Mevcut†Güncel adres: OX11 0DE, Birleşik Krallık, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Birleşik Krallık, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektronik Biyolojik Görüntüleme Merkezi.
Reaksiyon merkezi ışık toplama kompleksi 1 (RC-LH1), mor fototrofik bakterilerin temel fotosentetik bileşenidir. Rhodopseudomonas palustris'ten RC-LH1 kompleksinin iki kriyoelektron mikroskopi yapısını tanıttık. RC-LH114-W kompleksinin 2,65 Å çözünürlüğündeki yapısı, RC'yi çevreleyen ve W proteini tarafından kesintiye uğratılan 14 alt birimli LH1 döngüsünden oluşurken, W proteini içermeyen kompleks tamamen RC bileşiminden oluşur ve RC ile çevrilidir. Kapalı 16 alt birimli LH1 döngüsü. Bu yapıların karşılaştırılması, RC-LH1 kompleksindeki kinonun dinamikleri hakkında, kinonun RC QB bölgesinde bağlanması sırasında daha önce belirlenmemiş konformasyonel değişiklikler ve kinonun RC'ye geçişine yardımcı olan yardımcı kinon bağlanma bölgelerinin konumu da dahil olmak üzere bilgiler sağlamaktadır. W proteininin eşsiz yapısı, LH1 döngüsünün kapanmasını engeller ve böylece kinon/kinolon değişimini hızlandıran bir kanal oluşturur.
Fotosentez tarafından sağlanan enerji, yeryüzündeki neredeyse tüm yaşamı sürdürebilir ve güneş biyoteknolojisi için büyük bir potansiyele sahiptir. Küresel fotosentezi teşvik ederken, mor fototrofik bakteriler de çeşitli enerji modları ve metabolik yetenekler sergiler. Fotosentezden kaçınabilir ve karanlıkta heterotrofik bakteri olarak büyüyebilir, azot ve karbondioksiti sabitleyebilir, hidrojen üretebilir ve aromatik bileşikleri parçalayabilir (1-3). Bu süreçler için enerji sağlamak amacıyla, ışığın hızlı ve verimli bir şekilde kimyasal enerjiye dönüştürülmesi gerekir. Bu süreç, ışık yakalayan anten kompleksi ışığı emdiğinde ve yakalanan enerjiyi reaksiyon merkezine (RC) aktardığında başlar, böylece yük ayrışması başlar (4-7). Mor fototrofik bakterilerde fotosentezin temel birimi, ışık toplama kompleksi 1 (LH1) ile çevrili tip 2 RC'den oluşur ve RC-LH1 çekirdek kompleksini oluşturur. LH1, her biri iki bakteri klorofil (BChl) a molekülü ve bir veya iki karotenoid bağlayan kavisli αβ heterodimer dizisinden oluşur (8-12). En basit LH1 anteni, RC'yi (9-13) kapalı bir döngüde çevreleyen 16 veya 17 αβ heterodimerinden oluşur, ancak diğer çekirdek komplekslerinde, transmembran peptitler çevreleyen LH1'in sürekliliğini kesintiye uğratır, böylece RC ve sitokrom bc1 kompleksi arasında kinol/kinon difüzyonunu teşvik eder (11, 13-15). Mor fototrofik bitki Rhodopseudomonas (Rps.), fotosentezi destekleyen enerji ve elektron transferini anlayabilen bir model organizmadır. Rps.'nin ilk kristal yapısı. Palustris RC-LH1 kompleksinin modeli, 15 heterodimerik LH1 döngüsüyle çevrili RC'dir ve bu döngüler "Protein W" adı verilen bilinmeyen bir protein tarafından kesintiye uğratılır (14). Protein-W daha sonra, üç tahmini transmembran helise (TMH) sahip, karakterize edilmemiş 10,5 kDa'lık bir protein olan RPA4402 olarak tanımlanmıştır (16). Protein W'yi kodlayan rpa4402 geninin adını, RC-L, M (pufL, pufM) ve LH1α, β (pufA, pufB) alt birimlerini kodlayan genler için kullanılan isimlendirmeyle tutarlı olması için pufW olarak değiştirmeyi öneriyoruz. İlginç bir şekilde, protein W, RC-LH1'in yalnızca yaklaşık %10'unda bulunur ve bu da Rps. palustris'in iki farklı RC-LH1 kompleksi ürettiğini ortaya koymaktadır. Burada, biri protein W ve 14 αβ heterodimeri içeren, diğeri protein W içermeyen ve kapalı 16 heterodimer LH1 döngüsüne sahip iki çekirdek kompleksinin yüksek çözünürlüklü kriyoelektron mikroskopi (kriyo-EM) yapılarını rapor ediyoruz. Yapımız, Rps. palustris'in RC-LH1 kompleksinin anlaşılmasında bir adım değişikliğini temsil etmektedir, çünkü her varyantın homojen popülasyonunu analiz ettik ve her peptidi, bağlı pigmentleri, ilgili lipitleri ve kinonları açıkça belirlemek için yeterli çözünürlüğe sahibiz. Bu yapıların karşılaştırılması, daha önce hiçbir RC-LH1 kompleksinde bulunmayan üç TMH proteini-W'nin, kinon/kinolon değişimini hızlandırmak için bir kinon kanalı oluşturduğunu göstermektedir. Birçok korunmuş lipit ve kinon bağlanma bölgesi tanımlanmış olup, kinon ve RC'nin birleşmesinden sonra oksijenli fototrofik organizmaların fotosistem II (PSII) RC'si için uygun olabilecek yeni bir konformasyonel değişiklik ortaya çıkarılmıştır. Bulgularımız, mor fototrofik bakterilerin RC-LH1 çekirdek kompleksindeki kinon/kinolon bağlanma ve değişim kinetiğine dair yeni bilgiler sağlamaktadır.
Rps. palustris'te bulunan iki kompleksin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini kolaylaştırmak için, her bir RC-LH1'i biyokimyasal yöntemlerle izole ediyoruz. Protein W eksikliği olan kompleks (bundan sonra ΔpufW olarak anılacaktır), pufW geninden yoksun suştan saflaştırıldı (16) ve yalnızca bir RC-LH1 kompleksi üretilebiliyor. Protein W içeren kompleks bir suş tarafından üretiliyor. Bu suşun protein W'si, C-terminalinde 10x His etiketi ile modifiye edilmiştir, böylece protein W içeren kompleks, metal immobilizasyonu yoluyla protein W eksikliği olan çoğuyla etkili bir şekilde birleştirilebilir. Kompleks etkili bir şekilde ayrıştırılır (16) Afinite Kromatografisi (IMAC).
Şekil 1'de gösterildiği gibi, her iki kompleks de bir LH1 anteniyle çevrili üç alt birimli bir RC (RC-L, RC-M ve RC-H) içerir. Protein-W içermeyen kompleksin 2,80 Å'lik yapısı, RC'yi tamamen çevreleyen kapalı bir LH1 döngüsü oluşturan 16 αβ heterodimeri göstermektedir ve bundan sonra RC-LH116 kompleksi olarak adlandırılacaktır. Protein-W içeren kompleksin 2,65 Å'lik yapısı, protein-W tarafından kesintiye uğratılan 14 heterodimerli bir LH1'e sahiptir ve bundan sonra RC-LH114-W olarak adlandırılacaktır.
(A ve B) Bileşiğin yüzey temsili. (C ve D) Çubuklar halinde ifade edilen bağlı pigmentler. (E ve F) Sitoplazmik yüzeyden gözlemlenen kompleksler, peptidleri ve LH1 alt birimlerini karikatürler halinde temsil eder ve protein-W boşluğundan saat yönünde numaralandırılır [Rba numaralandırmasıyla tutarlı. sphaeroides kompleksi (13)]. LH1-α için protein alt biriminin rengi sarıdır; LH1-β için protein alt biriminin rengi mavidir; protein-W için protein kırmızıdır; RC-H için camgöbeğidir; RC-L için turuncudur; RC-M için macentadır. Kofaktörler çubuklarla temsil edilir, yeşil BChl ve BPh a moleküllerini, mor karotenoidleri ve sarı UQ10 moleküllerini temsil eder. (G ve H) RC-LH114-W kompleksi (G) ve RC-LH116 kompleksi (H) eşdeğer bölgesindeki protein-W boşluğunun büyütülmüş görünümü. Kofaktörler uzay doldurma şeklinde gösterilmiştir, şelatlı kinon mavi renkte gösterilmiştir. Protein-W boşluğu (G)'de mavi kesikli çizgiyle, kinon/kinololün LH116 halkası üzerinde yayıldığı küçük delikler ise (H)'de siyah kesikli çizgiyle vurgulanmıştır.
Şekil 1 (A ve B), her biri iki BChl ve bir karotenoid bağlayan açık veya kapalı LH1αβ heterodimer dizileriyle çevrili RC'yi göstermektedir (Şekil 1, C ve D). Önceki çalışmalar, Rps'nin LH1 kompleksi olduğunu göstermiştir. Spirulina ksantin biyosentez yolunda, bu türler karışık karotenoid popülasyonları içerir (17). Bununla birlikte, spiropirroxanthin baskın karotenoiddir ve yoğunluğu tatmin edicidir. Bu nedenle, tüm LH1 bağlanma bölgelerinde spiroxanthini modellemeyi seçtik. Alfa ve beta polipeptitleri, kısa membran dış bölgelerine sahip tek TMH'lerdir (Şekil 1, A, B, E ve F). C-terminalde 17 kalıntının yoğunluğu gözlemlenmemesine rağmen, alfa polipeptit her iki komplekste de Met1'den Ala46'ya kadar kesilmiştir. β polipeptidi, RC-LH116'da Gly4'ten Tyr52'ye ve RC-LH114-W'de Ser5'ten Tyr52'ye indirgenmiştir. 3 veya 4 N-terminal veya 13 C-terminal kalıntısının yoğunluğu gözlenmemiştir (Şekil S1). Vahşi tip suşundan hazırlanan karışık RC-LH1 kompleksinin kütle spektrometresi analizi, eksik bölgenin bu peptitlerin heterolog kesiminin sonucu olduğunu göstermiştir (Şekil S1 ve S2). α-Met1'in N-terminal formilasyonu da gözlenmiştir (f). Analiz, α-peptidin fMet1'den Asp42/Ala46/Ala47/Ala50'ye kadar olan kalıntılardan ve β-peptidin Ser2'den Ala53'e kadar olan kalıntılardan oluştuğunu göstermiştir; bu da düşük sıcaklık EM yoğunluk haritasıyla iyi bir uyum içindedir.
