve yıkıcı etkilere sahiptir (örneğin mercan resifleri, Arktik/Antarktika buz tabakaları, yüksek dağ gölleri, derin deniz tortuları vb.) (Jones 2010; Beyer vd. 2020; Nordborg vd. 2020). Son jeomikrobiyolojik çalışmalar, sentetik organik maddelerin (örneğin aromatik kirleticiler) ve türevlerinin yapay yapıların (yapılı çevre) (örneğin granit, taş, ahşap ve metalden yapılmış kültürel miras alanları ve anıtlar) yüzeylerine birikmesinin, bozulmalarını hızlandırdığını göstermiştir (Gadd 2017; Liu vd. 2018). İnsan faaliyetleri, hava kirliliği ve iklim değişikliği yoluyla anıtların ve binaların biyolojik bozulmasını yoğunlaştırabilir ve kötüleştirebilir (Liu vd. 2020). Bu organik kirleticiler atmosferdeki su buharı ile reaksiyona girer ve yapı üzerinde birikerek malzemenin fiziksel ve kimyasal bozulmasına neden olur. Biyolojik bozunma, canlı organizmaların neden olduğu ve malzemelerin görünümünü ve özelliklerini etkileyen istenmeyen değişiklikler olarak yaygın olarak kabul edilmektedir (Pochon ve Jaton, 1967). Bu bileşiklerin mikrobiyal aktivitesi (metabolizması) yapısal bütünlüğü, koruma etkinliğini ve kültürel değeri azaltabilir (Gadd, 2017; Liu vd., 2018). Öte yandan, bazı durumlarda, mikrobiyal adaptasyonun ve bu yapılara verilen tepkinin, biyofilm ve diğer koruyucu kabuklar oluşturarak çürüme/ayrışma oranını azalttığı için faydalı olduğu bulunmuştur (Martino, 2016). Bu nedenle, taş, metal ve ahşap anıtlar için etkili uzun vadeli sürdürülebilir koruma stratejilerinin geliştirilmesi, bu süreçte yer alan temel süreçlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektirir. Doğal süreçlerle (jeolojik süreçler, orman yangınları, volkanik patlamalar, bitki ve bakteri reaksiyonları) karşılaştırıldığında, insan faaliyetleri ekosistemlere büyük miktarlarda polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) ve diğer organik karbon (OC) salınımına neden olur. Tarımda (DDT, atrazin, karbaril, pentaklorofenol vb. gibi böcek ilaçları ve zirai ilaçlar), endüstride (ham petrol, petrol çamuru/atığı, petrolden türetilmiş plastikler, PCB'ler, plastikleştiriciler, deterjanlar, dezenfektanlar, fumigantlar, kokular ve koruyucular), kişisel bakım ürünlerinde (güneş kremleri, dezenfektanlar, böcek kovucular ve polisiklik miskler) ve mühimmatta (2,4,6-TNT gibi patlayıcılar) kullanılan birçok PAH, gezegen sağlığını etkileyebilecek potansiyel ksenobiyotiklerdir (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna ve Phale, 2008; Petrie vd., 2015). Bu liste, petrolden türetilmiş bileşikleri (yakıt yağları, yağlayıcılar, asfaltenler), yüksek moleküler ağırlıklı biyoplastikleri ve iyonik sıvıları içerecek şekilde genişletilebilir (Amde vd., 2015). Tablo 1, çeşitli aromatik kirleticileri ve bunların çeşitli endüstrilerdeki uygulamalarını listelemektedir. Son yıllarda, uçucu organik bileşiklerin yanı sıra karbondioksit ve diğer sera gazlarının insan kaynaklı emisyonları artmaya başlamıştır (Dvorak vd., 2017). Bununla birlikte, insan kaynaklı etkiler doğal etkilerden önemli ölçüde daha fazladır. Ayrıca, birçok SOC'nin birçok çevresel ortamda kalıcı olduğunu ve biyomlar üzerinde olumsuz etkileri olan yeni ortaya çıkan kirleticiler olarak tanımlandığını bulduk (Şekil 1). Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı (USEPA) gibi çevre kuruluşları, sitotoksik, genotoksik, mutajenik ve kanserojen özellikleri nedeniyle bu kirleticilerin birçoğunu öncelik listelerine dahil etmiştir. Bu nedenle, katı bertaraf düzenlemelerine ve kirlenmiş ekosistemlerden atık arıtma/uzaklaştırma için etkili stratejilere ihtiyaç duyulmaktadır. Piroliz, oksidatif termal arıtma, hava havalandırma, depolama, yakma vb. gibi çeşitli fiziksel ve kimyasal arıtma yöntemleri etkisiz ve maliyetlidir ve aşındırıcı, toksik ve arıtılması zor yan ürünler üretir. Küresel çevre bilincinin artmasıyla birlikte, bu kirleticileri ve türevlerini (halojenli, nitro, alkil ve/veya metil gibi) parçalayabilen mikroorganizmalar giderek daha fazla ilgi çekmektedir (Fennell vd., 2004; Haritash ve Kaushik, 2009; Phale vd., 2020; Sarkar vd., 2020; Schwanemann vd., 2020). Aromatik kirleticilerin giderilmesi için bu yerel aday mikroorganizmaların tek başına veya karışık kültürlerde (kolonilerde) kullanılması, çevresel güvenlik, maliyet, verimlilik, etkinlik ve sürdürülebilirlik açısından avantajlar sunmaktadır. Araştırmacılar ayrıca, kirleticilerin arıtılması/giderilmesi için umut vadeden bir teknoloji olarak mikrobiyal süreçlerin elektrokimyasal redoks yöntemleriyle, yani biyoelektrokimyasal sistemlerle (BES) entegrasyonunu da araştırmaktadır (Huang vd., 2011). BES teknolojisi, yüksek verimliliği, düşük maliyeti, çevresel güvenliği, oda sıcaklığında çalışması, biyolojik olarak uyumlu malzemeleri ve değerli yan ürünleri (örneğin, elektrik, yakıt ve kimyasallar) geri kazanma yeteneği nedeniyle giderek artan bir ilgi görmektedir (Pant vd., 2012; Nazari vd., 2020). Yüksek verimli genom dizileme ve omik araçların/yöntemlerin ortaya çıkışı, çeşitli bozucu mikroorganizmaların reaksiyonlarının genetik düzenlenmesi, proteomik ve fluksomikleri hakkında zengin bir yeni bilgi kaynağı sağlamıştır. Bu araçların sistem biyolojisiyle birleştirilmesi, verimli ve etkili biyolojik bozunmayı sağlamak için mikroorganizmalarda hedef katabolik yolların seçimi ve ince ayarlanması (yani metabolik tasarım) konusundaki anlayışımızı daha da geliştirmiştir. Uygun aday mikroorganizmalar kullanarak etkili biyoremediasyon stratejileri tasarlamak için, mikroorganizmaların biyokimyasal potansiyelini, metabolik çeşitliliğini, genetik bileşimini ve ekolojisini (otoekoloji/sinekoloji) anlamamız gerekir.
Şekil 1. Düşük moleküler ağırlıklı PAH'ların çeşitli çevresel ortamlardaki kaynakları ve biyotayı etkileyen çeşitli faktörler aracılığıyla izlediği yollar. Kesikli çizgiler ekosistem unsurları arasındaki etkileşimleri göstermektedir.
Bu derlemede, naftalin ve ikame edilmiş naftalinler gibi basit PAH'ların çeşitli bakteri izolatları tarafından parçalanmasına ilişkin verileri özetlemeye çalıştık; bu kapsamda metabolik yollar ve çeşitlilik, parçalanmada yer alan enzimler, gen bileşimi/içeriği ve çeşitliliği, hücresel yanıtlar ve biyoremediasyonun çeşitli yönleri ele alındı. Biyokimyasal ve moleküler seviyelerin anlaşılması, bu tür öncelikli kirleticilerin etkili biyoremediasyonu için uygun konakçı suşların belirlenmesine ve bunların genetik mühendisliğine yardımcı olacaktır. Bu, etkili biyoremediasyon için bölgeye özgü bakteri topluluklarının oluşturulmasına yönelik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
Çok sayıda toksik ve tehlikeli aromatik bileşiğin (Hückel kuralı 4n + 2π elektron, n = 1, 2, 3, … sağlayan) varlığı, hava, toprak, tortular, yüzey ve yeraltı suları gibi çeşitli çevresel ortamlara ciddi bir tehdit oluşturmaktadır (Puglisi vd., 2007). Bu bileşikler, doğrusal, açısal veya küme formunda düzenlenmiş tek benzen halkalarına (monosiklik) veya çoklu benzen halkalarına (polisiklik) sahiptir ve yüksek negatif rezonans enerjisi nedeniyle çevrede kararlılık (kararlılık/kararsızlık) ve inertlik (atalet) sergilerler; bu durum, hidrofobiklikleri ve indirgenmiş halleriyle açıklanabilir. Aromatik halkanın metil (-CH3), karboksil (-COOH), hidroksil (-OH) veya sülfonat (-HSO3) gruplarıyla daha da değiştirilmesi durumunda, daha kararlı hale gelir, makromoleküllere daha güçlü bir afinite gösterir ve biyolojik sistemlerde biyolojik olarak birikir (Seo vd., 2009; Phale vd., 2020). Naftalin ve türevleri [metilnaftalin, naftoik asit, naftalinsülfonat ve 1-naftil N-metilkarbamat (karbaril)] gibi bazı düşük molekül ağırlıklı polisiklik aromatik hidrokarbonlar (LMWAH'lar), ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından genotoksik, mutajenik ve/veya kanserojen olarak öncelikli organik kirleticiler listesine dahil edilmiştir (Cerniglia, 1984). Bu NM-PAH sınıfının çevreye salınması, bu bileşiklerin besin zincirinin tüm seviyelerinde biyolojik birikimine yol açarak ekosistemlerin sağlığını etkileyebilir (Binkova vd., 2000; Srogi, 2007; Quinn vd., 2009).
PAH'ların biyotaya ulaşma kaynakları ve yolları, öncelikle toprak, yeraltı suyu, yüzey suyu, mahsuller ve atmosfer gibi farklı ekosistem bileşenleri arasındaki göç ve etkileşimler yoluyladır (Arey ve Atkinson, 2003). Şekil 1, ekosistemlerdeki farklı düşük molekül ağırlıklı PAH'ların etkileşimlerini ve dağılımlarını ve biyota/insan maruziyetine giden yollarını göstermektedir. PAH'lar, hava kirliliği ve araç emisyonlarının, endüstriyel egzoz gazlarının (kömür gazlaştırma, yanma ve kok üretimi) göçü (sürüklenmesi) ve bunların birikmesi sonucu yüzeylere çökelir. Sentetik tekstil, boya ve vernik üretimi; ahşap koruma; kauçuk işleme; çimento üretim faaliyetleri; pestisit üretimi ve tarımsal uygulamalar gibi endüstriyel faaliyetler, karasal ve su sistemlerinde PAH'ların başlıca kaynaklarıdır (Bamforth ve Singleton, 2005; Wick vd., 2011). Çalışmalar, banliyö ve kentsel alanlardaki, otoyolların yakınındaki ve büyük şehirlerdeki toprakların, enerji santrallerinden, konut ısıtmasından, hava ve karayolu trafiğinden kaynaklanan emisyonlar ve inşaat faaliyetleri nedeniyle polisiklik aromatik hidrokarbonlara (PAH'lar) daha duyarlı olduğunu göstermiştir (Suman vd., 2016). (2008) yılında yapılan bir çalışma, ABD'nin Louisiana eyaletindeki New Orleans şehrinde yolların yakınındaki topraktaki PAH seviyelerinin 7189 μg/kg kadar yüksek olduğunu, açık alanlarda ise sadece 2404 μg/kg olduğunu göstermiştir. Benzer şekilde, ABD'deki çeşitli şehirlerde kömür gazlaştırma tesislerinin yakınındaki alanlarda 300 μg/kg'a kadar yüksek PAH seviyeleri bildirilmiştir (Kanaly ve Harayama, 2000; Bamforth ve Singleton, 2005). Delhi (Sharma vd., 2008), Agra (Dubey vd., 2014), Mumbai (Kulkarni ve Venkataraman, 2000) ve Visakhapatnam (Kulkarni vd., 2014) gibi çeşitli Hint şehirlerinden alınan topraklarda yüksek konsantrasyonlarda PAH bulunduğu bildirilmiştir. Aromatik bileşikler toprak parçacıklarına, organik maddeye ve kil minerallerine daha kolay adsorbe olur ve böylece ekosistemlerde önemli karbon yutakları haline gelir (Srogi, 2007; Peng vd., 2008). Su ekosistemlerindeki PAH'ların başlıca kaynakları yağış (ıslak/kuru yağış ve su buharı), kentsel akıntı, atık su deşarjı, yeraltı suyu beslenmesi vb.dir (Srogi, 2007). Deniz ekosistemlerindeki PAH'ların yaklaşık %80'inin yağış, tortulaşma ve atık deşarjından kaynaklandığı tahmin edilmektedir (Motelay-Massei vd., 2006; Srogi, 2007). Yüzey sularında veya katı atık bertaraf alanlarından sızan yüksek PAH konsantrasyonları sonunda yeraltı sularına karışarak, Güney ve Güneydoğu Asya nüfusunun %70'inden fazlasının yeraltı suyu içmesi nedeniyle büyük bir halk sağlığı tehdidi oluşturmaktadır (Duttagupta vd., 2019). Duttagupta vd. (2020) tarafından Hindistan'ın Batı Bengal bölgesinden alınan nehir (32) ve yeraltı suyu (235) analizlerine ilişkin yakın tarihli bir çalışmada, kentsel sakinlerin %53'ünün ve kırsal sakinlerin %44'ünün (toplam 20 milyon kişi) naftalin (4,9–10,6 μg/L) ve türevlerine maruz kalabileceği tahmin edilmektedir. Farklı arazi kullanım modelleri ve artan yeraltı suyu çekimi, düşük molekül ağırlıklı PAH'ların yeraltındaki dikey taşınımını (konveksiyon) kontrol eden ana faktörler olarak kabul edilmektedir. Tarımsal akıntı, belediye ve endüstriyel atık su deşarjları ve katı atık/çöp deşarjlarının nehir havzalarında ve yeraltı tortularında PAH'lardan etkilendiği bulunmuştur. Atmosferik yağışlar PAH kirliliğini daha da kötüleştirmektedir. Fraser Nehri, Louan Nehri, Denso Nehri, Missouri Nehri, Anacostia Nehri, Ebro Nehri ve Delaware Nehri gibi dünya çapındaki nehirlerde/havzalarda yüksek konsantrasyonlarda PAH ve alkil türevleri (toplam 51 adet) rapor edilmiştir (Yunker vd., 2002; Motelay-Massei vd., 2006; Li vd., 2010; Amoako vd., 2011; Kim vd., 2018). Ganj Nehri havzası tortullarında naftalin ve fenantrenin en önemli (örneklerin %70'inde tespit edildi) PAH'lar olduğu bulunmuştur (Duttagupta vd., 2019). Dahası, çalışmalar içme suyunun klorlanmasının daha toksik oksijenli ve klorlu PAH'ların oluşumuna yol açabileceğini göstermiştir (Manoli ve Samara, 1999). PAH'lar, bitkilerin kirlenmiş topraklardan, yeraltı sularından ve yağışlardan alımı sonucu tahıllarda, meyvelerde ve sebzelerde birikir (Fismes vd., 2002). Balık, midye, istiridye ve karides gibi birçok sucul organizma, kirlenmiş yiyecek ve deniz suyu tüketiminin yanı sıra dokular ve deri yoluyla da PAH'larla kirlenir (Mackay ve Fraser, 2000). Izgara, kavurma, tütsüleme, kızartma, kurutma, fırınlama ve kömürde pişirme gibi pişirme/işleme yöntemleri de gıdalarda önemli miktarda PAH'a yol açabilir. Bu durum büyük ölçüde kullanılan tütün malzemesine, fenolik/aromatik hidrokarbon içeriğine, pişirme yöntemine, ısıtıcı tipine, nem içeriğine, oksijen kaynağına ve yanma sıcaklığına bağlıdır (Guillén vd., 2000; Gomes vd., 2013). Polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'lar) da sütte değişen konsantrasyonlarda (0,75–2,1 mg/L) tespit edilmiştir (Girelli vd., 2014). Bu PAH'ların gıdalardaki birikimi, gıdanın fizikokimyasal özelliklerine de bağlıdır; toksik etkileri ise fizyolojik fonksiyonlar, metabolik aktivite, emilim, dağılım ve vücut dağılımı ile ilişkilidir (Mechini vd., 2011).
Polisiklik aromatik hidrokarbonların (PAH'lar) toksisitesi ve zararlı etkileri uzun zamandır bilinmektedir (Cherniglia, 1984). Düşük molekül ağırlıklı polisiklik aromatik hidrokarbonlar (LMW-PAH'lar) (iki ila üç halkalı), DNA, RNA ve proteinler gibi çeşitli makromoleküllere kovalent olarak bağlanabilir ve kanserojendir (Santarelli vd., 2008). Hidrofobik yapıları nedeniyle lipid zarlar tarafından ayrılırlar. İnsanlarda, sitokrom P450 monooksijenazlar PAH'ları epoksitlere oksitler; bunlardan bazıları oldukça reaktiftir (örneğin, baediol epoksit) ve normal hücrelerin malign hücrelere dönüşmesine yol açabilir (Marston vd., 2001). Ayrıca, kinonlar, fenoller, epoksitler, dioller vb. gibi PAH'ların dönüşüm ürünleri, ana bileşiklerden daha toksiktir. Bazı PAH'lar ve metabolik ara ürünleri hormonları ve metabolizmadaki çeşitli enzimleri etkileyerek büyümeyi, merkezi sinir sistemini, üreme ve bağışıklık sistemlerini olumsuz yönde etkileyebilir (Swetha ve Phale, 2005; Vamsee-Krishna vd., 2006; Oostingh vd., 2008). Düşük molekül ağırlıklı PAH'lara kısa süreli maruz kalmanın astımlılarda akciğer fonksiyon bozukluğuna ve tromboza neden olduğu ve deri, akciğer, mesane ve gastrointestinal kanser riskini artırdığı bildirilmiştir (Olsson vd., 2010; Diggs vd., 2011). Hayvan çalışmaları ayrıca PAH maruziyetinin üreme fonksiyonu ve gelişimi üzerinde olumsuz etkileri olabileceğini ve katarakt, böbrek ve karaciğer hasarı ve sarılığa neden olabileceğini göstermiştir. Dioller, epoksitler, kinonlar ve serbest radikaller (katyonlar) gibi çeşitli PAH biyotransformasyon ürünlerinin DNA eklentileri oluşturduğu gösterilmiştir. Kararlı eklentilerin DNA replikasyon mekanizmasını değiştirdiği, kararsız eklentilerin ise DNA'yı depürinasyona uğratabildiği (çoğunlukla adenine ve bazen guanine) gösterilmiştir; her ikisi de mutasyonlara yol açan hatalar üretebilir (Schweigert vd. 2001). Ek olarak, kinonlar (benzo-/pan-) reaktif oksijen türleri (ROS) üreterek DNA'ya ve diğer makromoleküllere ölümcül hasar verebilir ve böylece doku fonksiyonunu/yaşamını etkileyebilir (Ewa ve Danuta 2017). Düşük konsantrasyonlarda piren, bifenil ve naftaline kronik maruz kalmanın deney hayvanlarında kansere neden olduğu bildirilmiştir (Diggs vd. 2012). Ölümcül toksisiteleri nedeniyle, bu PAH'ların etkilenen/kirlenmiş alanlardan temizlenmesi/uzaklaştırılması öncelikli bir konudur.
Kirlenmiş alanlardan/ortamlardan PAH'ları uzaklaştırmak için çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemler kullanılmıştır. Yakma, klor giderme, UV oksidasyonu, fiksasyon ve çözücü ekstraksiyonu gibi işlemlerin, toksik yan ürün oluşumu, işlem karmaşıklığı, güvenlik ve düzenleyici sorunlar, düşük verimlilik ve yüksek maliyet gibi birçok dezavantajı vardır. Bununla birlikte, mikrobiyal biyolojik bozunma (biyoremediasyon olarak adlandırılır), saf kültürler veya koloniler şeklinde mikroorganizmaların kullanımını içeren umut vadeden bir alternatif yaklaşımdır. Fiziksel ve kimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu işlem çevre dostu, invaziv olmayan, uygun maliyetli ve sürdürülebilirdir. Biyolojik iyileştirme, etkilenen alanda (yerinde) veya özel olarak hazırlanmış bir alanda (yer dışında) gerçekleştirilebilir ve bu nedenle geleneksel fiziksel ve kimyasal yöntemlere göre daha sürdürülebilir bir iyileştirme yöntemi olarak kabul edilir (Juhasz ve Naidu, 2000; Andreoni ve Gianfreda, 2007; Megharaj vd., 2011; Phale vd., 2020; Sarkar vd., 2020).