α-His29 ve β-His36'nın koordinasyonu, BChl'leri yüz yüze getirir; her αβ heterodimeri, komşularıyla birleşerek RC çevresinde açık bir döngü (RC-LH114-W) veya kapalı bir döngü (RC-LH116) oluşturur (Şekil 1, C ve D). RC-LH114-W'nin 877 nm bandıyla karşılaştırıldığında, RC-LH116'nın 880 nm absorpsiyonunda 3 nm'lik bir kırmızı kayma vardır (Şekil 2A). Bununla birlikte, dairesel dikroizm spektrumu neredeyse aynıdır (Şekil 2B), bu da açık ve kapalı döngüler arasında belirgin bir fark olmasına rağmen, BChl'lerin yerel ortamının çok benzer olduğunu gösterir. Absorpsiyon kırmızıya kayması, kapalı döngüde azalan termal hareket ve artan kararlılığın (18, 19), kapalı döngünün neden olduğu pigment bağlantısındaki değişimin (20, 21) veya bu iki etkinin bir kombinasyonunun (11) sonucu olabilir.
(A) Tepe noktaları karşılık gelen pigmentlerle işaretlenmiş ve 775 nm'deki BPh tepe noktasına göre normalize edilmiş ultraviyole/görünür/yakın kızılötesi absorpsiyon spektrumu. (B) 805 nm'deki BChl absorbansına göre normalize edilmiş dairesel dikroizm spektrumu. (C ve D) RC-LH114-W kompleksinin (C) ve RC-LH116 kompleksinin (D) zamana bağlı absorpsiyon spektrumlarından seçilmiş ΔA spektrumları. Daha iyi karşılaştırılabilirlik için, tüm spektrumlar 0,2 ps'de −A'nın ∆A'sına göre normalize edilmiştir. (E) Çeşitli UQ2 konsantrasyonlarının varlığında ışınlamadan sonra sitokrom c2 oksidasyon hızı (ham veriler için Şekil S8'e bakınız). (F) Düşük, orta veya yüksek yoğunluklu ışık altında (sırasıyla 10, 30 veya 300 μMm-2 s-1) yetiştirilen hücrelerde, saflaştırılmış kompleksteki protein W ve RC-L alt birimleri ile ayrılmış membran oranı belirlenir. Protein seviyesi, SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ve immünolojik test ile belirlenir (ham veriler için Şekil S9'a bakınız). Oran, saflaştırılmış RC-LH114-W kompleksine göre belirlenir. Kompleksin RC-L'nin protein-W'ye stokiyometrik oranı 1:1'dir.
RC-LH114-W'nin deforme olmuş αβ14 döngüsündeki 1. pozisyondaki BChl'ler (Şekil 1, A, C ve E), RC-LH116'daki eşdeğer BChl'lerden (Şekil 1, B, D ve F ve Şekil S3) 6,8 Å daha yakın bir mesafede RC birincil donörüne (P) yakındır; ancak, iki kompleksin geçici absorpsiyon kinetiği, RC-LH114-W ve RC-LH116 için LH1'den RC'ye uyarım enerjisi transfer zaman sabitlerinin sırasıyla 40 ±4 ve 44 ±3 ps olduğunu göstermektedir (Şekil 2, C ve D, Şekil S4 ve Tablo S2). RC içindeki elektronik transferde de önemli bir fark yoktur (Şekil S5 ve ilgili ek metin). LH1 ve RC-P arasındaki enerji transfer zamanının yakın benzerliğinin, iki LH1 döngüsündeki çoğu BChl'nin benzer mesafesi, açısı ve potansiyel enerjisinden kaynaklandığını düşünüyoruz. Minimum mesafeye ulaşmak için LH1 enerji modelini keşfetmenin, optimum olmayan bölgelerden RC'ye doğrudan enerji transferinden daha hızlı olmadığı görülüyor. RC-LH114-W'deki açık döngülü LH1 halkası, yapısal analiz için düşük sıcaklık koşullarında önemsiz termal harekete de uğrayabilir ve RC 1 pozisyonundaki βBChl'lerin pigmentasyon mesafesinden oda sıcaklığında daha uzun bir αβ14 halka konformasyonu vardır.
RC-LH116 kompleksi 32 BChl ve 16 karotenoid içerir ve genel düzenlemesi, Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Veri Bankası (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 suşu (PDB ID 7C9R) (12) ve yeşil alglerden (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) elde edilenlerle aynıdır. Hizalamadan sonra, özellikle 1-5, 15 ve 16'da αβ heterodimerlerinin pozisyonlarında yalnızca küçük sapmalar gözlemlendi (Şekil S6). Protein-W'nin varlığı, LH1'in yapısı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Üç TMH'si kısa halkalarla bağlanır; N-terminali kompleksin lümen tarafında, C-terminali ise sitoplazmik taraftadır (Şekil 1A ve 3, A ila D). Protein-W büyük ölçüde hidrofobiktir (Şekil 3B) ve TMH2 ve TMH3, LH1αβ-14 ile etkileşime girerek bir transmembran yüzey oluşturur (Şekil 3, B ve E-G). Arayüz, esas olarak transmembran bölgesindeki Phe, Leu ve Val kalıntılarından oluşur. Bu kalıntılar, hidrofobik amino asitler ve αβ-14 pigmentleri ile istiflenmiştir. Bazı polar kalıntılar da etkileşime katkıda bulunur; bunlar arasında kompleks boşluğunun yüzeyindeki W-Thr68 ve β-Trp42 arasındaki hidrojen bağı da bulunur (Şekil 3, F ve G). Sitoplazmanın yüzeyinde, Gln34, αβ-14 karotenoidlerinin keto grubuna bitişiktir. Ek olarak, n-dodesil β-d-maltosit (β-DDM) molekülü çözümlenmiştir ve hidrofobik kuyruğu protein-W ve αβ-14 arasındaki arayüze uzanır ve lipid kuyruğu gövdede yer alabilir. Ayrıca, protein W ve RCH'nin C-terminal çözünürlük bölgelerinin birbirine çok yakın olduğunu, ancak spesifik etkileşimler oluşturma kapsamına girmediğini fark ettik (Şekil 1, A ve E). Bununla birlikte, bu iki proteinin çözümlenmemiş C-terminal amino asitlerinde etkileşimler olabilir ve bu da RC-LH114-W kompleksinin oluşumu sırasında protein-W'nin toplanması için bir mekanizma sağlayabilir.
(A) Karikatür şeklinde LH1αβ14 ile arayüze bakan Protein-W, elektrostatik potansiyel diyagramının bir bölümünde (0,13 kontur seviyesine sahip şeffaf gri yüzey) gösterilen çubuk şeklinde bir yan zincire (kırmızı) sahiptir. (B) Hidrofobik renkli bir yüzeyle temsil edilen Protein-W. Polar ve yüklü alanlar camgöbeği, hidrofobik alanlar beyaz ve güçlü hidrofobik alanlar turuncu renkte gösterilmiştir. (C ve D) Karikatür şeklinde temsil edilen Protein-W, yönü (A)'dakiyle aynıdır (C) ve 180° döndürülmüştür (D). Dizideki konuma göre, ayırt edilebilir kalıntılar, N-terminali mavi ve C-terminali kırmızı olmak üzere gökkuşağı renk şemasını benimser. (E) (A)'dakiyle aynı görünümde Protein-W ve Protein-W:LH1 arayüzündeki kalıntılar, ekli işaretlere sahip çubuklarla temsil edilmiştir. (F) Protein-W, karikatür gösteriminde (E) ve LH1αβ14'e göre ve çubuk gösteriminde arayüz kalıntılarına göre 90° döndürülmüştür. Beta polipeptidinden sarkan kalıntılar etiketlenmiştir. Kofaktör, Şekil 1'in rengiyle eşleşen bir çubuk olarak gösterilmiştir, ayrıştırılmış β-DDM gri renkte ve oksijen kırmızı renkte gösterilmiştir. (G) (F)'deki görünüm 180° döndürülmüştür ve etiketlenmiş alfa polipeptidinin belirgin kalıntıları gösterilmiştir.