Aromatik kirleticilerin parçalanmasında yer alan mikrobiyal metabolik adımların anlaşılması, ekolojik ve çevresel sürdürülebilirlik açısından muazzam bilimsel ve ekonomik sonuçlar doğurmaktadır. Dünya genelinde tortularda ve organik bileşiklerde (örneğin, petrol, doğal gaz ve kömür, yani fosil yakıtlar) tahmini 2,1×10¹⁸ gram karbon (C) depolanmakta ve küresel karbon döngüsüne önemli bir katkı sağlamaktadır. Bununla birlikte, hızlı sanayileşme, fosil yakıt çıkarımı ve insan faaliyetleri bu litosferik karbon rezervlerini tüketmekte ve yılda tahmini 5,5×10¹⁵ gram organik karbonu (kirletici olarak) atmosfere salmaktadır (Gonzalez-Gaya vd., 2019). Bu organik karbonun çoğu, tortulaşma, taşınma ve akıntı yoluyla karasal ve deniz ekosistemlerine girmektedir. Ayrıca, plastikler, plastikleştiriciler ve plastik stabilizatörler (ftalatlar ve izomerleri) gibi fosil yakıtlardan türetilen yeni sentetik kirleticiler, deniz, toprak ve su ekosistemlerini ve biyotalarını ciddi şekilde kirleterek küresel iklim risklerini artırmaktadır. Çeşitli mikroplastikler, nanoplastikler, plastik parçaları ve polietilen tereftalattan (PET) türetilen toksik monomer ürünleri, Kuzey Amerika ile Güneydoğu Asya arasında Pasifik Okyanusu'nda birikerek "Büyük Pasifik Çöp Yaması"nı oluşturmuş ve deniz yaşamına zarar vermiştir (Newell vd., 2020). Bilimsel çalışmalar, bu tür kirleticilerin/atıkların herhangi bir fiziksel veya kimyasal yöntemle uzaklaştırılmasının mümkün olmadığını kanıtlamıştır. Bu bağlamda, en faydalı mikroorganizmalar, kirleticileri oksidatif olarak karbondioksit, kimyasal enerji ve diğer toksik olmayan yan ürünlere dönüştürebilen ve sonunda diğer besin döngüsü süreçlerine (H, O, N, S, P, Fe, vb.) giren mikroorganizmalardır. Bu nedenle, aromatik kirleticilerin mineralizasyonunun mikrobiyal ekofizyolojisini ve çevresel kontrolünü anlamak, mikrobiyal karbon döngüsünü, net karbon bütçesini ve gelecekteki iklim risklerini değerlendirmek için çok önemlidir. Bu tür bileşiklerin çevreden uzaklaştırılması acil bir ihtiyaç olduğundan, temiz teknolojilere odaklanan çeşitli eko-endüstriler ortaya çıkmıştır. Alternatif olarak, ekosistemlerde biriken endüstriyel atıkların/atık kimyasalların değerlendirilmesi (yani atıktan zenginliğe yaklaşım), döngüsel ekonominin ve sürdürülebilir kalkınma hedeflerinin temel taşlarından biri olarak kabul edilmektedir (Close vd., 2012). Bu nedenle, bu potansiyel bozunma adaylarının metabolik, enzimatik ve genetik yönlerini anlamak, bu tür aromatik kirleticilerin etkili bir şekilde uzaklaştırılması ve biyoremediasyonu için son derece önemlidir.
Birçok aromatik kirletici madde arasında, naftalin ve ikame edilmiş naftalinler gibi düşük molekül ağırlıklı PAH'lara özel önem veriyoruz. Bu bileşikler, petrol türevli yakıtların, tekstil boyalarının, tüketici ürünlerinin, pestisitlerin (güve kovucu ve böcek ilaçları), plastikleştiricilerin ve tanenlerin başlıca bileşenleridir ve bu nedenle birçok ekosistemde yaygındır (Preuss vd., 2003). Son raporlar, naftalin konsantrasyonlarının akifer tortularında, yeraltı sularında ve yüzey altı topraklarında, doymamış bölgelerde ve nehir yataklarında biriktiğini vurgulayarak, çevrede biyolojik birikimini göstermektedir (Duttagupta vd., 2019, 2020). Tablo 2, naftalin ve türevlerinin fizikokimyasal özelliklerini, uygulamalarını ve sağlık etkilerini özetlemektedir. Diğer yüksek molekül ağırlıklı PAH'larla karşılaştırıldığında, naftalin ve türevleri daha az hidrofobik, daha suda çözünür ve ekosistemlerde yaygın olarak bulunur; bu nedenle, PAH'ların metabolizması, genetiği ve metabolik çeşitliliğini incelemek için sıklıkla model substrat olarak kullanılırlar. Çok sayıda mikroorganizma naftalin ve türevlerini metabolize edebilmektedir ve metabolik yolları, enzimleri ve düzenleyici özellikleri hakkında kapsamlı bilgiler mevcuttur (Mallick vd., 2011; Phale vd., 2019, 2020). Ayrıca, naftalin ve türevleri, yüksek bollukları ve biyoyararlanımları nedeniyle çevresel kirlilik değerlendirmesi için prototip bileşikler olarak belirlenmiştir. ABD Çevre Koruma Ajansı, sigara dumanından kaynaklanan ortalama naftalin seviyelerinin, esas olarak eksik yanmadan dolayı, metreküp başına 5,19 μg olduğunu ve yan dumandan kaynaklanan naftalin seviyelerinin ise 7,8 ila 46 μg arasında olduğunu tahmin etmektedir; kreozot ve naftaline maruz kalma ise 100 ila 10.000 kat daha yüksektir (Preuss vd. 2003). Özellikle naftalinin tür, bölge ve cinsiyete özgü solunum yolu toksisitesi ve kanserojenliği olduğu bulunmuştur. Hayvan çalışmaları temelinde, Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı (IARC), naftalini "olası insan kanserojeni" (Grup 2B) olarak sınıflandırmıştır¹. Sübstitüe naftalinlere, esas olarak solunum yoluyla veya parenteral (ağızdan) uygulama yoluyla maruz kalma, sıçanlarda ve farelerde akciğer dokusu hasarına neden olur ve akciğer tümörlerinin görülme sıklığını artırır (Ulusal Toksikoloji Programı²). Akut etkiler arasında bulantı, kusma, karın ağrısı, ishal, baş ağrısı, kafa karışıklığı, aşırı terleme, ateş, taşikardi vb. yer almaktadır. Öte yandan, geniş spektrumlu karbamat insektisit karbaril (1-naftil N-metilkarbamat), sucul omurgasızlar, amfibiler, bal arıları ve insanlar için toksik olduğu ve asetilkolinesterazı inhibe ederek felce neden olduğu bildirilmiştir (Smulders vd., 2003; Bulen ve Distel, 2011). Bu nedenle, mikrobiyal bozunma, genetik düzenleme, enzimatik ve hücresel reaksiyonların mekanizmalarını anlamak, kirlenmiş ortamlarda biyoremediasyon stratejileri geliştirmek için çok önemlidir.
Tablo 2. Naftalin ve türevlerinin fizikokimyasal özellikleri, kullanım alanları, tanımlama yöntemleri ve ilişkili hastalıklar hakkında detaylı bilgiler.
Kirlenmiş ortamlarda, hidrofobik ve lipofilik aromatik kirleticiler, çevresel mikrobiyom (topluluk) üzerinde çeşitli hücresel etkilere neden olabilir; bunlar arasında membran akışkanlığında, membran geçirgenliğinde, lipid çift katmanının şişmesinde, enerji transferinin (elektron taşıma zinciri/proton itici kuvveti) bozulmasında ve membranla ilişkili proteinlerin aktivitesinde değişiklikler yer alır (Sikkema vd., 1995). Ayrıca, katekoller ve kinonlar gibi bazı çözünür ara ürünler reaktif oksijen türleri (ROS) üretir ve DNA ve proteinlerle adduktlar oluşturur (Penning vd., 1999). Bu nedenle, ekosistemlerde bu tür bileşiklerin bolluğu, mikrobiyal topluluklar üzerinde alım/taşıma, hücre içi dönüşüm, özümseme/kullanım ve bölümlendirme dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik seviyelerde verimli bozucular haline gelmeleri için seçici bir baskı oluşturur.
Ribozomal Veritabanı Projesi-II'de (RDP-II) yapılan bir arama, naftalin veya türevleriyle kontamine olmuş ortam veya zenginleştirme kültürlerinden toplam 926 bakteri türünün izole edildiğini ortaya koymuştur. Proteobacteria grubu en yüksek temsilci sayısına (n = 755) sahipken, bunu Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) ve sınıflandırılmamış bakteriler (8) takip etmiştir (Şekil 2). γ-Proteobacteria (Pseudomonadales ve Xanthomonadales) temsilcileri, yüksek G+C içeriğine sahip tüm Gram-negatif gruplarda (%54) baskınken, Clostridiales ve Bacillales (%30) düşük G+C içeriğine sahip Gram-pozitif gruplardı. Pseudomonas türlerinin (en yüksek sayı, 338 tür) çeşitli kirlenmiş ekosistemlerde (kömür katranı, petrol, ham petrol, çamur, petrol sızıntıları, atık su, organik atık ve çöplükler) ve ayrıca bozulmamış ekosistemlerde (toprak, nehirler, tortular ve yeraltı suları) naftalin ve metil türevlerini parçalayabildiği bildirilmiştir (Şekil 2). Dahası, bu bölgelerin bazılarında yapılan zenginleştirme çalışmaları ve metagenomik analizler, kültürlenmemiş Legionella ve Clostridium türlerinin de parçalama kapasitesine sahip olabileceğini ortaya koymuş ve bu bakterilerin yeni yollar ve metabolik çeşitlilik açısından incelenmesi için kültürlenmesi gerekliliğini göstermiştir.
Şekil 2. Naftalin ve naftalin türevleriyle kirlenmiş ortamlardaki bakteri temsilcilerinin taksonomik çeşitliliği ve ekolojik dağılımı.
Çeşitli aromatik hidrokarbon parçalayan mikroorganizmalar arasında çoğu, naftalini tek karbon ve enerji kaynağı olarak parçalayabilme yeteneğine sahiptir. Naftalin metabolizmasında yer alan olaylar dizisi, Pseudomonas sp. için tanımlanmıştır. (suşlar: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 ve CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 ve diğer suşlar (ND6 ve AS1) (Mahajan vd., 1994; Resnick vd., 1996; Annweiler vd., 2000; Basu vd., 2003; Dennis ve Zylstra, 2004; Sota vd., 2006; Metabolizma, naftalinin aromatik halkalarından birinin oksidasyonunu moleküler oksijeni diğer substrat olarak kullanarak katalize eden çok bileşenli bir dioksijenaz [naftalin dioksijenaz (NDO), bir halka hidroksilleyici dioksijenaz] tarafından başlatılır ve naftalini cis-naftalendiole dönüştürür (Şekil 3). Cis-dihidrodiol Bir dehidrojenaz tarafından 1,2-dihidroksinaftaline dönüştürülür. Halkayı parçalayan bir dioksijenaz olan 1,2-dihidroksinaftalen dioksijenaz (12DHNDO), 1,2-dihidroksinaftalini 2-hidroksikromen-2-karboksilik aside dönüştürür. Enzimatik cis-trans izomerizasyonu, hidrataz aldolaz tarafından salisilik aldehit ve piruvata parçalanan trans-o-hidroksibenzilidenpiruvat üretir. Organik asit piruvat, naftalin karbon iskeletinden türetilen ve merkezi karbon yoluna yönlendirilen ilk C3 bileşiğidir. Ek olarak, NAD+-bağımlı salisilaldehit dehidrojenaz, salisilaldehiti salisilik aside dönüştürür. Bu aşamadaki metabolizma, naftalin bozunmasının "üst yolu" olarak adlandırılır. Bu yol, çoğu naftalin parçalayan bakteride çok yaygındır. Bununla birlikte, birkaç istisna vardır. İstisnalar mevcuttur; örneğin, termofilik Bacillus hamburgii 2'de naftalin bozunumu, naftalin 2,3-dioksigenaz tarafından başlatılarak 2,3-dihidroksinaftalin oluşumuna yol açar (Annweiler ve ark., 2000).