Protein-W, bir αβ heterodimerinin (Şekil 1F'deki 15. heterodimer) yerini alarak döngü kapanmasını engeller ve ilk üç αβ heterodimerini eğik hale getirir. Film normaline göre ilk αβ-1 heterodimerinin maksimum eğim açısının 25° ila 29° olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 1, A ve E), bu da RC A keskin kontrast-LH116'daki αβ-1'in 2° ila 8° eğimiyle oluşmuştur (Şekil 1, B ve F). İkinci ve üçüncü heterodimerler sırasıyla 12° ila 22° ve 5° ila 10° eğimlidir. RC'nin sterik engellemesi nedeniyle, αβ-1'in eğimi ikinci αβ çiftini (Şekil 1F'deki 16. αβ'ye karşılık gelir) içermez, böylece LH1 halkasında belirgin bir boşluk oluşur (Şekil 1, A ve E). İki αβ heterodimerinin yokluğu ve buna eşlik eden dört BChl ve iki karotenoidin kaybı nedeniyle, karotenoidlerin hiçbiri bükülmüş αβ-1 alt birimine bağlanmaz ve sonuç olarak 13 vejetaryen karotenoid ve 28 BChl içeren bir LH114-W halkası oluşur. αβ1 ila 7 bölgelerindeki iki kompleksin yerel çözünürlük tahminleri, LH1 döngüsünün geri kalanına göre daha düşüktür; bu da RC QB bölgesine bitişik LH1 alt biriminin doğal esnekliğini yansıtabilir (Şekil 4).
RC-LH114-W (A ve B) ve RC-LH116'nın (C ve D) resimleri, Şekil 1'deki aynı üstten/yandan görünüm (A ve B) (A ve C) ve boşluk yüzeyinden (B ve D) gösterilmiştir. Renkli anahtarlar sağda gösterilmiştir.
1:14 stokiyometrik oranına sahip diğer tek karakteristik çekirdek kompleksi, Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimeridir (13). Bununla birlikte, protein W ve PufX'in belirgin bir homolojisi yoktur ve ilgili LH1 yapıları üzerinde önemli bir etkiye sahiptirler. PufX, Rps. palustris LH116αβ-16'ya karşılık gelen bir pozisyonda RC-H alt biriminin sitoplazmik tarafıyla etkileşime giren N-terminal sitoplazmik bir alana sahip tek bir TMH'dir (13). PufX, RC-LH1 ve sitokrom bcl kompleksi arasında kinon/kinolon değişimi için bir kanal oluşturur ve tüm Rba. sphaeroides çekirdek komplekslerinde bulunur (13). Monomer-monomer arayüzü Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX dimer, RC-LH114-W'deki protein W'nin bağlanma pozisyonunda yer alır ve PufX ve protein-W tarafından oluşturulan boşluk eşdeğer bir pozisyondadır (Şekil S7A). RC-LH114-W'deki boşluk ayrıca, protein W veya PufX ile ilişkili olmayan peptitler tarafından oluşturulan Pseudomonas rosea LH1'in varsayımsal kinon kanalı (8) ile de hizalanmıştır (Şekil S7B). Ek olarak, bir γ alt biriminin (7) çıkarılmasıyla oluşturulan Blc. zümrüt yeşili LH1'deki kinon kanalı benzer bir pozisyonda yer almaktadır (Şekil S7C). Farklı proteinler tarafından aracılık edilmesine rağmen, bu kinon/kinolol kanallarının RC-LH1 kompleksinde ortak bir pozisyonda ortaya çıkması, protein W tarafından oluşturulan boşluğun bir kinon kanalı olarak işlev görebileceğini gösteren yakınsak evrimin bir örneği gibi görünmektedir.
LH114-W döngüsündeki boşluk, proteinlerde olduğu gibi iki alanı bir protein gözenek yoluyla bağlamak yerine, RC-LH114-W kompleksinin iç boşluğu ile ana membran arasında sürekli bir membran bölgesinin oluşmasına olanak tanır (Şekil 1G). RC-LH116 kompleksi, kapalı bir Tch. İğne benzeri komplekse (22) benzer (Şekil 1H). Kinonun membran boyunca difüzyonu, dar protein kanalı boyunca difüzyondan daha hızlı olduğundan, açık LH114-W döngüsü, kapalı LH116 döngüsüne göre daha hızlı RC dönüşümüne izin verebilir ve kinonun RC'ye difüzyonu daha kısıtlı olabilir. Protein W'nin kinonların RC yoluyla dönüşümünü etkileyip etkilemediğini test etmek için, belirli bir konsantrasyonda ubikinon 2 (UQ2) (daha kısa bir izopren kuyruğuna sahip doğal UQ10'un bir analoğu) üzerinde bir sitokrom oksidasyon deneyi gerçekleştirdik (Şekil 2E). Şelatlı kinonun varlığı, görünür Michaelis sabitinin doğru belirlenmesini engellese de (RC-LH114-W ve RC-LH116 sırasıyla 0,2±0,1 μM ve 0,5±0,2 μM için uygundur), RC-LH114-W'nin maksimum hızı (4,6±0,2 e-RC-1 s-1), RC-LH116'dan (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) %28±5 daha büyüktür.
Başlangıçta protein-W'nin çekirdek kompleksinin yaklaşık %10'unda bulunduğunu tahmin ettik (16); burada, düşük ışık, orta ışık ve yüksek ışık büyüme hücrelerinin doluluk oranları sırasıyla %15±0,6, %11±1 ve %0,9±0,5'tir (Şekil 2F). Kütle spektrometrisinin kantitatif karşılaştırması, histidin etiketinin eklenmesinin protein-W'nin nispi bolluğunu vahşi tip suşlara kıyasla azaltmadığını gösterdi (P = 0,59), bu nedenle bu seviyeler modifiye protein-W'nin bir artefaktı değildir (Şekil S10). Bununla birlikte, RC-LH1 kompleksindeki protein-W'nin bu düşük doluluk oranı, bazı RC'lerin hızlandırılmış bir oranda dönmesine izin vererek, RC-LH116 kompleksindeki daha yavaş kinon/kinolon değişimini hafifletebilir. Yüksek ışık işgal oranının, pufW gen ekspresyonunun güçlü ışık altında arttığını gösteren son transkriptomik verilerle tutarsız olduğunu fark ettik (Şekil S11) (23). pufW transkripsiyonu ile protein-W'nin RC-LH1 kompleksine dahil edilmesi arasındaki fark kafa karıştırıcıdır ve proteinin karmaşık düzenlemesini yansıtabilir.
RC-LH114-W'de 6 kardiyolipin (CDL), 7 fosfatidilkolin (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) ve 29 β-DDM molekülü yer almaktadır ve bunlar RC-LH116'da (Şekil 5, A ve B) modellenmiştir. Bu iki yapıda, CDL neredeyse kompleksin sitoplazmik tarafında yer alırken, POPC, POPG ve β-DDM çoğunlukla lüminal tarafta yer almaktadır. RC-LH114-W kompleksinin αβ-1 ila αβ-6 bölgesinde iki lipid ve deterjan molekülü izole edilmiştir (Şekil 5A) ve RC-LH116'nın eşdeğer bölgesinde beş molekül izole edilmiştir (Şekil 5B). Kompleksin diğer tarafında, esas olarak RC ve αβ-7 ila αβ-13 arasında biriken CDL olmak üzere daha fazla lipit bulundu (Şekil 5, A ve B). Yapısal olarak çözümlenmiş diğer lipitler ve deterjanlar LH1 halkasının dışında yer almaktadır ve iyi çözümlenmiş açil zincirleri, RC-LH114-W'de geçici olarak β-DDM olarak adlandırılan ve RC A'da β-DDM ve POPC-LH116 karışımı olarak tanımlanan LH1 alt birimleri arasında uzanmaktadır. Yapımızdaki şelatlayıcı lipitlerin ve deterjanların benzer pozisyonları, bunların fizyolojik olarak ilgili bağlanma bölgeleri olduğunu göstermektedir (Şekil S12A). Tch'deki eşdeğer moleküllerin pozisyonları da iyi bir tutarlılığa sahiptir. Gentle ve Trv. 970 RC-LH1 suşu (Şekil S12, B ila E) (9, 12) ve lipit baş grubunun hidrojen bağlayıcı kalıntıları, dizi hizalamasında oldukça iyi bir koruma gösterdi (Şekil S13), bu da RC'ye bağlanan Korunmuş CDL'nin (24) bu bölgelerin RC-LH1 kompleksinde korunabileceğini gösteriyor.
(A ve B) RC-LH114-W (A) ve RC-LH116 (B) peptitleri karikatürlerle, pigmentler ise Şekil 1'deki renk şeması kullanılarak çubuklarla gösterilmiştir. Lipidler kırmızı, deterjanlar ise gri renkte gösterilmiştir. RC QA ve QB bölgelerine bağlı UQ sarı, izole edilmiş UQ ise mavidir. (C ve D) (A) ve (B) ile aynı görünümler, lipidler çıkarılmıştır. (E ila G) RC-LH116'dan Q1(E), Q2(F) ve Q3(G)'nin birbirini etkileyen yan zincirleriyle büyütülmüş görünümü. Hidrojen bağları siyah kesikli çizgilerle gösterilmiştir.