Şekil 3. Naftalin, metilnaftalin, naftoik asit ve karbaril bozunma yolları. Daire içine alınmış sayılar, naftalin ve türevlerinin ardışık ürünlere dönüştürülmesinden sorumlu enzimleri temsil eder. 1 — naftalin dioksijenaz (NDO); 2, cis-dihidrodiol dehidrojenaz; 3, 1,2-dihidroksinaftalin dioksijenaz; 4, 2-hidroksikromen-2-karboksilik asit izomeraz; 5, trans-O-hidroksibenzilidenpiruvat hidrataz aldolaz; 6, salisilaldehit dehidrojenaz; 7, salisilat 1-hidroksilaz; 8, katekol 2,3-dioksijenaz (C23DO); 9, 2-hidroksimukonat semialdehit dehidrojenaz; 10, 2-oksopent-4-enoat hidrataz; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaz; 12, asetaldehit dehidrojenaz; 13, katekol-1,2-dioksijenaz (C12DO); 14, mukonat sikloizomeraz; 15, mukonolakton delta-izomeraz; 16, β-ketoadipatenollakton hidrolaz; 17, β-ketoadipat süksinil-CoA transferaz; 18, β-ketoadipat-CoA tiyolaz; 19, süksinil-CoA: asetil-CoA süksiniltransferaz; 20, salisilat 5-hidroksilaz; 21 – gentisat 1,2-dioksijenaz (GDO); 22, maleilpiruvat izomeraz; 23, fumarilpiruvat hidrolaz; 24, metilnaftalen hidroksilaz (NDO); 25, hidroksimetilnaftalen dehidrojenaz; 26, naftaldehit dehidrojenaz; 27, 3-formilsalisilik asit oksidaz; 28, hidroksiizoftalat dekarboksilaz; 29, karbaril hidrolaz (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilaz.
Organizmaya ve genetik yapısına bağlı olarak, oluşan salisilik asit, ya salisilat 1-hidroksilaz (S1H) kullanılarak katekol yoluyla ya da salisilat 5-hidroksilaz (S5H) kullanılarak gentisat yoluyla daha fazla metabolize edilir (Şekil 3). Salisilik asit, naftalin metabolizmasında (üst yol) ana ara madde olduğundan, salisilik asitten TCA ara maddesine kadar olan adımlar genellikle alt yol olarak adlandırılır ve genler tek bir operon halinde düzenlenir. Üst yol operonundaki (nah) ve alt yol operonundaki (sal) genlerin ortak düzenleyici faktörler tarafından düzenlendiği yaygın olarak görülür; örneğin, NahR ve salisilik asit, her iki operonun da naftalini tamamen metabolize etmesine olanak tanıyan indükleyiciler olarak işlev görür (Phale vd., 2019, 2020).
Ek olarak, katekol, katekol 2,3-dioksigenaz (C23DO) tarafından meta yoluyla döngüsel olarak 2-hidroksimukonat semialdehite parçalanır (Yen vd., 1988) ve daha sonra 2-hidroksimukonat semialdehit hidrolaz tarafından hidrolize edilerek 2-hidroksipent-2,4-dienoik asit oluşturur. 2-hidroksipent-2,4-dienoat daha sonra bir hidrataz (2-oksopent-4-enoat hidrataz) ve bir aldolaz (4-hidroksi-2-oksopentanoat aldolaz) tarafından piruvat ve asetaldehite dönüştürülür ve ardından merkezi karbon yoluna girer (Şekil 3). Alternatif olarak, katekol, katekol 1,2-oksigenaz (C12DO) tarafından orto yoluyla döngüsel olarak cis,cis-mukonata parçalanır. Mukonat sikloizomeraz, mukonolakton izomeraz ve β-ketoadipat-nollakton hidrolaz, cis,cis-mukonatı 3-oksoadipat'a dönüştürür; bu da süksinil-CoA ve asetil-CoA yoluyla merkezi karbon yoluna girer (Nozaki vd., 1968) (Şekil 3).
Gentisat (2,5-dihidroksibenzoat) yolunda, aromatik halka gentisat 1,2-dioksigenaz (GDO) tarafından parçalanarak maleilpiruvat oluşturur. Bu ürün doğrudan piruvat ve malata hidrolize edilebilir veya izomerize edilerek fumarilpiruvat oluşturabilir; bu da daha sonra piruvat ve fumarata hidrolize edilebilir (Larkin ve Day, 1986). Alternatif yolun seçimi, hem Gram-negatif hem de Gram-pozitif bakterilerde biyokimyasal ve genetik düzeylerde gözlemlenmiştir (Morawski vd., 1997; Whyte vd., 1997). Gram-negatif bakteriler (Pseudomonas), naftalin metabolizmasının bir indükleyicisi olan salisilik asidi kullanmayı tercih eder ve salisilat 1-hidroksilaz kullanarak onu katekol'e dekarboksilize eder (Gibson ve Subramanian, 1984). Öte yandan, Gram-pozitif bakterilerde (Rhodococcus), salisilat 5-hidroksilaz salisilik asidi gentisik aside dönüştürürken, salisilik asidin naftalin genlerinin transkripsiyonu üzerinde indükleyici bir etkisi yoktur (Grund ve ark., 1992) (Şekil 3).
Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas ve Mycobacterium türleri gibi türlerin monometilnaftalin veya dimetilnaftalini parçalayabildiği bildirilmiştir (Dean-Raymond ve Bartha, 1975; Cane ve Williams, 1982; Mahajan vd., 1994; Dutta vd., 1998; Hedlund vd., 1999). Bunlar arasında, Pseudomonas sp.'nin 1-metilnaftalin ve 2-metilnaftalin parçalama yolu öne çıkmaktadır. CSV86, biyokimyasal ve enzimatik düzeylerde açıkça incelenmiştir (Mahajan vd., 1994). 1-Metilnaftalin iki yol üzerinden metabolize edilir. İlk olarak, aromatik halka (metilnaftalinin ikame edilmemiş halkası) hidroksillenerek cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalin oluşturur; bu daha sonra metil salisilat ve metilkatekol'e oksitlenir ve ardından halka kırılmasından sonra merkezi karbon yoluna girer (Şekil 3). Bu yola "karbon kaynağı yolu" denir. İkinci "detoksifikasyon yolu"nda, metil grubu NDO tarafından hidroksillenerek 1-hidroksimetilnaftalin oluşturabilir; bu daha sonra 1-naftoik aside oksitlenir ve son ürün olarak kültür ortamına salınır. Çalışmalar, CSV86 suşunun tek karbon ve enerji kaynağı olarak 1- ve 2-naftoik asit üzerinde büyüyemediğini ve detoksifikasyon yolunu doğruladığını göstermiştir (Mahajan vd., 1994; Basu vd., 2003). 2-metilnaftalende, metil grubu hidroksilaz tarafından hidroksilasyona uğrayarak 2-hidroksimetilnaftalen oluşturur. Ek olarak, naftalen halkasının ikame edilmemiş halkası, bir dizi enzim katalizli reaksiyonda 4-hidroksimetilkatekol'e oksitlenen ve meta-halka kırılma yoluyla merkezi karbon yoluna giren bir dihidrodiol oluşturmak üzere halka hidroksilasyonuna uğrar. Benzer şekilde, S. paucimobilis 2322'nin NDO'yu kullanarak 2-metilnaftalini hidroksile ettiği ve bunun da daha sonra oksitlenerek metil salisilat ve metilkatekol oluşturduğu bildirilmiştir (Dutta ve ark., 1998).
Naftoik asitler (sübstütüe/sübstütüe edilmemiş), metilnaftalin, fenantren ve antrasenin bozunması sırasında oluşan ve kullanılmış kültür ortamına salınan detoksifikasyon/biyotransformasyon yan ürünleridir. Toprak izolatı Stenotrophomonas maltophilia CSV89'un 1-naftoik asidi karbon kaynağı olarak metabolize edebildiği bildirilmiştir (Phale vd., 1995). Metabolizma, aromatik halkanın dihidroksilasyonu ile 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalen oluşumuyla başlar. Oluşan diol, 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenpiruvat, 3-formilsalisilik asit, 2-hidroksiizoftalik asit ve salisilik asit yoluyla katekol'e oksitlenir ve meta-halka kırılma yoluyla merkezi karbon yoluna girer (Şekil 3).
Karbaril, naftil karbamat bir pestisittir. 1970'lerde Hindistan'daki Yeşil Devrim'den bu yana, kimyasal gübre ve pestisit kullanımı, tarımsal yaygın kaynaklardan kaynaklanan polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) emisyonlarında artışa yol açmıştır (Pingali, 2012; Duttagupta vd., 2020). Hindistan'daki toplam ekili alanın tahmini %55'i (85.722.000 hektar) kimyasal pestisitlerle işlenmektedir. Son beş yılda (2015-2020), Hindistan tarım sektörü yılda ortalama 55.000 ila 60.000 ton pestisit kullanmıştır (Hindistan Hükümeti, Tarım Bakanlığı, Kooperatifler ve Çiftçi Refahı Dairesi, Ağustos 2020). Kuzey ve orta Ganj ovalarında (en yüksek nüfus ve nüfus yoğunluğuna sahip eyaletler), ürünlerde pestisit kullanımı yaygındır ve insektisitler baskın durumdadır. Karbaril (1-naftil-N-metilkarbamat), Hindistan tarımında ortalama 100-110 ton oranında kullanılan, geniş spektrumlu, orta ila yüksek derecede toksik bir karbamat insektisittir. Genellikle Sevin ticari adıyla satılır ve çeşitli mahsulleri (mısır, soya fasulyesi, pamuk, meyve ve sebzeler) etkileyen böcekleri (yaprak bitleri, ateş karıncaları, pireler, akarlar, örümcekler ve diğer birçok dış mekan zararlısı) kontrol etmek için kullanılır. Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus ve Arthrobacter gibi bazı mikroorganizmalar da diğer zararlıları kontrol etmek için kullanılabilir. RC100'ün karbarili parçalayabildiği bildirilmiştir (Larkin ve Day, 1986; Chapalamadugu ve Chaudhry, 1991; Hayatsu vd., 1999; Swetha ve Phale, 2005; Trivedi vd., 2017). Karbarilin parçalanma yolu, Pseudomonas sp. C4, C5 ve C6 suşlarının toprak izolatlarında biyokimyasal, enzimatik ve genetik düzeylerde kapsamlı bir şekilde incelenmiştir (Swetha ve Phale, 2005; Trivedi vd., 2016) (Şekil 3). Metabolik yol, ester bağının karbaril hidrolaz (CH) tarafından hidroliziyle başlar ve 1-naftol, metilamin ve karbondioksit oluşturur. 1-naftol daha sonra 1-naftol hidroksilaz (1-NH) tarafından 1,2-dihidroksinaftaline dönüştürülür ve bu da salisilat ve gentisat yoluyla merkezi karbon yoluyla daha fazla metabolize edilir. Bazı karbaril parçalayan bakterilerin, katekol orto halkasının parçalanması yoluyla salisilik aside dönüştürdüğü bildirilmiştir (Larkin ve Day, 1986; Chapalamadugu ve Chaudhry, 1991). Özellikle, naftalin parçalayan bakteriler öncelikle salisilik asidi katekol yoluyla metabolize ederken, karbaril parçalayan bakteriler salisilik asidi gentisat yoluyla metabolize etmeyi tercih eder.