RC-LH116'da, yük ayrışma sürecinde elektron transferine katılan hem RC QA hem de QB UQ, bağlanma bölgelerinde ayrışmaktadır. Bununla birlikte, RC-LH114-W'de QB kinon çözümlenmemiştir ve aşağıda ayrıntılı olarak ele alınacaktır. QA ve QB kinonlarına ek olarak, RC-LH114-W yapısında, iyi çözümlenmiş baş gruplarına (sırasıyla Q1 ve Q2'de yer almaktadır) göre iki şelatlı UQ molekülü (RC ve LH1 halkaları arasında yer almaktadır) atanmıştır (Şekil 5C). İki izopren birimi Q1'e atanmıştır ve yoğunluk haritası Q2'nin 10 izopren kuyruğunun tamamını çözmektedir. RC-LH116 yapısında, üç şelatlı UQ10 molekülü (Q1 ila Q3, Şekil 5D) çözümlenmiştir ve tüm moleküllerin kuyruk boyunca net bir yoğunluğu vardır (Şekil 5, D ila G). İki yapıda da Q1 ve Q2'nin kinon baş gruplarının pozisyonları mükemmel bir tutarlılığa sahiptir (Şekil S12F) ve yalnızca RC ile etkileşime girerler. Q1, RC-LH114-W'nin W boşluğunun girişinde yer alır (Şekil 1G ve 5, C, D ve E) ve Q2, QB bağlanma bölgesinin yakınında yer alır (Şekil 5, C, D ve F). Korunmuş L-Trp143 ve L-Trp269 kalıntıları Q1 ve Q2'ye çok yakındır ve potansiyel π-istifleme etkileşimleri sağlar (Şekil 5, E ve F ve Şekil S12). Q1'in distal oksijeninden 3,0 Å uzaklıktaki L-Gln88, güçlü bir hidrojen bağı sağlar (Şekil 5E); bu kalıntı, en uzak ilişki hariç tüm RC'lerde korunmuştur (Şekil S13). L-Ser91, diğer birçok RC'de Thr'nin yerine muhafazakar bir şekilde ikame edilmiştir (Şekil S13), Q1'in metil oksijeninden 3,8 Angstrom uzaklıktadır ve zayıf hidrojen bağları sağlayabilir (Şekil 5E). Q3'ün spesifik bir etkileşimi yok gibi görünmektedir, ancak RC-M alt birimi ile LH1-α alt birimi 5 ila 6 arasındaki hidrofobik bölgede yer almaktadır (Şekil 5, D ve G). Q1, Q2 ve Q3 veya yakındaki şelatlı kinonlar ayrıca Tch. Gentle, Trv. Strain 970 ve Blc.'de de çözümlenmiştir. İris yapısı (9, 10, 12), RC-LH1 kompleksinde korunmuş bir yardımcı kinon bağlanma bölgesine işaret etmektedir (Şekil S12G). RC-LH116'daki beş ayrışmış UQ, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile belirlenen her bir kompleksin 5,8±0,7 değeriyle iyi bir uyum içindeyken, RC-LH114-W'deki üç ayrışmış UQ, ölçülen 6,2±0,3 değerinden (Şekil S14) daha düşüktür ve bu da yapıda çözünmemiş UQ moleküllerinin olduğunu göstermektedir.
Sözde simetrik L ve M polipeptitlerinin her biri beş TMH içerir ve bir BChl dimerini, iki BChl monomerini, iki bakteriyofaj (BPh) monomerini ve bir Heme olmayan demiri ve bir veya iki UQ10 molekülünü birleştiren bir heterodimer oluşturur. Terminal keton grubundaki hidrojen bağlarının varlığı ve Rps'deki bilinen birikimi yoluyla, karotenoidler, cis-3,4-dehidroorhodopin olarak adlandırılan M alt birimine dahil edilir. Tür (25). RC-H'nin dış zar alanı, tek bir TMH ile zara bağlanır. Genel RC yapısı, ilgili türlerin (örneğin Rba) üç alt birimli RC'sine benzer. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl ve BPh'nin makro halkaları, karotenoid omurgası ve heme içermeyen demir, bu yapıların çözünürlük aralığı içinde örtüşmektedir; aynı şekilde QA bölgesindeki UQ10 baş grubu ve RC-LH116'daki QB kinonu da örtüşmektedir (Şekil S15).
Farklı QB bölgesi doluluk oranlarına sahip iki RC yapısının mevcudiyeti, QB kinon bağlanmasına eşlik eden tutarlı konformasyonel değişiklikleri incelemek için yeni bir fırsat sunmaktadır. RC-LH116 kompleksinde, QB kinon tamamen bağlı “proksimal” pozisyonda yer almaktadır (26), ancak RC-LH114-W'nin ayrılmasında QB kinon bulunmamaktadır. RC-LH114-W'de QB kinon bulunmaması şaşırtıcıdır çünkü kompleks, yapısal olarak çözümlenmiş QB kinonlu RC-LH116 kompleksinden daha aktiftir. İki LH1 halkası yaklaşık altı kinonu şelatlasa da, kapalı RC-LH116 halkasında beş tanesi yapısal olarak çözümlenmişken, açık RC-LH114-W halkasında sadece üç tanesi yapısal olarak sınırlıdır. Bu artan yapısal düzensizlik, RC-LH114-W QB bölgelerinin daha hızlı değiştirilmesini, kompleksteki daha hızlı kinon kinetiğini ve LH1 döngüsünü geçme olasılığının artmasını yansıtabilir. RC-LH114-W'nin RC QB bölgesinde UQ eksikliğinin, daha karmaşık ve daha aktif bir kompleksin sonucu olabileceğini ve RC-LH114-W'nin QB bölgesinin UQ dönüşümünde hemen dondurulduğunu (QB bölgesine girişin kapandığı aşama) ve bu aktivitenin konformasyonunu yansıttığını öne sürüyoruz.
QB olmadan, L-Phe217'nin UQ10 bağlanmasıyla uyumsuz bir konuma dönmesi, kuyruğun ilk izopren birimiyle uzamsal bir çarpışmaya neden olacağından, bu durum gözlemlenir (Şekil 6A). Ek olarak, özellikle L-Phe217'nin QB bağlanma cebine kaydığı ve L-Tyr223'ün döndüğü (Şekil 6A) heliks de (TMH D ve E arasındaki döngüdeki kısa heliks) olmak üzere, belirgin ana konformasyonel değişiklikler açıktır. Bu, M-Asp45 çerçevesiyle olan hidrojen bağını koparır ve QB bağlanma bölgesinin girişini kapatır (Şekil 6B). Heliks de tabanında döner, L-Ser209'un Cα'sı 0,33 Å kayarken, L-Val221Cα'sı 3,52 Å kayar. Her iki yapıda da üst üste çakışabilen TMH D ve E'de gözlemlenebilir bir değişiklik yoktur (Şekil 6A). Bildiğimiz kadarıyla, bu, doğal RC'de QB bölgesini kapatan ilk yapıdır. Tam (QB'ye bağlı) yapıyla yapılan bir karşılaştırma, kinonun indirgenmesinden önce, kinona girmesi için bir konformasyonel değişikliğin gerekli olduğunu göstermektedir. L-Phe217, kinon baş grubuyla bir π-istifleme etkileşimi oluşturmak üzere döner ve sarmal dışarı doğru kayarak L-Gly222 iskeletinin ve L-Tyr223 yan zincirinin kararlı bir hidrojen bağı yapısına sahip bir hidrojen bağı ağı oluşturmasına olanak tanır (Şekil 6, A ve C).
(A) Hologramın (L zinciri, turuncu/M zinciri, macenta) ve apo (gri) yapının üst üste binen karikatürü; burada anahtar kalıntılar çubuk benzeri bir gösterim şeklinde sergilenmektedir. UQ10 sarı bir çubukla temsil edilmektedir. Noktalı çizgi, tüm yapıda oluşan hidrojen bağlarını göstermektedir. (B ve C) Apolipoproteinin yüzey gösterimi ve tüm halka yapısı; sırasıyla L-Phe217'nin yan zincir oksijenini mavi ve L-Tyr223'ü kırmızı renkte vurgulamaktadır. L alt birimi turuncudur; M ve H alt birimleri renklendirilmemiştir. (D ve E) Apolipoprotein (D) ve tüm (E) RC QB bölgeleri [sırasıyla (A) ile renklendirilmiştir] ve Thermophilus thermophilus PSII (yeşil, plastik kinonlu mavi; PDB ID: 3WU2) Hizala (58).
Beklenmedik bir şekilde, LH1 içermeyen QB eksikliği olan RC'lerin çeşitli yapıları mevcut olmasına rağmen, bu çalışmada gözlemlenen konformasyonel değişiklikler daha önce bildirilmemiştir. Bunlar arasında Blc. viridis'ten (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum'dan (PDB ID: 1EYS) (28) ve Rba. sphaeroides'ten (PDB ID: 1OGV) (29) QB eksikliği yapısı yer almaktadır ve bunların tümü genel QB yapılarıyla neredeyse aynıdır. 3PRC'nin yakından incelenmesi, LDAO (Lauril Dimetil Amin Oksit) deterjan moleküllerinin QB pozisyonunun girişinde bağlandığını ve bunun kapalı bir konformasyona yeniden düzenlemeyi engelleyebileceğini ortaya koymuştur. LDAO, 1EYS veya 1OGV'de aynı pozisyonda parçalanmasa da, bu RC'ler aynı deterjan kullanılarak hazırlanmıştır ve bu nedenle aynı etkiyi gösterebilir. Rba. sphaeroides'in kristal yapısı... Sitokrom c2 ile birlikte kristalize edilmiş Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) de kapalı bir QB bölgesine sahip gibi görünüyor. Bununla birlikte, bu durumda, RC-M polipeptidinin N-terminal bölgesi (Q heliksindeki Tyr kalıntısının H bağı yoluyla QB bağlanma bölgesiyle etkileşime giren) doğal olmayan bir konformasyon benimser ve QB konformasyonel değişimi daha fazla araştırılmamıştır (30). Güven verici olan, RC-LH114-W yapısında M polipeptidinin bu tür bir deformasyonunu görmemiş olmamızdır; bu yapı, RC-LH116 RC'nin N-terminal bölgesiyle neredeyse aynıdır. Ayrıca, deterjan bazlı LH1 anteninin ortadan kaldırılmasından sonra, PDB'deki apolipoprotein RC'lerin çözümlendiği ve bu sayede RC ile çevreleyen LH1 halkasının iç yüzeyi arasındaki boşluktaki iç kinon havuzlarının ve lipidlerin ortadan kaldırıldığı da belirtilmelidir (31, 32). RC, parçalanabilir QB kinon hariç tüm kofaktörleri koruduğu için işlevsel kalır; bu kinon daha az kararlıdır ve genellikle hazırlık sürecinde kaybolur (33). Ek olarak, RC'den LH1 ve doğal siklik lipitlerin çıkarılmasının, yük ayrılmış P+QB durumunun ömrünün kısalması gibi işlevler üzerinde bir etkiye sahip olabileceği bilinmektedir (31, 34, 35). Bu nedenle, RC'yi çevreleyen yerel LH1 halkasının varlığının "kapalı" QB bölgesini koruyabileceğini ve böylece QB yakınındaki yerel ortamı koruyabileceğini tahmin ediyoruz.