Naftalensülfonik asit/disülfonik asit ve naftilaminsülfonik asit türevleri, azo boyaları, ıslatıcı maddeler, dağıtıcılar vb. üretiminde ara madde olarak kullanılabilir. Bu bileşiklerin insanlara karşı toksisitesi düşük olsa da, sitotoksisite değerlendirmeleri balıklar, daphnia ve algler için ölümcül olduklarını göstermiştir (Greim vd., 1994). Pseudomonas cinsinin temsilcilerinin (A3, C22 suşları), sülfonik asit grubunu içeren aromatik halkanın çift hidroksilasyonu ile metabolizmayı başlatarak bir dihidrodiol oluşturduğu ve bunun da sülfit grubunun kendiliğinden ayrılmasıyla 1,2-dihidroksinaftaline dönüştürüldüğü bildirilmiştir (Brilon vd., 1981). Ortaya çıkan 1,2-dihidroksinaftalin, klasik naftalin yoluyla, yani katekol veya gentisat yoluyla katabolize edilir (Şekil 4). Aminonaftalensülfonik asit ve hidroksinaftalensülfonik asidin, tamamlayıcı katabolik yollara sahip karışık bakteri toplulukları tarafından tamamen parçalanabildiği gösterilmiştir (Nortemann vd., 1986). Topluluk üyelerinden birinin aminonaftalensülfonik asit veya hidroksinaftalensülfonik asidi 1,2-dioksijenasyon yoluyla kükürt giderme işlemine tabi tuttuğu, aminosalisilat veya hidroksisalisilatın ise kültür ortamına son aşama metaboliti olarak salındığı ve daha sonra topluluk üyelerinin diğer üyeleri tarafından alındığı gösterilmiştir. Naftalendisülfonik asit nispeten polar ancak biyolojik olarak parçalanması zor olduğundan farklı yollarla metabolize edilebilir. İlk kükürt giderme işlemi, aromatik halka ve sülfonik asit grubunun rejiyoselektif dihidroksilasyonu sırasında gerçekleşir; İkinci kükürt giderme işlemi, salisilik asit 5-hidroksilaz tarafından 5-sülfosalisilik asidin hidroksilasyonu sırasında gentisik asit oluşumuyla gerçekleşir ve bu da merkezi karbon yoluna girer (Brilon vd., 1981) (Şekil 4). Naftalin bozunmasından sorumlu enzimler aynı zamanda naftalin sülfonat metabolizmasından da sorumludur (Brilon vd., 1981; Keck vd., 2006).
Şekil 4. Naftalin sülfonatın parçalanmasına yönelik metabolik yollar. Dairelerin içindeki sayılar, Şekil 3'te açıklanan enzimlere benzer/aynı olan, naftil sülfonat metabolizmasından sorumlu enzimleri temsil etmektedir.
Düşük molekül ağırlıklı PAH'lar (LMW-PAH'lar) indirgenebilir, hidrofobik ve az çözünür olduklarından doğal bozunmaya/parçalanmaya karşı hassas değildirler. Bununla birlikte, aerobik mikroorganizmalar moleküler oksijen (O2) emerek bunları oksitleyebilirler. Bu enzimler esas olarak oksidoredüktazlar sınıfına aittir ve aromatik halka hidroksilasyonu (mono- veya dihidroksilasyon), dehidrojenasyon ve aromatik halka kırılması gibi çeşitli reaksiyonlar gerçekleştirebilirler. Bu reaksiyonlardan elde edilen ürünler daha yüksek bir oksidasyon durumundadır ve merkezi karbon yoluyla daha kolay metabolize edilirler (Phale vd., 2020). Bozunma yolundaki enzimlerin indüklenebilir olduğu bildirilmiştir. Hücreler glikoz veya organik asitler gibi basit karbon kaynakları üzerinde yetiştirildiğinde bu enzimlerin aktivitesi çok düşük veya ihmal edilebilir düzeydedir. Tablo 3, naftalin ve türevlerinin metabolizmasında yer alan çeşitli enzimleri (oksijenazlar, hidrolazlar, dehidrojenazlar, oksidazlar vb.) özetlemektedir.
Tablo 3. Naftalin ve türevlerinin parçalanmasından sorumlu enzimlerin biyokimyasal özellikleri.
Radyoizotop çalışmaları (18O2), moleküler O2'nin oksijenazlar tarafından aromatik halkalara dahil edilmesinin, bir bileşiğin daha ileri biyolojik bozunmasını aktive etmede en önemli adım olduğunu göstermiştir (Hayaishi vd., 1955; Mason vd., 1955). Moleküler oksijenden (O2) bir oksijen atomunun (O) substrata dahil edilmesi, endojen veya eksojen monooksijenazlar (hidroksilazlar olarak da adlandırılır) tarafından başlatılır. Diğer bir oksijen atomu suya indirgenir. Eksojen monooksijenazlar flavini NADH veya NADPH ile indirgerken, endomonooksijenazlarda flavin substrat tarafından indirgenir. Hidroksilasyonun pozisyonu, ürün oluşumunda çeşitliliğe yol açar. Örneğin, salisilat 1-hidroksilaz, salisilik asidi C1 pozisyonunda hidroksile ederek katekol oluşturur. Öte yandan, çok bileşenli salisilat 5-hidroksilaz (redüktaz, ferredoksin ve oksijenaz alt birimlerini içerir), salisilik asidi C5 pozisyonunda hidroksile ederek gentisik asit oluşturur (Yamamoto ve ark., 1965).
Dioksijenazlar, substrata iki O2 atomu ekler. Oluşan ürünlere bağlı olarak, halka hidroksilleyici dioksijenazlar ve halka kırıcı dioksijenazlar olarak ikiye ayrılırlar. Halka hidroksilleyici dioksijenazlar, aromatik substratları cis-dihidrodiollere (örneğin, naftalin) dönüştürür ve bakteriler arasında yaygındır. Bugüne kadar, halka hidroksilleyici dioksijenaz içeren organizmaların çeşitli aromatik karbon kaynakları üzerinde büyüyebildiği gösterilmiştir ve bu enzimler NDO (naftalin), toluen dioksijenaz (TDO, toluen) ve bifenil dioksijenaz (BPDO, bifenil) olarak sınıflandırılır. Hem NDO hem de BPDO, çeşitli polisiklik aromatik hidrokarbonların (toluen, nitrotoluen, ksilen, etilbenzen, naftalin, bifenil, fluoren, indol, metilnaftalin, naftalensülfonat, fenantren, antrasen, asetofenon, vb.) çift oksidasyonunu ve yan zincir hidroksilasyonunu katalize edebilir (Boyd ve Sheldrake, 1998; Phale vd., 2020). NDO, bir oksidoredüktaz, bir ferredoksin ve aktif bölge içeren bir oksijenaz bileşeninden oluşan çok bileşenli bir sistemdir (Gibson ve Subramanian, 1984; Resnick vd., 1996). NDO'nun katalitik birimi, α3β3 konfigürasyonunda düzenlenmiş büyük bir α alt birimi ve küçük bir β alt biriminden oluşur. NDO, geniş bir oksijenaz ailesine aittir ve α-alt birimi, bir Rieske bölgesi [2Fe-2S] ve NDO'nun substrat özgüllüğünü belirleyen tek çekirdekli, hem içermeyen bir demir içerir (Parales vd., 1998). Tipik olarak, bir katalitik döngüde, piridin nükleotidinin indirgenmesinden gelen iki elektron, bir redüktaz, bir ferredoksin ve bir Rieske bölgesi yoluyla aktif bölgedeki Fe(II) iyonuna aktarılır. İndirgeyici eşdeğerler, substrat dihidroksilasyonu için ön koşul olan moleküler oksijeni aktive eder (Ferraro vd., 2005). Bugüne kadar, farklı suşlardan yalnızca birkaç NDO saflaştırılmış ve ayrıntılı olarak karakterize edilmiş ve naftalin bozunmasında yer alan yolların genetik kontrolü ayrıntılı olarak incelenmiştir (Resnick vd., 1996; Parales vd., 1998; Karlsson vd., 2003). Halka kıran dioksijenazlar (endo- veya orto-halka kıran enzimler ve ekzodiol- veya meta-halka kıran enzimler), hidroksillenmiş aromatik bileşikler üzerinde etki gösterir. Örneğin, orto-halka kıran dioksijenaz katekol-1,2-dioksijenaz iken, meta-halka kıran dioksijenaz katekol-2,3-dioksijenazdır (Kojima vd., 1961; Nozaki vd., 1968). Çeşitli oksijenazlara ek olarak, aromatik dihidrodiollerin, alkollerin ve aldehitlerin dehidrojenasyonundan sorumlu ve elektron alıcısı olarak NAD+/NADP+ kullanan çeşitli dehidrojenazlar da vardır; bunlar metabolizmada yer alan önemli enzimlerden bazılarıdır (Gibson ve Subramanian, 1984; Shaw ve Harayama, 1990; Fahle vd., 2020).
Hidrolazlar (esterazlar, amidazlar) gibi enzimler, kovalent bağları kırmak için su kullanan ve geniş substrat özgüllüğü gösteren ikinci önemli enzim sınıfını oluşturur. Karbaril hidrolaz ve diğer hidrolazlar, Gram-negatif bakterilerin üyelerinde periplazmanın (transmembran) bileşenleri olarak kabul edilir (Kamini vd., 2018). Karbaril hem amid hem de ester bağına sahiptir; bu nedenle, 1-naftol oluşturmak için esteraz veya amidaz tarafından hidrolize edilebilir. Rhizobium rhizobium suşu AC10023 ve Arthrobacter suşu RC100'deki karbarilin sırasıyla esteraz ve amidaz olarak işlev gördüğü bildirilmiştir. Arthrobacter suşu RC100'deki karbaril ayrıca amidaz olarak da işlev görür. RC100'ün karbaril, metomil, mefenamik asit ve XMC gibi dört N-metilkarbamat sınıfı insektisiti hidrolize ettiği gösterilmiştir (Hayaatsu vd., 2001). Pseudomonas sp. C5pp'deki CH'nin karbaril (%100 aktivite) ve 1-naftil asetat (%36 aktivite) üzerinde etkili olduğu, ancak 1-naftilasetamid üzerinde etkili olmadığı, bunun da bir esteraz olduğunu gösterdiği bildirilmiştir (Trivedi vd., 2016).
Biyokimyasal çalışmalar, enzim düzenleme kalıpları ve genetik analizler, naftalin bozunma genlerinin iki indüklenebilir düzenleyici birim veya "operon"dan oluştuğunu göstermiştir: nah ("yukarı akış yolu", naftalini salisilik aside dönüştürür) ve sal ("aşağı akış yolu", salisilik asidi katekol yoluyla merkezi karbon yoluna dönüştürür). Salisilik asit ve analogları indükleyici olarak işlev görebilir (Shamsuzzaman ve Barnsley, 1974). Glikoz veya organik asitlerin varlığında operon baskılanır. Şekil 5, naftalin bozunmasının (operon formunda) tam genetik organizasyonunu göstermektedir. Nah geninin (ndo/pah/dox) çeşitli adlandırılmış varyantları/formları tanımlanmış ve tüm Pseudomonas türleri arasında yüksek sekans homolojisine (%90) sahip oldukları bulunmuştur (Abbasian vd., 2016). Naftalin yukarı akış yolunun genleri, Şekil 5A'da gösterildiği gibi genel olarak ortak bir düzende düzenlenmiştir. Naftalin metabolizmasında rol oynadığı bildirilen ve genellikle nahC ve nahE arasında yer alan bir diğer gen olan nahQ'nun da işlevi henüz aydınlatılmamıştır. Benzer şekilde, naftaline duyarlı kemotaksiden sorumlu olan nahY geni, bazı üyelerde nah operonunun distal ucunda bulunmuştur. Ralstonia sp.'de, glutatyon S-transferazı (gsh) kodlayan U2 geninin nahAa ve nahAb arasında yer aldığı ancak naftalin kullanım özelliklerini etkilemediği bulunmuştur (Zylstra vd., 1997).
Şekil 5. Bakteri türleri arasında naftalin bozunumu sırasında gözlemlenen genetik organizasyon ve çeşitlilik; (A) Üst naftalin yolu, naftalinin salisilik aside metabolizması; (B) Alt naftalin yolu, salisilik asidin katekol yoluyla merkezi karbon yoluna; (C) salisilik asidin gentisat yoluyla merkezi karbon yoluna.
“Alt yol” (sal operonu) tipik olarak nahGTHINLMOKJ'den oluşur ve katekol metaring parçalanma yoluyla salisilatı pirüvat ve asetaldehite dönüştürür. Salisilat hidroksilazı kodlayan nahG geninin operonun proksimal ucunda korunduğu bulunmuştur (Şekil 5B). Diğer naftalin parçalayan suşlarla karşılaştırıldığında, P. putida CSV86'da nah ve sal operonları ardışık ve çok yakından ilişkilidir (yaklaşık 7,5 kb). Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 ve P. putida AK5 gibi bazı Gram-negatif bakterilerde naftalin, gentisat yoluyla (sgp/nag operonu şeklinde) merkezi bir karbon metaboliti olarak metabolize edilir. Gen kaseti tipik olarak nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI biçiminde temsil edilir; burada nagR (LysR tipi bir düzenleyiciyi kodlayan) üst uçta yer alır (Şekil 5C).
Karbaril, 1-naftol, 1,2-dihidroksinaftalin, salisilik asit ve gentisik asidin metabolizması yoluyla merkezi karbon döngüsüne girer (Şekil 3). Genetik ve metabolik çalışmalara dayanarak, bu yolun "yukarı akış" (karbarilin salisilik aside dönüşümü), "orta akış" (salisilik asidin gentisik aside dönüşümü) ve "aşağı akış" (gentisik asidin merkezi karbon yolu ara ürünlerine dönüşümü) olmak üzere üç bölüme ayrılması önerilmiştir (Singh vd., 2013). C5pp'nin (süperkontig A, 76,3 kb) genomik analizi, mcbACBDEF geninin karbarilin salisilik aside dönüşümünde, ardından mcbIJKL geninin salisilik asidin gentisik aside dönüşümünde ve mcbOQP geninin gentisik asidin merkezi karbon ara ürünlerine (fumarat ve piruvat, Trivedi vd., 2016) dönüşümünde rol oynadığını ortaya koymuştur (Şekil 6).
Aromatik hidrokarbonların (naftalin ve salisilik asit dahil) parçalanmasında rol alan enzimlerin, ilgili bileşikler tarafından indüklenebildiği ve glikoz veya organik asitler gibi basit karbon kaynakları tarafından inhibe edilebildiği bildirilmiştir (Shingler, 2003; Phale vd., 2019, 2020). Naftalin ve türevlerinin çeşitli metabolik yolları arasında, naftalin ve karbarilin düzenleyici özellikleri bir ölçüde incelenmiştir. Naftalin için, hem yukarı akış hem de aşağı akış yollarındaki genler, LysR tipi trans-etkili pozitif bir düzenleyici olan NahR tarafından düzenlenir. Bu, salisilik asit tarafından nah geninin indüklenmesi ve ardından yüksek düzeyde ekspresyonu için gereklidir (Yen ve Gunsalus, 1982). Ayrıca, yapılan çalışmalar, entegratif konak faktörünün (IHF) ve XylR'nin (sigma 54'e bağımlı transkripsiyonel düzenleyici) naftalin metabolizmasındaki genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için de kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir (Ramos vd., 1997). Çalışmalar, katekol meta-halka açma yolunun enzimlerinin, yani katekol 2,3-dioksigenazın, naftalin ve/veya salisilik asit varlığında indüklendiğini göstermiştir (Basu vd., 2006). Çalışmalar, katekol orto-halka açma yolunun enzimlerinin, yani katekol 1,2-dioksigenazın, benzoik asit ve cis,cis-mukonat varlığında indüklendiğini göstermiştir (Parsek vd., 1994; Tover vd., 2001).
C5pp suşunda, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR ve mcbS olmak üzere beş gen, karbaril bozunmasını kontrol etmekten sorumlu LysR/TetR transkripsiyonel düzenleyici ailesine ait düzenleyicileri kodlar. Homolog gen mcbG'nin, Burkholderia RP00725'te fenantren metabolizmasında rol alan LysR tipi düzenleyici PhnS ile en yakın ilişkili olduğu bulunmuştur (%58 amino asit özdeşliği) (Trivedi vd., 2016). mcbH geninin ara yolakta (salisilik asidin gentisik aside dönüşümü) rol aldığı ve Pseudomonas ve Burkholderia'da LysR tipi transkripsiyonel düzenleyici NagR/DntR/NahR'ye ait olduğu bulunmuştur. Bu ailenin üyelerinin, bozunma genlerinin indüksiyonu için spesifik bir efektör molekülü olarak salisilik asidi tanıdığı bildirilmiştir. Öte yandan, LysR ve TetR tipi transkripsiyonel düzenleyicilere ait üç gen olan mcbN, mcbR ve mcbS, aşağı akış yolunda (gentisat-merkezi karbon yolu metabolitleri) tanımlandı.
Prokaryotlarda, plazmitler, transpozonlar, profajlar, genomik adalar ve entegratif konjugatif elementler (ICE) yoluyla gerçekleşen yatay gen transferi süreçleri (edinme, değişim veya transfer), bakteriyel genomlardaki esnekliğin başlıca nedenlerindendir ve belirli fonksiyonların/özelliklerin kazanılmasına veya kaybedilmesine yol açar. Bu, bakterilerin farklı çevresel koşullara hızla uyum sağlamasına olanak tanır ve aromatik bileşiklerin parçalanması gibi konakçıya potansiyel adaptif metabolik avantajlar sağlar. Metabolik değişiklikler genellikle, daha geniş bir yelpazedeki aromatik bileşiklerin parçalanmasını kolaylaştıran parçalanma operonlarının, düzenleyici mekanizmalarının ve enzim özgüllüklerinin ince ayarlanması yoluyla elde edilir (Nojiri vd., 2004; Phale vd., 2019, 2020). Naftalin parçalanması için gen kasetlerinin, plazmitler (konjugatif ve konjugatif olmayan), transpozonlar, genomlar, ICE'ler ve farklı bakteri türlerinin kombinasyonları gibi çeşitli hareketli elementler üzerinde bulunduğu tespit edilmiştir (Şekil 5). Pseudomonas G7'de, NAH7 plazmidinin nah ve sal operonları aynı yönde transkribe edilir ve mobilizasyon için transpozaz Tn4653 gerektiren kusurlu bir transpozonun parçasıdır (Sota vd., 2006). Pseudomonas NCIB9816-4 suşunda, gen, konjugatif pDTG1 plazmidinde, zıt yönlerde transkribe edilen iki operon (yaklaşık 15 kb arayla) olarak bulunmuştur (Dennis ve Zylstra, 2004). Pseudomonas putida AK5 suşunda, konjugatif olmayan pAK5 plazmidi, gentisat yoluyla naftalin bozunmasından sorumlu enzimi kodlar (Izmalkova vd., 2013). Pseudomonas PMD-1 suşunda nah operonu kromozomda, sal operonu ise konjugatif plazmid pMWD-1'de yer almaktadır (Zuniga vd., 1981). Bununla birlikte, Pseudomonas stutzeri AN10'da tüm naftalin bozunma genleri (nah ve sal operonları) kromozomda yer almaktadır ve muhtemelen transpozisyon, rekombinasyon ve yeniden düzenleme olayları yoluyla alınmaktadır (Bosch vd., 2000). Pseudomonas sp. CSV86'da ise nah ve sal operonları genomda ICE (ICECSV86) şeklinde yer almaktadır. Yapı, tRNAGly tarafından korunmaktadır ve bunu takiben rekombinasyon/bağlanma bölgelerini (attR ve attL) gösteren doğrudan tekrarlar ve tRNAGly'nin her iki ucunda bulunan faj benzeri bir integrase yer almaktadır; bu nedenle yapısal olarak ICEclc elementine (klorokatekol bozunumu için Pseudomonas knackmusii'deki ICEclcB13) benzerdir. ICE üzerindeki genlerin son derece düşük bir aktarım sıklığıyla (10-8) konjugasyon yoluyla aktarılabildiği ve böylece bozunma özelliklerinin alıcıya aktarılabildiği bildirilmiştir (Basu ve Phale, 2008; Phale vd., 2019).