Apolipoprotein (QB kinonu olmadan) ve tam yapı, bir dizi olaydan ziyade QB bölgesinin dönüşümünün yalnızca iki anlık görüntüsünü temsil etse de, bağlanmanın hidrokinonun yeniden bağlanmasını önlemek için kontrol edilebileceğine dair göstergeler vardır. Substrat inhibisyonunu engellemek için. Apolipoproteinin QB bölgesinin yakınındaki kinolol ve kinonun etkileşimi farklı olabilir ve bu da RC tarafından reddedilmesine yol açar. Konformasyonel değişikliklerin kinonların bağlanmasında ve indirgenmesinde rol oynadığı uzun zamandır öne sürülmüştür. Dondurulmuş RC'lerin karanlık adaptasyondan sonra kinonları indirgeme yeteneği bozulmuştur (36); X-ışını kristalografisi, bu hasarın QB kinonlarının aktif proksimal pozisyondan yaklaşık 4,5 Å uzaklıkta "distal" bir konformasyonda hapsolmasından kaynaklandığını göstermektedir (26), 37). Bu uzak bağlanma konformasyonunun, apolipoprotein ile tam halka yapısı arasındaki ara durumun bir anlık görüntüsü olduğunu ve kinon ile ilk etkileşimi ve QB bölgesinin açılmasını takip ettiğini öne sürüyoruz.
Belirli fototrofik bakterilerin ve siyanobakterilerin, alglerin ve bitkilerin PSII kompleksinde bulunan tip II RC, yapısal ve işlevsel olarak korunmuştur (38). Şekil 6'da (D ve E) gösterilen yapısal hizalama, PSII RC'leri ile bakteriyel RC kompleksinin QB bölgesi arasındaki benzerliği vurgulamaktadır. Bu karşılaştırma, kinon bağlanması ve indirgenmesinin yakından ilişkili sistemlerini incelemek için uzun zamandır bir model olmuştur. Önceki yayınlar, konformasyonel değişikliklerin kinonların PSII indirgenmesiyle birlikte gerçekleştiğini öne sürmüştür (39, 40). Bu nedenle, RC'nin evrimsel korunumu göz önüne alındığında, daha önce gözlemlenmemiş bu bağlanma mekanizması, oksijenli fototrofik bitkilerdeki PSII RC'nin QB bölgesine de uygulanabilir olabilir.
Rps ΔpufW (etiketsiz pufW delesyonu) ve PufW-His (doğal pufW lokusundan ifade edilen C-terminal 10x His etiketli protein-W) suşları. palustris CGA009 önceki çalışmamızda (16) tanımlanmıştır. Bu suşlar ve izojenik yabani tip ebeveyn, az sayıda hücrenin PYE (her biri 5 g litre -1) (LB'de -80 °C'de saklanan, %50 (a/h) gliserol içeren) agar [%1,5 (a/h)] plakasına yayılmasıyla dondurucudan geri kazanıldı. Plaka, anaerobik koşullar altında oda sıcaklığında karanlıkta bir gece boyunca inkübe edildi ve daha sonra tek bir koloni görünene kadar 3 ila 5 gün boyunca OSRAM 116-W halojen ampuller (RS Components, İngiltere) tarafından sağlanan beyaz ışıkla (~50 μmolm-2 s-1) aydınlatıldı. Tek bir koloni, %0,1 (a/h) kazein amino asitleri ile desteklenmiş 10 ml M22+ ortamına (41) aşılandı (bundan sonra M22 olarak anılacaktır). Kültür, 48 saat boyunca 180 rpm'de çalkalanarak 34°C'de karanlıkta düşük oksijen koşullarında yetiştirildi ve daha sonra kültürün 70 ml'si aynı koşullar altında 24 saat boyunca aşılandı. 1 ml hacimli yarı aerobik bir kültür, 30 ml'lik evrensel vidalı kapaklı şeffaf cam şişede 30 ml M22 ortamına aşılandı ve steril manyetik kuvvet karıştırma çubuğu ile 48 saat boyunca çalkalama (~50 μmol m-2 s-1) ile ışınlandı. Daha sonra, aynı koşullar altında yaklaşık 1 litre kültürle 30 ml kültür aşılandı ve bu kültür daha sonra 72 saat boyunca ~200 μmolm-2 s-1 ışık şiddetinde aydınlatılan yaklaşık 9 litre kültüre aşılandı. Hücreler 30 dakika boyunca 7132 RCF'de santrifüj edilerek toplandı, ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içinde süspanse edildi ve ihtiyaç duyulana kadar -20°C'de saklandı.
Çözülme işleminden sonra, yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücrelere bir miktar deoksiribonükleaz I kristali (Merck, İngiltere), lizozim (Merck, İngiltere) ve iki adet Roche holoenzim proteaz inhibitörü tableti (Merck, İngiltere) ekleyin. 20.000 psi'lik bir French basınç hücresinde (Aminco, ABD), hücreler 8 ila 12 kez parçalandı. 4°C'de 15 dakika boyunca 18.500 RCF'de santrifüjleme ile parçalanmamış hücreler ve çözünmeyen kalıntılar uzaklaştırıldıktan sonra, membran, pigmentli lizattan 43.000°C'de 2 saat boyunca 113.000 RCF'de santrifüjleme ile çöktürüldü. Çözünür fraksiyon atıldı ve renkli membran 100 ila 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve görünür agregat kalmayana kadar homojenize edildi. Süspansiyon halindeki membran, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, ABD) içeren %2 (a/h) β-DDM çözeltisinde, 4°C'de karanlıkta 1 saat boyunca hafifçe karıştırılarak inkübe edildi. Daha sonra, kalan çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmak için 70°C'de santrifüj edilerek 4°C'de 1 saat boyunca 150.000 RCF çözündürüldü.
ΔpufW suşundan elde edilen çözünme membranı, üç kolon hacmi (CV) bağlama tamponu [0.03% (a/h) β-DDM içeren 20 mM tris-HCl (pH 8.0)] ile 50 ml'lik bir DEAE Sepharose iyon değişim kolonuna uygulandı. Kolon iki CV bağlama tamponu ile yıkandı, ardından kolon 50 mM NaCl içeren iki bağlama tamponu ile yıkandı. RC-LH116 kompleksi, 1,75 CV'de 150 ila 300 mM NaCl (bağlama tamponunda) arasında doğrusal bir gradyan ile elüe edildi ve kalan bağlama kompleksi, 0,5 CV'de 300 mM NaCl içeren bir bağlama tamponu ile elüe edildi. 250 ile 1000 nm arasında absorbsiyon spektrumunu toplayın, 880 ile 280 nm arasında absorbans oranı (A880/A280) 1'den büyük olan fraksiyonu saklayın, bağlama tamponunda iki kez seyreltin ve saflaştırma için DEAE kolonunda aynı prosedürü tekrar uygulayın. A880/A280 oranları 1,7'den yüksek ve A880/A805 oranları 3,0'dan yüksek olan fraksiyonları seyreltin, üçüncü iyon değişim turunu gerçekleştirin ve A880/A280 oranları 2,2'den yüksek ve A880/A805 oranları 5,0'dan yüksek olan fraksiyonları saklayın. Kısmen saflaştırılmış kompleks, Amicon 100.000 moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj filtresinde (Merck, İngiltere) ~2 ml'ye konsantre edildi ve 200 mM NaCl tamponu içeren Superdex 200 16/600 boyut dışlama kolonuna (GE Healthcare, ABD) yüklendi ve ardından aynı tamponda 1,5 CV'de elüe edildi. Boyut dışlama fraksiyonunun absorbsiyon spektrumları toplandı ve A880/A280 oranları 2,4'ün üzerinde ve A880/A805 oranları 5,8'in üzerinde olan absorbsiyon spektrumları 100 A880'e konsantre edildi ve hemen kriyojenik TEM ızgara hazırlığı veya depolama için kullanıldı. İhtiyaç duyulana kadar -80°C'de muhafaza edildi.
PufW-His suşundan elde edilen çözünme membranı, 20 ml'lik bir HisPrep FF Ni-NTA Sepharose kolonuna (20 mM tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl ve %0,03 (a/a) içeren) IMAC tamponunda (GE Healthcare) uygulandı. v) β-DDM]. Kolon, beş CV IMAC tamponu ile ve ardından 10 mM histidin içeren beş CV IMAC tamponu ile yıkandı. Çekirdek kompleks, kolondan 100 mM histidin içeren beş IMAC tamponu ile elüe edildi. RC-LH114-W kompleksini içeren fraksiyon, Amicon 100.000 MWCO filtre (Merck, İngiltere) ile donatılmış karıştırmalı bir tankta ~10 ml'ye konsantre edildi, bağlama tamponu ile 20 kat seyreltildi ve ardından 25 ml'ye eklendi. DEAE Sepharose kolonunda, tampona bağlı dört CV önceden kullanıldı. Kolonu dört CV bağlama tamponuyla yıkayın, ardından kompleksi 0 ila 100 mM NaCl (bağlama tamponunda) doğrusal gradyanında sekiz CV üzerinde elüe edin ve kalan dört CV'yi 100 mM bağlama tamponu ile doldurun. Sodyum klorür ile birleştirilen ve A880/A280 oranı 2,4'ten yüksek ve A880/A805 oranı 4,6'dan yüksek olan kalıntı kompleksler, bir Amicon 100.000 MWCO santrifüj filtresinde ~2 ml'ye konsantre edildi ve önceden tamponla dengelenmiş Superdex 200 16/600 boyut dışlama kolonuna 1,5 CV IMAC ile dolduruldu ve ardından aynı tamponda 1,5 CV üzerinden elüe edildi. Boyut dışlama fraksiyonlarının absorbsiyon spektrumlarını toplayın ve A880/A280 oranları 2,1'in üzerinde ve A880/A805 oranları 4,6'nın üzerinde olan absorbsiyon spektrumlarını 100 A880'e yoğunlaştırın; bunlar hemen dondurulmuş TEM ızgarası hazırlığı için kullanılır veya ihtiyaç duyulana kadar -80°C'de saklanır.