Karbaril bozunmasından sorumlu genlerin çoğu plazmitler üzerinde yer almaktadır. Arthrobacter sp. RC100, iki konjugatif plazmit olan pRC1 ve pRC2'nin karbarili gentisata dönüştüren enzimleri kodladığı üç plazmit (pRC1, pRC2 ve pRC300) içerir. Öte yandan, gentisatın merkezi karbon metabolitlerine dönüştürülmesinde rol alan enzimler kromozom üzerinde yer almaktadır (Hayaatsu vd., 1999). Karbarili 1-naftole dönüştürmek için kullanılan Rhizobium cinsi bakterilerden AC100 suşu, Tnceh transpozonunun bir parçası olarak CH'yi kodlayan cehA genini, ekleme elemanı benzeri diziler (istA ve istB) ile çevrili olarak taşıyan pAC200 plazmitini içerir (Hashimoto vd., 2002). Sphingomonas CF06 suşunda, karbaril bozunma geninin beş plazmitte bulunduğu düşünülmektedir: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 ve pCF05. Bu plazmitlerin DNA homolojisi yüksektir ve bu da bir gen duplikasyon olayının varlığını göstermektedir (Feng vd., 1997). İki Pseudomonas türünden oluşan karbaril bozunan bir simbiyontta, 50581 suşu, mcd karbaril hidrolaz genini kodlayan konjugatif bir plazmit olan pCD1'i (50 kb) içerirken, 50552 suşundaki konjugatif plazmit 1-naftol bozunan bir enzimi kodlamaktadır (Chapalamadugu ve Chaudhry, 1991). Achromobacter WM111 suşunda, mcd furadan hidrolaz geni 100 kb'lık bir plazmitte (pPDL11) yer almaktadır. Bu genin, farklı coğrafi bölgelerden farklı bakterilerde farklı plazmitlerde (100, 105, 115 veya 124 kb) bulunduğu gösterilmiştir (Parekh vd., 1995). Pseudomonas sp. C5pp'de, karbaril bozunmasından sorumlu tüm genler, 76,3 kb'lık bir sekansı kapsayan bir genomda yer almaktadır (Trivedi vd., 2016). Genom analizi (6,15 Mb), 42 MGE ve 36 GEI'nin varlığını ortaya koymuştur; bunlardan 17 MGE, ortalama asimetrik G+C içeriği (%54-60 mol) ile süperkontig A'da (76,3 kb) yer almaktadır ve olası yatay gen transferi olaylarını düşündürmektedir (Trivedi vd., 2016). P. putida XWY-1, karbaril parçalayan genlerin benzer bir dizilimini sergiler, ancak bu genler bir plazmit üzerinde bulunur (Zhu ve ark., 2019).
Mikroorganizmalar, biyokimyasal ve genomik düzeylerdeki metabolik verimliliğe ek olarak, kemotaksis, hücre yüzeyi modifikasyon özellikleri, bölümlendirme, tercihli kullanım, biyosürfaktan üretimi vb. gibi diğer özellikler veya tepkiler de sergilerler; bu özellikler, kirlenmiş ortamlarda aromatik kirleticileri daha verimli bir şekilde metabolize etmelerine yardımcı olur (Şekil 7).
Şekil 7. Yabancı kirletici bileşiklerin verimli biyolojik bozunumu için ideal aromatik hidrokarbon bozucu bakterilerin farklı hücresel yanıt stratejileri.
Kemotaktik tepkiler, heterojen kirlenmiş ekosistemlerde organik kirleticilerin bozunmasını artıran faktörler olarak kabul edilir. (2002) yılında yapılan bir çalışma, Pseudomonas sp. G7'nin naftaline karşı kemotaksisinin, su sistemlerinde naftalin bozunma hızını artırdığını göstermiştir. Vahşi tip G7 suşu, kemotaksi eksikliği olan mutant suştan çok daha hızlı bir şekilde naftalini bozmuştur. NahY proteini (membran topolojisine sahip 538 amino asit), NAH7 plazmidinde metaparçalanma yolu genleriyle birlikte transkribe edilmiş ve kemotaksi transdüserleri gibi, bu proteinin de naftalin bozunması için bir kemoreseptör olarak işlev gördüğü bulunmuştur (Grimm ve Harwood 1997). Hansel ve ark. (2009) tarafından yapılan başka bir çalışma, proteinin kemotaktik olduğunu, ancak bozunma hızının yüksek olduğunu göstermiştir. (2011) yılında yapılan bir çalışma, Pseudomonas (P. putida)'nın gaz halindeki naftaline karşı kemotaktik bir tepki gösterdiğini ortaya koymuştur; bu tepkide gaz fazı difüzyonu, hücrelere sürekli bir naftalin akışına neden olmuş ve hücrelerin kemotaktik tepkisini kontrol etmiştir. Araştırmacılar, bu kemotaktik davranışı, bozunma hızını artıracak mikroplar tasarlamak için kullanmışlardır. Çalışmalar, kemoduyusal yolların hücre bölünmesi, hücre döngüsü düzenlemesi ve biyofilm oluşumu gibi diğer hücresel işlevleri de düzenlediğini ve böylece bozunma hızını kontrol etmeye yardımcı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bu özelliği (kemotaksi) verimli bozunma için kullanmak çeşitli darboğazlarla engellenmektedir. Başlıca engeller şunlardır: (a) farklı paralog reseptörler aynı bileşikleri/ligandları tanır; (b) alternatif reseptörlerin varlığı, yani enerjik tropizm; (c) aynı reseptör ailesinin duyusal alanlarında önemli sekans farklılıkları; ve (d) başlıca bakteriyel sensör proteinleri hakkında bilgi eksikliği (Ortega vd., 2017; Martin-Mora vd., 2018). Bazen, aromatik hidrokarbonların biyolojik bozunması, bir bakteri grubu için kemotaktik, diğerleri için ise itici olabilen birden fazla metabolit/ara ürün üretir ve bu da süreci daha da karmaşıklaştırır. Ligandların (aromatik hidrokarbonlar) kimyasal reseptörlerle etkileşimlerini belirlemek için, Pseudomonas putida ve Escherichia coli'nin sensör ve sinyal alanlarını birleştirerek, sırasıyla aromatik asitler, TCA ara ürünleri ve naftalin reseptörlerini hedefleyen hibrit sensör proteinleri (PcaY, McfR ve NahY) oluşturduk (Luu vd., 2019).
Naftalin ve diğer polisiklik aromatik hidrokarbonların (PAH'lar) etkisi altında, bakteri zarının yapısı ve mikroorganizmaların bütünlüğü önemli ölçüde değişir. Çalışmalar, naftalinin hidrofobik etkileşimler yoluyla asil zincirinin etkileşimine müdahale ederek zarın şişmesini ve akışkanlığını artırdığını göstermiştir (Sikkema vd., 1995). Bu zararlı etkiyi ortadan kaldırmak için bakteriler, izo/anteizo dallı zincirli yağ asitleri arasındaki oranı ve yağ asidi bileşimini değiştirerek ve cis-doymamış yağ asitlerini karşılık gelen trans-izomerlere dönüştürerek zar akışkanlığını düzenler (Heipieper ve de Bont, 1994). Naftalin uygulamasıyla yetiştirilen Pseudomonas stutzeri'de doymuş/doymamış yağ asidi oranı 1,1'den 2,1'e yükselirken, Pseudomonas JS150'de bu oran 7,5'ten 12,0'ye yükselmiştir (Mrozik vd., 2004). Naftalin üzerinde yetiştirildiğinde, Achromobacter KAs 3–5 hücreleri naftalin kristalleri etrafında hücre kümelenmesi ve hücre yüzey yükünde azalma ( -22,5'ten -2,5 mV'ye) gösterdi; bu durum sitoplazmik yoğunlaşma ve vakuolizasyonla birlikte hücre yapısında ve hücre yüzey özelliklerinde değişikliklere işaret etmektedir (Mohapatra vd., 2019). Hücresel/yüzey değişiklikleri aromatik kirleticilerin daha iyi alınmasıyla doğrudan ilişkili olsa da, ilgili biyomühendislik stratejileri henüz tam olarak optimize edilmemiştir. Hücre şeklinin manipülasyonu, biyolojik süreçleri optimize etmek için nadiren kullanılmıştır (Volke ve Nikel, 2018). Hücre bölünmesini etkileyen genlerin silinmesi, hücre morfolojisinde değişikliklere neden olur. Bacillus subtilis'te, hücre septumu proteini SepF'nin septum oluşumunda rol oynadığı ve hücre bölünmesinin sonraki adımları için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak bu temel bir gen değildir. Bacillus subtilis'te peptit glikan hidrolazları kodlayan genlerin silinmesi, hücre uzamasına, özgül büyüme hızının artmasına ve enzim üretim kapasitesinin iyileşmesine yol açmıştır (Cui ve ark., 2018).
Karbaril bozunma yolunun bölümlere ayrılması, Pseudomonas C5pp ve C7 suşlarının verimli bir şekilde bozunmasını sağlamak için önerilmiştir (Kamini vd., 2018). Karbarilin, dış zar septumu ve/veya difüzyon yapabilen porinler yoluyla periplazmik alana taşındığı öne sürülmektedir. CH, karbarilin daha kararlı, daha hidrofobik ve daha toksik olan 1-naftol'e hidrolizini katalize eden periplazmik bir enzimdir. CH, periplazmada lokalizedir ve karbarile düşük bir afiniteye sahiptir, böylece 1-naftol oluşumunu kontrol ederek hücrelerde birikmesini önler ve hücrelere olan toksisitesini azaltır (Kamini vd., 2018). Oluşan 1-naftol, bölme ve/veya difüzyon yoluyla iç zar boyunca sitoplazmaya taşınır ve daha sonra merkezi karbon yolunda daha ileri metabolizma için yüksek afiniteli 1NH enzimi tarafından 1,2-dihidroksinaftaline hidroksillenir.
Mikroorganizmalar, yabancı karbon kaynaklarını parçalama konusunda genetik ve metabolik yeteneklere sahip olsalar da, bunların kullanımındaki hiyerarşik yapı (yani, karmaşık karbon kaynaklarına kıyasla basit karbon kaynaklarının tercihli kullanımı) biyolojik bozunmanın önündeki en büyük engeldir. Basit karbon kaynaklarının varlığı ve kullanımı, PAH'lar gibi karmaşık/tercih edilmeyen karbon kaynaklarını parçalayan enzimleri kodlayan genleri aşağı yönlü düzenler. İyi incelenmiş bir örnek, glikoz ve laktozun Escherichia coli'ye birlikte verildiğinde, glikozun laktozdan daha verimli kullanılmasıdır (Jacob ve Monod, 1965). Pseudomonas'ın çeşitli PAH'ları ve yabancı bileşikleri karbon kaynağı olarak parçaladığı bildirilmiştir. Pseudomonas'ta karbon kaynağı kullanımının hiyerarşisi organik asitler > glikoz > aromatik bileşiklerdir (Hylemon ve Phibbs, 1972; Collier vd., 1996). Ancak bir istisna vardır. İlginç bir şekilde, Pseudomonas sp. CSV86, glikoz yerine aromatik hidrokarbonları (benzoik asit, naftalin vb.) tercihli olarak kullanan ve aromatik hidrokarbonları organik asitlerle birlikte metabolize eden benzersiz bir hiyerarşik yapı sergiler (Basu vd., 2006). Bu bakteride, glikoz veya organik asitler gibi ikinci bir karbon kaynağının varlığında bile aromatik hidrokarbonların parçalanması ve taşınmasına ilişkin genler aşağı regüle edilmez. Glikoz ve aromatik hidrokarbon ortamında yetiştirildiğinde, glikoz taşınması ve metabolizmasına ilişkin genlerin aşağı regüle edildiği, aromatik hidrokarbonların ilk log fazında, glikozun ise ikinci log fazında kullanıldığı gözlemlenmiştir (Basu vd., 2006; Choudhary vd., 2017). Öte yandan, organik asitlerin varlığı aromatik hidrokarbon metabolizmasının ifadesini etkilemediğinden, bu bakterinin biyolojik bozunma çalışmaları için aday bir suş olması beklenmektedir (Phale vd., 2020).
Hidrokarbon biyotransformasyonunun mikroorganizmalarda oksidatif strese ve antioksidan enzimlerin yukarı regülasyonuna neden olabileceği iyi bilinmektedir. Hem durağan faz hücrelerinde hem de toksik bileşiklerin varlığında naftalinin verimsiz biyobozunması, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumuna yol açar (Kang vd. 2006). Naftalini parçalayan enzimler demir-kükürt kümeleri içerdiğinden, oksidatif stres altında, hemdeki demir ve demir-kükürt proteinleri oksitlenerek protein inaktivasyonuna yol açar. Ferredoksin-NADP+ redüktaz (Fpr), süperoksit dismutaz (SOD) ile birlikte, NADP+/NADPH ile iki molekül ferredoksin veya flavodoksin arasında tersinir redoks reaksiyonuna aracılık ederek, ROS'u temizler ve oksidatif stres altında demir-kükürt merkezini geri kazandırır (Li vd. 2006). Pseudomonas'ta hem Fpr hem de SodA'nın (SOD) oksidatif stresle indüklenebildiği ve naftalin ilaveli koşullar altında büyüme sırasında dört Pseudomonas suşunda (O1, W1, As1 ve G1) artan SOD ve katalaz aktivitelerinin gözlemlendiği bildirilmiştir (Kang vd., 2006). Çalışmalar, askorbik asit veya demir (Fe2+) gibi antioksidanların eklenmesinin naftalin ortamında büyüme hızını artırabileceğini göstermiştir. Rhodococcus erythropolis naftalin ortamında büyüdüğünde, sodA (Fe/Mn süperoksit dismutaz), sodC (Cu/Zn süperoksit dismutaz) ve recA dahil olmak üzere oksidatif stresle ilgili sitokrom P450 genlerinin transkripsiyonu artmıştır (Sazykin vd., 2019). Naftalin içinde kültürlenen Pseudomonas hücrelerinin karşılaştırmalı kantitatif proteomik analizi, oksidatif stres tepkisiyle ilişkili çeşitli proteinlerin yukarı regülasyonunun bir stresle başa çıkma stratejisi olduğunu göstermiştir (Herbst ve ark., 2013).
Mikroorganizmaların, hidrofobik karbon kaynaklarının etkisi altında biyosürfaktanlar ürettiği bildirilmiştir. Bu sürfaktanlar, yağ-su veya hava-su arayüzlerinde agregatlar oluşturabilen amfifilik yüzey aktif bileşiklerdir. Bu durum, sözde çözünmeyi teşvik eder ve aromatik hidrokarbonların adsorpsiyonunu kolaylaştırarak verimli biyolojik bozunmaya yol açar (Rahman vd., 2002). Bu özelliklerinden dolayı, biyosürfaktanlar çeşitli endüstrilerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bakteriyel kültürlere kimyasal sürfaktanların veya biyosürfaktanların eklenmesi, hidrokarbon bozunmasının verimliliğini ve hızını artırabilir. Biyosürfaktanlar arasında, Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen ramnolipidler kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve karakterize edilmiştir (Hisatsuka vd., 1971; Rahman vd., 2002). Ek olarak, diğer biyosürfaktan türleri arasında lipopeptitler (Pseudomonas fluorescens'ten müsinler), emülgatör 378 (Pseudomonas fluorescens'ten) (Rosenberg ve Ron, 1999), Rhodococcus'tan trehaloz disakkarit lipitleri (Ramdahl, 1985), Bacillus'tan likenin (Saraswathy ve Hallberg, 2002) ve Bacillus subtilis'ten (Siegmund ve Wagner, 1991) ve Bacillus amyloliquefaciens'ten (Zhi vd., 2017) sürfaktanlar yer almaktadır. Bu güçlü sürfaktanların yüzey gerilimini 72 dyn/cm'den 30 dyn/cm'nin altına düşürdüğü ve böylece hidrokarbon emilimini iyileştirdiği gösterilmiştir. Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia ve diğer bakteri türlerinin naftalin ve metilnaftalin ortamlarında yetiştirildiklerinde çeşitli ramnolipid ve glikolipid bazlı biyosürfaktanlar üretebildikleri bildirilmiştir (Kanga vd., 1997; Puntus vd., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89, naftoik asit gibi aromatik bileşikler üzerinde yetiştirildiğinde hücre dışı biyosürfaktan Biosur-Pm üretebilir (Phale vd., 1995). Biosur-Pm oluşumunun kinetiği, sentezinin büyüme ve pH'a bağlı bir süreç olduğunu göstermiştir. Nötr pH'da hücreler tarafından üretilen Biosur-Pm miktarının pH 8,5'tekinden daha yüksek olduğu bulunmuştur. pH 8,5'te yetiştirilen hücreler, pH 7,0'da yetiştirilen hücrelere göre daha hidrofobik ve aromatik ve alifatik bileşiklere daha yüksek afiniteye sahipti. Rhodococcus türlerinde... N6 suşu, daha yüksek karbon/azot (C:N) oranı ve demir sınırlaması, hücre dışı biyosürfaktanların üretimi için en uygun koşullardır (Mutalik vd., 2008). Suşların ve fermantasyonun optimize edilmesi yoluyla biyosürfaktanların (sürfaktinlerin) biyosentezini iyileştirme girişimleri yapılmıştır. Bununla birlikte, kültür ortamındaki sürfaktan titresi düşüktür (1,0 g/L), bu da büyük ölçekli üretim için bir zorluk teşkil etmektedir (Jiao vd., 2017; Wu vd., 2019). Bu nedenle, biyosentezini iyileştirmek için genetik mühendislik yöntemleri kullanılmıştır. Ancak, operonun büyük boyutu (∼25 kb) ve quorum sensing sisteminin karmaşık biyosentetik düzenlemesi nedeniyle mühendislik modifikasyonu zordur (Jiao vd., 2017; Wu vd., 2019). Bacillus bakterilerinde, esas olarak promotörün (srfA operonu) değiştirilmesi, surfaktin ihracat proteini YerP'nin ve düzenleyici faktörler ComX ve PhrC'nin aşırı ekspresyonu yoluyla surfaktin üretimini artırmayı amaçlayan bir dizi genetik mühendislik modifikasyonu gerçekleştirilmiştir (Jiao vd., 2017). Bununla birlikte, bu genetik mühendislik yöntemleri yalnızca bir veya birkaç genetik modifikasyona ulaşmış ve henüz ticari üretime geçmemiştir. Bu nedenle, bilgiye dayalı optimizasyon yöntemlerinin daha fazla incelenmesi gereklidir.
PAH biyolojik bozunma çalışmaları çoğunlukla standart laboratuvar koşullarında yürütülmektedir. Bununla birlikte, kirlenmiş alanlarda veya kirlenmiş ortamlarda, birçok abiyotik ve biyotik faktörün (sıcaklık, pH, oksijen, besin bulunabilirliği, substrat biyoyararlılığı, diğer ksenobiyotikler, son ürün inhibisyonu vb.) mikroorganizmaların bozunma kapasitesini değiştirdiği ve etkilediği gösterilmiştir.
Sıcaklık, PAH biyolojik bozunumu üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Sıcaklık arttıkça çözünmüş oksijen konsantrasyonu azalır; bu da aerobik mikroorganizmaların metabolizmasını etkiler, çünkü bu mikroorganizmalar hidroksilasyon veya halka kırılma reaksiyonlarını gerçekleştiren oksijenazlar için substratlardan biri olarak moleküler oksijene ihtiyaç duyarlar. Yüksek sıcaklığın, ana PAH'ları daha toksik bileşiklere dönüştürdüğü ve böylece biyolojik bozunumu engellediği sıklıkla belirtilmektedir (Muller vd., 1998).
PAH ile kirlenmiş birçok alanın, asitli maden suyuyla kirlenmiş alanlar (pH 1-4) ve alkali sızıntı suyuyla kirlenmiş doğal gaz/kömür gazlaştırma alanları (pH 8-12) gibi aşırı pH değerlerine sahip olduğu gözlemlenmiştir. Bu koşullar biyolojik bozunma sürecini ciddi şekilde etkileyebilir. Bu nedenle, biyolojik iyileştirme için mikroorganizmalar kullanılmadan önce, alkali topraklar için amonyum sülfat veya amonyum nitrat gibi uygun kimyasallar (orta ila çok düşük oksidasyon-indirgeme potansiyeline sahip) eklenerek veya asidik alanlar için kalsiyum karbonat veya magnezyum karbonat ile kireçleme yapılarak pH'ın ayarlanması önerilir (Bowlen vd. 1995; Gupta ve Sar 2020).
Etkilenen bölgeye oksijen sağlanması, PAH biyolojik bozunumu için hız sınırlayıcı faktördür. Ortamın redoks koşulları nedeniyle, yerinde biyolojik iyileştirme süreçleri genellikle dış kaynaklardan oksijen verilmesini gerektirir (toprak işleme, hava püskürtme ve kimyasal ilave) (Pardieck vd., 1992). Odenkranz vd. (1996), kirlenmiş bir akifere magnezyum peroksit (oksijen salan bir bileşik) eklenmesinin BTEX bileşiklerini etkili bir şekilde biyolojik olarak iyileştirebileceğini göstermiştir. Başka bir çalışma, etkili biyolojik iyileştirme sağlamak için sodyum nitrat enjekte ederek ve ekstraksiyon kuyuları oluşturarak kirlenmiş bir akiferde fenol ve BTEX'in yerinde bozunmasını araştırmıştır (Bewley ve Webb, 2001).