Düşük sıcaklıkta TEM ızgaraları hazırlamak için bir Leica EM GP daldırma dondurucu kullanıldı. Kompleks, IMAC tamponunda A880 değeri 50 olacak şekilde seyreltildi ve ardından 5 μl'si yeni parlatılmış QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbon kaplı bakır ağa (Agar Scientific, İngiltere) yüklendi. Izgara 20°C ve %60 bağıl nemde 30 saniye inkübe edildi, ardından 3 saniye kurutuldu ve daha sonra -176°C'de sıvı etanda soğutuldu.
RC-LH114-W kompleksinin verileri, 300 kV hızlandırma voltajında, 130.000× nominal büyütme ve 20 eV enerji aralığında çalışan bir Titan Krios mikroskobu ile eBIC (Elektronik Biyogörüntüleme Merkezi) (British Diamond Light Source) üzerinde kaydedildi. Veri toplamak için sayım modunda görüntü kaydetmek üzere K2 tepe dedektörlü bir Gatan 968 GIF Quantum kullanıldı. Kalibre edilmiş piksel boyutu 1,048 Å ve doz hızı 3,83 e-Å-2s-1'dir. Film 11 saniyede toplandı ve 40 parçaya bölündü. Mikroskobu yeniden odaklamak için karbon kaplı alan kullanıldı ve ardından her delik için üç film toplandı. Toplamda, -1 ile -3 μm arasında odak dışı değerlere sahip 3130 film toplandı.
RC-LH116 kompleksine ait veriler, Asterbury Biyoyapı Laboratuvarı'nda (Leeds Üniversitesi, İngiltere) aynı mikroskop kullanılarak toplandı. Veriler, 130 k büyütme ile sayım modunda toplandı ve piksel boyutu 4,6 e-Å-2s-1 dozunda 1,065 Å olarak kalibre edildi. Film 12 saniyede kaydedildi ve 48 parçaya bölündü. Toplamda, -1 ile -3 μm arasında odak dışı değerlere sahip 3359 film toplandı.
Tüm veri işleme, Relion 3.0 işlem hattında (42) gerçekleştirilir. Doz ağırlıklandırması ile ışın hareketini düzeltmek için Motioncorr 2 (43) kullanılır ve ardından CTF (kontrast transfer fonksiyonu) parametresini belirlemek için CTFFIND 4.1 (44) kullanılır. Bu ilk işleme aşamalarından sonraki tipik fotomikrograflar Şekil 2.S16'da gösterilmiştir. Otomatik seçim şablonu, 250 piksellik bir çerçevede 1000 parçacığın yaklaşık 250 pikselinin manuel olarak seçilmesi ve referans iki boyutlu (2D) sınıflandırmanın olmamasıyla oluşturulur; böylece örnek kirlenmesi olan veya ayırt edilebilir özelliklere sahip olmayan sınıflandırmalar reddedilir. Daha sonra, tüm mikrofotograflar üzerinde otomatik seçim gerçekleştirildi ve RC-LH114-W 849.359 parçacık, RC-LH116 kompleksi ise 476.547 parçacık olarak belirlendi. Seçilen tüm parçacıklar, referanssız 2B sınıflandırmanın iki turundan geçmiştir ve her çalıştırmadan sonra, karbon alanı, numune kirliliği, belirgin özellik göstermeyen veya güçlü şekilde örtüşen parçacıklar reddedilmiştir. Sonuç olarak, RC-LH114-W ve RC-LH116'nın 3B sınıflandırması için sırasıyla 772.033 (%90,9) ve 359.678 (%75,5) parçacık kullanılmıştır. İlk 3B referans modeli, stokastik gradyan iniş yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur. İlk model referans alınarak, seçilen parçacıklar 3B'de dört kategoriye ayrılmıştır. Bu kategorideki model referans alınarak, en büyük kategorideki parçacıklar üzerinde 3B iyileştirme yapılmış, ardından çözücü alanını kaplamak için ilk 15Å alçak geçiş filtresi kullanılmış, 6 piksel yumuşak kenar eklenmiş ve üst dedektörün Gatan K2 tepe modülasyon transfer fonksiyonunu düzeltmek için pikseller sonradan işlenmiştir. RC-LH114-W veri seti için, bu başlangıç ​​modeli, maskenin kenarlarındaki güçlü yoğunluğun (UCSF Chimera'daki çekirdek kompleks yoğunluğundan ayrılmış) kaldırılmasıyla değiştirildi. Elde edilen modeller (RC-LH114-W ve RC-LH116'nın çözünürlükleri sırasıyla 3,91 ve 4,16 Å'dir) ikinci tur 3D sınıflandırma için referans olarak kullanıldı. Kullanılan parçacıklar, başlangıç ​​3D sınıfına gruplandırıldı ve komşulukla güçlü bir korelasyon içermiyor. Örtüşme veya belirgin yapısal özelliklerin eksikliği söz konusu. İkinci tur 3D sınıflandırmadan sonra, en yüksek çözünürlüğe sahip kategori seçildi [RC-LH114-W için bir kategori 377.703 parçacıktan (%44,5), RC-LH116 için ise toplam 260.752 parçacıktan (%54,7) oluşan iki kategori bulunmaktadır; bunlar yalnızca başlangıçtaki döndürmeden sonra hizalandığında küçük bir farkla aynıdır]. Seçilen parçacıklar 400 piksellik bir kutuda yeniden çıkarılır ve 3B iyileştirme ile rafine edilir. Çözücü maskesi, başlangıçtaki 15 Å alçak geçiş filtresi, 3 piksellik harita genişletmesi ve 3 piksellik yumuşak maske kullanılarak oluşturulur. Parçacık başına CTF iyileştirmesi, parçacık başına hareket düzeltmesi ve ikinci tur parçacık başına CTF iyileştirmesi, 3B iyileştirme, çözücü maskeleme ve son işlem, elde edilen dokuyu daha da iyileştirmek için her adımdan sonra gerçekleştirilir. 0,143'lük FSC (Fourier Kabuk Korelasyon Katsayısı) kesme değeri kullanılarak, RC-LH114-W ve RC-LH116'nın nihai modellerinin çözünürlükleri sırasıyla 2,65 ve 2,80 Å'dir. Nihai modelin FSC eğrisi Şekil 2.S17'de gösterilmiştir.
Tüm protein dizileri UniProtKB'den indirildi: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC'nin homolog modelini oluşturmak için SWISS-MODEL (45) kullanıldı; bu model RC-L, RC-M ve RC-H protein dizilerini içerir ve Rba. sphaeroides RC'nin kristal yapısı şablon olarak kullanıldı (PDB ID: 5LSE) (46). Oluşturulan modeli haritaya uydurmak için UCSF Chimera'daki “uyum haritası” aracını kullanın (47), protein yapısını iyileştirin ve kofaktör [4×BChl a (monomer kütüphanesi kalıntı adı = BCL), 2×BPh a (BPH), bir veya iki çeşit UQ10 (U10), bir hem olmayan demir (Fe) ve bir 3,4-dihidroheksakarbonilkolin (QAK)] eklemek için Coot'u (48) kullanın. QAK monomer kütüphanesinde mevcut olmadığından, PHENIX'teki (49) eLBOW aracı kullanılarak parametrelendirildi.
Ardından, LH1 alt birimi oluşturuldu. Başlangıçta, PHENIX'teki (49) otomatik yapılandırma aracı, harita ve LH1-α ve LH1-β protein dizilerini girdi olarak kullanarak LH1 dizisinin bir kısmını otomatik olarak oluşturmak için kullanıldı. En eksiksiz LH1 alt birimini seçin, çıkarın ve Coot'a yükleyin, içindeki eksik diziyi manuel olarak ekleyin ve iki BCl a (BCL) ve bir spirilloksantin (CRT) eklemeden önce tüm yapıyı manuel olarak iyileştirin [ilgili Rps'ye göre LH1 kompleksinin yoğunluğu ve bilinen karotenoid içeriği. Tür (17)]. Tam LH1 alt birimini kopyalayın ve UCSF Chimera "Yerleştirme Haritası Aracı"nı kullanarak LH1 yoğunluğunun bitişik modellenmemiş alanına yerleştirin ve ardından Coot'ta iyileştirin; tüm LH1 alt birimleri modellenene kadar işlemi tekrarlayın. RC-LH114-W yapısı için, Coot'ta tahsis edilmemiş yoğunluk çıkarılarak, protein USCF Chimera haritasındaki kalan protein olmayan bileşenlerden ayrılır ve başlangıç ​​modelini oluşturmak için Otomatik Oluşturma aracı kullanılır ve kalan alt birimler (protein-W) PHENIX'te (49) modellenir. Coot'ta (48) elde edilen modele eksik diziler eklenir ve ardından tüm alt birim manuel olarak iyileştirilir. Kalan tahsis edilmemiş yoğunluk, lipitlerin (PDB monomer kütüphanesi ID'si CDL = CDL, POPC = 6PL ve POPG = PGT), β-DDM deterjanının (LMT) ve UQ10 moleküllerinin (U10) kombinasyonuna uyar. Model istatistikleri ve uyumun görsel kalitesi daha fazla iyileştirilemeyene kadar, tam başlangıç ​​modelini mükemmelleştirmek için PHENIX optimizasyonu (49) ve Coot'ta (48) manuel optimizasyon kullanılır. Son olarak, yerel haritayı keskinleştirmek için LocScale (50) kullanın ve ardından tahsis edilmemiş yoğunluğun modellenmesi ve otomatik ve manuel optimizasyonun birkaç döngüsünü daha gerçekleştirin.
İlgili peptitler, kofaktörler ve diğer lipitler ve kinonlar, kendi yoğunlukları içinde yerleştirilmiş olarak Şekil 1 ve 2'de (S18 ila S23) gösterilmiştir. Son modelin istatistiksel bilgileri Tablo S1'de gösterilmiştir.
Aksi belirtilmedikçe, UV/Vis/NIR absorpsiyon spektrumları, 250 nm ile 1000 nm arasında 1 nm aralıklarla ve 0,1 s entegrasyon süresiyle bir Cary60 spektrofotometresi (Agilent, ABD) kullanılarak toplandı.
Numuneyi 2 mm yol uzunluğuna sahip bir kuvars küvette A880 değeri 1 olacak şekilde seyreltin ve 400 ile 1000 nm arasında absorbsiyon spektrumunu toplayın. Dairesel dikroik spektrumlar, Jasco 810 spektropolarimetre (Jasco, Japonya) ile 400 nm ile 950 nm arasında 1 nm aralıklarla ve 20 nm min-1 tarama hızıyla toplandı.
Molar yok olma katsayısı, çekirdek kompleksin yaklaşık 50'lik bir A880'e seyreltilmesiyle belirlenir. 10 μl hacmi 990 μl bağlama tamponunda veya metanolde seyreltin ve BChl bozunmasını en aza indirmek için absorpsiyon spektrumunu hemen toplayın. Her metanol numunesinin BChl içeriği, 771 nm'deki yok olma katsayısı olan 54,8 mM-1 cm-1 ile hesaplandı ve yok olma katsayısı belirlendi (51). Ölçülen BChl konsantrasyonunu 32'ye (RC-LH114-W) veya 36'ya (RC-LH116) bölerek çekirdek kompleks konsantrasyonunu belirleyin; bu daha sonra tamponda toplanan aynı numunenin absorpsiyon spektrumunu belirlemek için kullanılır. Yok olma katsayısı. paralel. Her numune için üç tekrarlı ölçüm yapıldı ve BChl Qy maksimumunun ortalama absorbansı hesaplama için kullanıldı. 878 nm'de ölçülen RC-LH114-W'nin sönüm katsayısı 3280±140 mM-1 cm-1 iken, 880 nm'de ölçülen RC-LH116'nın sönüm katsayısı 3800±30 mM-1 cm-1'dir.
UQ10, (52)'deki yönteme göre nicelendirildi. Kısaca, ters fazlı HPLC (RP-HPLC), Agilent 1200 HPLC sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Yaklaşık 0,02 nmol RC-LH116 veya RC-LH114-W, %0,02 (a/h) demir klorür içeren 50:50 metanol:kloroformun 50 μl'sinde çözün ve önceden dengelenmiş Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm'lik kolona 40°C'de 1 ml-1 min-1 hızında HPLC çözücüsünde (80:20 metanol:2-propanol) ×25 cm'lik bir kolona enjekte edin. HPLC çözücüsünde izokratik elüsyon yapılarak 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidler) ve 780 nm (BChl) dalga boylarında absorbans 1 saat boyunca izlendi. 25,5 dakikada 275 nm kromatogramındaki pik entegre edildi ve bu pik başka herhangi bir tespit edilebilir bileşik içermiyordu. Entegre alan, 0 ila 5,8 nmol aralığında saf standartların enjeksiyonundan hesaplanan kalibrasyon eğrisine (Şekil S14) referans alınarak ekstrakte edilen UQ10'un molar miktarını hesaplamak için kullanıldı. Her örnek üç tekrar halinde analiz edildi ve bildirilen hata, ortalamanın standart sapmasına karşılık gelmektedir.
Maksimum Qy absorbsiyonu 0,1 olan RC-LH1 kompleksi içeren bir çözelti, 30 μM indirgenmiş at kalbi sitokrom c2 (Merck, İngiltere) ve 0 ila 50 μM UQ2 (Merck, İngiltere) ile hazırlandı. Her UQ2 konsantrasyonunda üç adet 1 ml'lik örnek hazırlandı ve ölçümden önce karanlığa tam adaptasyon sağlamak için 4°C'de karanlıkta bir gece bekletildi. Çözelti, 300 nm alev/500 çizgi ızgarası, 1,24 mm giriş, 0,12 mm orta ve 0,6 mm çıkış yarıklarına sahip bir OLIS RSM1000 modüler spektrofotometreye yüklendi. Uyarı ışığını dışlamak için örnek fototüpünün ve referans fotomultiplikatör tüpünün girişine 600 nm'lik uzun geçiş filtresi yerleştirildi. Absorbans, 0,15 s'lik entegrasyon süresiyle 550 nm'de izlendi. Uyarıcı ışık, 880 nm M880F2 LED'den (Işık Yayan Diyot) (Thorlabs Ltd., İngiltere) bir fiber optik kablo aracılığıyla %90 yoğunlukta DC2200 kontrol cihazından (Thorlabs Ltd., İngiltere) yayılır ve ışık kaynağına 90° açıyla yönlendirilir. Ölçüm ışını, numune tarafından başlangıçta emilmeyen ışığı geri yansıtmak için aynaya karşıt olarak yönlendirilir. Aydınlatmadan 10 saniye önce absorbans izlenir ve 50 saniye boyunca aydınlatma yapılır. Daha sonra, kinololün sitokrom c23+'ü kendiliğinden ne ölçüde indirgediğini değerlendirmek için absorbans karanlıkta 60 saniye daha izlenir (ham veriler için Şekil S8'e bakınız).
Veriler, 0,5 ila 10 saniye (UQ2 konsantrasyonuna bağlı olarak) aralığında doğrusal bir başlangıç ​​hızı uydurularak ve her UQ2 konsantrasyonunda üç numunenin hızlarının ortalaması alınarak işlendi. İlgili yok olma katsayısı ile hesaplanan RC-LH1 konsantrasyonu, hızı katalitik verimliliğe dönüştürmek için kullanıldı, Origin Pro 2019'da (OriginLab, ABD) çizildi ve görünür Km ve Kcat değerlerini belirlemek için Michaelis-Menten modeline uyduruldu.
Geçici absorpsiyon ölçümleri için, RC-LH1 numunesi, 50 mM sodyum askorbat (Merck, ABD) ve 0,4 mM terbutin (Merck, ABD) içeren IMAC tamponunda ~2 μM'ye kadar seyreltildi. Askorbik asit, feda edilebilir bir elektron verici olarak kullanılırken, tert-butaklofen ise QB inhibitörü olarak kullanılarak ana RC vericisinin ölçüm süreci boyunca indirgenmiş (yani foto-oksitlenmemiş) kalması sağlandı. Yaklaşık 3 ml numune, lazer yolundaki numunenin uyarı darbeleri arasında karanlığa adaptasyon için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak amacıyla, 2 mm optik yol uzunluğuna sahip özel bir döner hücreye (yaklaşık 0,1 m çapında, 350 RPM) eklendi. Ti:Safir lazer sistemini (Spectra Physics, ABD) yükseltmek için ~100 fs'lik lazer darbeleri kullanın ve numuneyi 880 nm'de 1 kHz tekrarlama hızında (NIR için 20 nJ veya Görünür ışık için 100 nJ) uyarın. Veri toplamadan önce, numuneyi yaklaşık 30 dakika boyunca uyarıcı ışığa maruz bırakın. Maruz kalma, QA inaktivasyonuna neden olacaktır (muhtemelen QA'yı bir veya iki kez azaltacaktır). Ancak lütfen bu işlemin geri dönüşümlü olduğunu unutmayın, çünkü uzun bir karanlık adaptasyon döneminden sonra RC yavaşça QA aktivitesine geri dönecektir. Geçici spektrumları -10 ila 7000 ps gecikme süresiyle ölçmek için bir Helios spektrometresi (Ultrafast Systems, ABD) kullanıldı. Veri setlerini gruplandırmayı kaldırmak, ardından birleştirmek ve standartlaştırmak için Surface Xplorer yazılımını (Ultrafast Systems, ABD) kullanın. Bozunmaya ilişkin diferansiyel spektrumları elde etmek için birleştirilmiş veri setini kullanmak üzere CarpetView yazılım paketini (Light Conversion Ltd., Litvanya) kullanın veya Origin'de (OriginLab, ABD) tek dalga boylu spektral evrimi uydurmak için birden fazla üssü cihaz yanıtıyla birleştiren bir fonksiyon kullanın.
Yukarıda belirtildiği gibi (53), hem RC hem de çevresel LH2 anteni eksik olan LH1 kompleksi içeren bir fotosentetik film hazırlandı. Membran 20 mM tris (pH 8.0) içinde seyreltildi ve daha sonra 2 mm optik yol uzunluğuna sahip bir kuvars küvete yüklendi. Numuneyi 540 nm'de -10 ila 7000 ps gecikme süresiyle uyarmak için 30 nJ'lik bir lazer darbesi kullanıldı. Veri seti, Rps. pal numunesi için açıklanan şekilde işlendi.
Membran, 4°C'de 2 saat boyunca 150.000 RCF'de santrifüj edilerek çökeltildi ve daha sonra 880 nm'deki absorbansı 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ve 200 mM NaCl içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Membran, 4°C'de karanlıkta 1 saat boyunca %2 (a/h) β-DDM içinde yavaşça karıştırılarak çözüldü. Numune, 2,5 mg ml-1 protein konsantrasyonuna (Bio-Rad analizi) kadar 100 mM trietilamonyum karbonat (pH 8.0) (TEAB; Merck, İngiltere) içinde seyreltildi. Daha sonraki işlemler, daha önce yayınlanan yöntemden (54) yola çıkarak, 50 μg proteinin %1 (a/h) sodyum laurat (Merck, İngiltere) içeren toplam 50 μl TEAB içine seyreltilmesiyle başlayarak gerçekleştirildi. 60 saniye ultrasonik işlemden sonra, 37°C'de 30 dakika boyunca 5 mM tris(2-karboksietil)fosfin (Merck, İngiltere) ile indirgendi. S-alkilasyon için, numune 10 mM metil S-metiltiyometansülfonat (Merck, İngiltere) ile inkübe edildi ve 200 mM izopropanol stok çözeltisinden oda sıcaklığında 10 dakika süreyle eklendi. Proteolitik sindirim, 2 μg tripsin/endoproteinaz Lys-C karışımı (Promega, İngiltere) eklenerek gerçekleştirildi ve 37°C'de 3 saat inkübe edildi. Laurat yüzey aktif maddesi, 50 μl etil asetat ve 10 μl %10 (v/v) LC sınıfı trifloroasetik asit (TFA; Thermo Fisher Scientific, İngiltere) eklenerek ve 60 saniye boyunca vorteksleme yapılarak ekstrakte edildi. Faz ayrımı, 5 dakika boyunca 15.700 RCF'de santrifüjleme ile sağlandı. Üreticinin protokolüne göre, peptidi içeren alt fazı dikkatlice aspire etmek ve tuzdan arındırmak için bir C18 spin kolonu (Thermo Fisher Scientific, İngiltere) kullanıldı. Vakumlu santrifüjleme ile kurutulduktan sonra, numune %0,5 TFA ve %3 asetonitril içinde çözüldü ve 500 ng'lık kısım, daha önce ayrıntılı olarak açıklanan sistem parametreleri kullanılarak kütle spektrometresi ile birleştirilmiş nanoflow RP kromatografisi ile analiz edildi.
Rps. palustris proteom veritabanında (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) protein tanımlama ve nicelendirme için MaxQuant v.1.5.3.30 (56) kullanın. Kütle spektrometrisi proteomik verileri, PRIDE ortak deposu (http://proteomecentral.proteomexchange.org) aracılığıyla ProteomeXchange Alliance'a PXD020402 veri seti tanımlayıcısı altında yüklenmiştir.
Elektrospray iyonizasyon kütle spektrometresi ile birleştirilmiş RPLC ile analiz için, RC-LH1 kompleksi vahşi tip Rps'den hazırlandı. Daha önce yayınlanan yöntemi (16) kullanarak, palustris hücrelerinde üretilen protein konsantrasyonu 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl ve %0,03 (a/h) β- (Bio-Rad analizi) DDM'de 2 mg ml-1 idi. Üreticinin protokolüne göre, çökeltme yöntemiyle 10 μg proteini çıkarmak için 2D saflaştırma kiti (GE Healthcare, ABD) kullanıldı ve çökelti 20 μl %60 (h/h) formik asit (FA), %20 (h/h) asetonitril ve %20 (h/h) suda çözüldü. Beş mikrolitre, kütle spektrometresi (Maxis UHR-TOF, Bruker) ile birleştirilmiş RPLC (Dionex RSLC) ile analiz edildi. Ayırma işlemi için 60°C ve 100 μl/dak akış hızında, %85 (v/v) çözücü A [0,1% (v/v) FA ve 0,02% (v/v) TFA sulu çözeltisi] ile %85 (v/v) çözücü B [0,1% (v/v) FA ve 0,02% (v/v) %90 (v/v) asetonitril TFA içinde] arasında bir gradyan kullanılarak MabPac 1,2×100 mm kolon (Thermo Fisher Scientific, İngiltere) kullanıldı. Standart elektrosprey iyonizasyon kaynağı ve varsayılan parametreler kullanılarak 60 dakikadan fazla süreyle, kütle spektrometresi 100 ila 2750 m/z (kütle-yük oranı) aralığında değerler elde etti. ExPASy biyoinformatik kaynak portalının FindPept aracı (https://web.expasy.org/findpept/) yardımıyla kütle spektrumunu kompleksin alt birimlerine eşleştirin.
Hücreler 100 ml NF-düşük (10μMm-2 s-1), orta (30μMm-2 s-1) veya yüksek (300μMm-2 s-1) ışık altında 72 saat boyunca büyütüldü. M22 ortamı (amonyum sülfatın çıkarıldığı ve sodyum süksinatın sodyum asetat ile değiştirildiği M22 ortamı) 100 ml vidalı kapaklı bir şişede (23) kullanıldı. Beş 30 saniyelik döngüde, hücreleri parçalamak için 1:1 hacim oranında 0,1 mikron cam boncuklar boncuklandı ve 5 dakika boyunca buzda soğutuldu. Çözünmeyen madde, kırılmamış hücreler ve cam boncuklar, tezgah üstü bir mikro santrifüjde 10 dakika boyunca 16.000 RCF'de santrifüjlenerek uzaklaştırıldı. Membran, 20 mM tris-HCl (pH 8.0) içinde 100.000 RCF ile Ti 70.1 rotorunda, %40/%15 (a/a) sakaroz gradyanı kullanılarak 10 saat boyunca ayrıştırıldı.
Önceki çalışmamızda açıklandığı gibi, PufW üzerindeki His etiketinin immün tespiti (16). Kısaca, saflaştırılmış çekirdek kompleksi (11,8 nM) veya aynı konsantrasyonda RC içeren membran (oksidasyonla belirlenen, indirgenmiş fark spektrumunun çıkarılması ve boyanmış jel üzerindeki yükün eşleştirilmesiyle) iki kez seyreltilmiş 2x SDS yükleme tamponunda (Merck, İngiltere). Proteinler, bir replika %12 bis-tris NuPage jelinde (Thermo Fisher Scientific, İngiltere) ayrıştırıldı. RC-L alt birimini yüklemek ve görselleştirmek için jel Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, İngiltere) ile boyandı. İkinci jeldeki protein, immünolojik analiz için metanolle aktive edilmiş poliviniliden florür (PVDF) membranına (Thermo Fisher Scientific, İngiltere) aktarıldı. PVDF membranı, 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, %0,2 (v/v) Tween-20 ve %5 (a/h) yağsız süt tozu ile bloke edildikten sonra, anti-His birincil antikoru ile (antikor tamponu [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl ve %0,05 (v/v) Tween-20] 1:1000 oranında seyreltilmiş A190-114A, Bethyl Laboratories, ABD) 4 saat inkübe edildi. Antikor tamponunda 5 dakika boyunca 3 kez yıkandıktan sonra, membran, at kestanesi peroksidaz (Sigma-Aldrich, İngiltere) anti-fare ikincil antikoru (antikor tamponunda 1:10.000 oranında seyreltilmiş) ile birleştirildi. WESTAR ETA C 2.0 kemilüminesans substratı (Cyanagen, İtalya) ve Amersham Imager 600 (GE Healthcare, İngiltere) kullanılarak tespit için inkübe edildi (antikor tamponunda 3 yıkamadan sonra 5 dakika).
Her boyanmış jel veya immünolojik test şeridinin yoğunluk dağılımını çizerek, tepe noktasının altındaki alanı entegre ederek ve RC-L (boyanmış jel) ve Protein-W (immünolojik test) yoğunluk oranını hesaplayarak, ImageJ'de (57) görüntüyü işleyin. Bu oranlar, saf RC-LH114-W örneğinde RC-L'nin protein-W'ye oranının 1:1 olduğu varsayılarak ve tüm veri seti buna göre normalize edilerek molar oranlara dönüştürüldü.
Bu makaleye ait ek materyaller için lütfen şu adresi ziyaret edin: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Bu, Creative Commons Atıf Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir. Makale, orijinal çalışmanın doğru şekilde alıntılanması koşuluyla, herhangi bir ortamda sınırsız kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin vermektedir.
Not: Sizden yalnızca e-posta adresinizi istiyoruz, böylece sayfaya tavsiye ettiğiniz kişi e-postayı görmek istediğini ve bunun spam olmadığını anlasın. E-posta adreslerinizi hiçbir şekilde kaydetmeyeceğiz.
Bu soru, ziyaretçi olup olmadığınızı test etmek ve otomatik spam gönderimini önlemek için kullanılır.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaksiyon merkezindeki ışık kapanı 1 kompleksinin yüksek çözünürlüklü yapısı, kinon dinamikleri hakkında yeni bilgiler sağlamaktadır.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Reaksiyon merkezindeki ışık kapanı 1 kompleksinin yüksek çözünürlüklü yapısı, kinon dinamikleri hakkında yeni bilgiler sağlamaktadır.
©2021 Amerikan Bilimi İlerletme Derneği. her hakkı saklıdır. AAAS, HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ve COUNTER'ın ortağıdır. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.